鸡卵清蛋白基因调控序列调控人α1抗胰蛋白酶基因在CHO细胞中的

鸡卵清蛋白基因调控序列调控人α1抗胰蛋白酶基因在CHO细胞中的 璃卵清蛋白基因序列调控人口,抗，,蛋白肆鲞目在,,,细胞中妁 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 选 摘 要 人, ,抗胰蛋白酶(, ,,,)是哺乳动物衄液中一种重要的蛋白酶抑制荆，抑制人体内多种不同的丝氨酸蛋白酶免受弹性蛋白酶的水解。它是一种含有碳水化台物侧链的单链糖蛋白，分予量,,,,,(由,,,个,,组成，, ，,,基因全长,,(,,,定位于,,？,卜,,，含有,个非编码外显子，,个编码外显子和,个内禽子，, ，,,肝细胞中的片段全氏,,,,,,包括,,,,,?非编码区，,,,,,,编码区，一个终,,:密码子，,,,,,?非编码区放一一个,,,,(,)尾。随着对？ ,,,缺乏者基因缺陷特征的认识及基因序列的克隆，基因治疗已成为一种有前途的治，，措施，近年来对, ，,,的重组表达研究进腱很快，人致有原核生物细胞水?,，真核生物细胞水平及转基因动物三个阶段。 本研究采用,?,,,,方法确定鸡卵清蛋白基因转录起始点的位置，通过序列分析得出转录起始点为,，从而确定山核心启动子及上游调控区的位置。应川,,,技术特异性扩增家鸡卵清蛋白基因上游调控序列一,,,,,,,，,,,,,,片段和第一内含子，,,,,,，,,,,,,片段(长度分别为,(,,,和,(,,,，经,,,测序和克隆测序后， 酝槐涞募罨 行薷矗 ? 薷吹牧狡 畏直鹆 釉诖 新躺 獾白员ǜ婊 颍穑牵疲小 危苍靥迳稀, 梗穑牵疲校 危苍靥灞旧淼模茫停制舳 硬挥跋於约β亚宓鞍灼舳 拥难芯浚 淝腥ィ 菇 耍校?,妇。,,,,,和,， ,,，，,,,,,,两种表达载体，经测序羽,酶切鉴定这两种表达载体构建止确。 采用脂质体转染法分别将上述两种构建载体、,,,，。,,(,,性对照)质粒及,,月性对,,《《转染鸡原代输卵管上皮细胞和中国仓鼠卵巢细胞中。用荧光显微镜观测绿色荧光蛋白的表达。结果表明两种表达质粒在鸡原代输卵管上皮细胞和中国仓鼠卵巢细胞中都可以表达萤光蛋白基因。结果显示本文构建的卵清蛋白基因的,?调控区垌,第一内古子对基因的表达起到一定的涧控作川。 用人,,，,抗胰蛋自酶(,卜,，，?)基因的信号肽编码序列替换鸡卵清蛋白基洲的信号肚编码序列(构建了包括鸡卵消蛋白基因崩动,和外显于,，内禽予,兆约,(,,,片段以及人, ,抗胰蚩白酶全长;,,,序列和鸡卵清蛋白基因,?非编码区部分序列的表选载体,,,,,(,,口,,,，融合基因经脂质体转染至中国仓鼠卵巢细胞(,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,)中(通过,,,、,,，,,和,,,,,,,杂交鉴定，证明所构建的鸡卵清蛋白基因启动子能有效涮控, ,,,,基因在,,,,细胞中高效表达，井能保持?卜,，，的生物活性。为进一步研究转基，目鸡输卵管生物反应器高效表达人,卜,,提供了可行性。关键词,鸡卵清蛋向启动子;,,,(绿色荧光蛋白):脂质体转染;, ,抗胰蚩白酶;,,(，,, 碡即清蛋白基固序列调控人,,(,执腹蛋白葺基固在,,,?胞中的表速 ,,,,,,;, , ,,,,,,,,,,,,,(?，,,),, ,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,,，,,, ,,,,,,,,,,,,,,,;,, ,,,;,,,, ,,,,,,, ,, ,, ,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,，, ,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,;,,,,, ,,,,,,,,(，, ,,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,，,,;,,,,,, ,,,,,,,，,, ,,,,,,,,,,，;,,,,,,,,,,，,,,,,,,,，,,,,,,,,,,，,,, ,,,,,,,(, ，,, ,, , ,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,, ,,, ;,,,,,,, ,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,; ;,,,, ,,, ,,,，,,,, ,,,,, ;,,,,,,,,,,,,,,, ;,,,,,,,，,,,,,, ,, ,,,,,,, ,,,,;,,,, ,,,,,, ,, ,,，,,,皿, , ，,, ,,,, ,,, , ,,,, ,,,,(,,, ,, ;,,,,,,,,, ,,？,,(,，;,,,,,,, ,,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,,。,,, 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随着鸡卵清蛋自基因(,,,,,,,,, ,,,,)和鸡卵消蛋白,,,,(;,,;,,, ,,,,,,,,, ,,,,)序列的确立，鸡卵清蛋内基因的转录调控开始被广泛地研究。,;,,,,管报道了鸡卵消蛋闩基因,?侧翼区的序列;,,,(,,, ,,,,等分析了鸡卵清蚩白基因,?侧翼区的顺式调节成分和反式作用因子;,(,;,,,,等构建了卵清蛋白启动子调控人促红细胞生成索(,,,,)基因的质粒(通过电穿孔法将,,,,基因导入离体培养的鸡输卵管细胞年，,活体鸡的输卵管细胞(,,,,得到表达;宇丽等克隆了鸡卵清蛋白上游调控序列，并将氯霉素乙酰基转移酶 (,,,)基因与卵消蛋向基因上游调控序列融合，构建了表达载体(，,,将其转染鸡原代输卵管上皮细胞和鸡成纤维细胞，,,,表达量最高为,(,, ,玑。启动子上游的表达调控序列到底要多跃,目前还没有一个明确的规定(但在不同基因背景前提下，基因表达的效率差异较人。精细确定鸡的卵消蛋白基因上游调控关键序列的人小是高敢表达的舸提条件之一。由于鸡卵消蚩白基因的第一外显子不参与蛋白质的编码(，,:且平?第一内含子都在翻泽起始密码子,,,上游，第一外显子和第一内古子对卵清蛋向基因的表达调控有无影响，至今还米见报道。 , ,(抗胰蛋白酶(, ，,,,)是一种含有碳水化合物侧链的单链糖蚩白(分子量是,,,,,，由,,,个,,组成，, ,,,基冈全跃,,(,,,定位于,,？,,(,,，它含有,个?拼编码外显子。,个编码外显子和,个内含子，, ，,,的,,,,全长,,,,,,包括,,,,,?非编码区，,,,,,,编码睡，一个终，,密码于，,,,,,?非编码区及一个,,,,(,)垲。主要生理功能是抑制人体内多种不同的丝氨酸蛋白酶，保护肺泡和及其它组织中的弹性纤维免受弹性蛋白酶的水解。, ,,,,是血液中最主要的抗胰崔白酶。占血液胰蛋白酶抑制活性的,,,以上，能拈抗弹性酶、纤溶酶、胶原酶、凝血酶等。, ,,,,的遗传缺，辆或血中含量不足时，可导致肝，肺疾病，它的缺乏是造成痫变的基础，，;～,此补充, ,,,, ,,,丁以预防疾病的发生币，治疗疾痫，正常机体血浆内, ,(，,含量为,,,,,,，半衰期为,天，采用替代疗法需要人量, ,,,,，这样人的需求量只能靠基因一程技术才能满足。近年米, ,,,,的重组表达研究进展很快，人致有原核生物细胞水平。寅核生物细胞水平及转基因动物三个阶段，, ，,,的重组表达蛙早足在人肠杆菌中实现的，,,,,年,,;,,,, ,,,,,,,,等在大肠杆菌中高水平表达只有生物活性的人?，,,取得成功(在,,,,年,,,, , ,,,,,,等利川逆转录病毒作为载侔，,,,,年,,,,,;,,,;,,,;,,,,和,,,,年,,,,,, ,,,,等利,【，,腺病毒作为载体都表达山, ,,,，,,,,年英国科学家将人的,。(抗胰蛋白酶基因转入绵羊受精卵，成功地获得了,只转基因绵羊，其中,只母绵羊乳中都表达了人的,,((抗胰蛋内酶，而且从绵羊乳中纯化的?(抗胰蛋白酶与人血浆中的?(抗胰蛋白酶具有相同的生物学活性。展近,,,,,等通过唾液酸脂球蛋白将,,，:,基因转染到动物体内，井得到,期稳定的表达。 近年来(生物学和分子生物学研究领域的成就促进了转基因动物生物反应器 的蓬勃发展。片;，转基因动物生物反应器生产药用蛋白是生物技术领域里的义一次革命，它以一个全新生产珍贵药用蛋白的模式区别于传统药物的生产。转基因动物生物反应器生产药,，;，,蛋自一般有两种技术路线。第一种是将目的基因在同源组纵中表达蛋白质;第二二种是将目的基因构建成杂合基因(转入动物胚胎(通过转基因动物的分泌器官收集并提纯药,,，;，蚩白。转基因动物分泌的蛋向经过后加,:酷如人体天然堑白的绡构，也有完全相似的生物活性。转 , 璃弁清蛋白基田序列调拉人,,批腹蛋由?鲞固在,,,,?胞中的袁逸基因动物表达重组蛋白多以乳腺、唾液腺和膀胱为靶位?在这些表达器官中，通过构建合适的载体(选择适当的启动子利调控序列可产生比正常水平高得多的重组蛋白。 动物组织特异性表达系统……一,;,;，于制作大规模生产基因制品的动物反应器 ,)哺乳动物乳腺特异性表达载体:拥有绵羊乳球蛋白启动子、山羊酪蛋自启动于、小鼠乳腺瘤病毒启动子，以及相配套的绝缘子序列和核基质绌台区序列。 ,)鸡输卵管特异性表达载体:拥有鸡,,消自蚩向启动子、溶苗酶启动子、相应的,,,,, ，高敏位点序列平?绝缘于序列。 这些载体和序列可以指导外源基闪在动物的乳汁或鸡蛋中赢表达，以丛纠人鲑生产有商业价值的目标基因产品的目的。 , 璃卵清蛋白基囡序列调拉人口,抗歧蛋白?，基固在,,，,细胞中的表选,(鸡卵清蛋白基因转录起始点的确定,(,材料,(,(,实验材料 两只雌性庄河人骨鸡(,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;)购自人连市金州区农场。,(,(,质粒和受体茁 ,,,,,,、,,,,,感受态细胞均购白宝生物，:糕(人连)有限公刷。,(,(,试剂 ,,,,,,,,,;,,,,,,(,,,,鼬,购白,,,,,,公司;,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,、凝胶回收试剂盒、,,,,,,,,,,,、质粒提取试剂盒购,, ,,,,,,公司。,(,(,引物 参考,,,,,,,登录号,,,,,,(,,,,,,,,, ,,,,)序列，殴汁引物(由宝生物，:程(人 连)有限公司合成。引物序列见表,,,。 表,(,引物序列 ,,,,, ,,, ,,,,,, ,,？,,,;, 引物名称 序列(,—?,?) ～～～竺～ (～,,竖～～～ ,,, ,,, ,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,，几,,,, ,,, ,,, ,,,, ,,,,,,?,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,,鼍,,, ,,,, ,,,?,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,, ,?,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, ,?,,,, ,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,啪 ,,,,,, ，,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,下,,,,,,(),(,方法 从鸡输卵管组织中提取总,,,。根据鸡卵消蛋向,,,,已知序列设计引物,,,,,,,,,和,,,,,, ,,,,(采用,,,,,,公司的,,,,,,试剂盒扩增片段，验证提取总,,,的质量。应用,?,,,, ,,,确定转录起始点的位置(按其说明,,操作)见豳,,，。茵先州碱性磷酸酶,，,切除总,,,中溉有的,?末稍带磷酸根的序列，如,,,,(,,,,和,术完全除去的,,,。然后用,,,,;;, ,,,,,,,,,,,,,,,酶切除,,,,,?帽子结构，但保留,?端磷酸 ,;,,根。利于,, ,,,连接酶将接头(,?,,,, ,,,,,,,)连接剑此位管上，,】,,,,,逆转 录酶合成,,,,第一链。,，,,, ,,,,第一链为模板，经外引物和内引物两次,,,扩增，使，,,,,,,,,凝胶回收试剂盒回收,次,,,产物利,次,,,产物，分别克隆至,,,,;,,,，拦,:,,培养基,,,过夜(提取质粒。对质粒,,,,,,,,,(外引物扩增的,,,片断)和,,,,,,,?， (内引物扩增的,,,片断)测序，分析测序结果。 坞卵清蛋白基同序列调拄人口,抗胰蛋白,，基目在;,,知鱼中的表迭 图,,,确定转录起始点的方 法示意图 ,,,(,,,,,,,,, ,, ,,,,,;,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,(,结果 用试剂盒提供的接头外侧引物(,,,,,,,,,,,,,,,,,,)和,裕樱矗埃?,,,,进行一次,,,扩增，所得到的,,,产物约,,,,,的条带,再以一次,,,产物为模板，用试剂盒提供的接头内侧引物(,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,)和,,,,,, ,,,,进行二次,,,扩增，得到的,,,产物约,,,,,，与我们预测的相符。结果见图,,,。 图,,,扩增转录起始点区段的电泳图 ,:,,,,, ,,,,,, ,,,,,, ,:一次,,,片段,约,,,,,) ,:二次,,,片断(约,,,,,) ,,,,?, ,,,,,,, ,,, ,,,;,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,;,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,, ,:,,,,, ,,,,,, ,,,,, ,:,,,,, ,,, ,,,,,,,, ,约,,,,,) ,:,,;,,, ,,, ,,,, 璃卵清番由善嗣序列调拉,(,,抗反蛋白辞蓉码在,,,(约,,,,,) , ,,,,蛔胞中的泰遮 本研究从鸡输卵管组织提取总,,,，由于卵清蛋向的,,,,含量高，因此,，次,,,就扩增出清晰的目的条带。为了增加结果的可信度，本研究又以一次,,,的产物作模扳进行二次,,,扩增(图,(,)。从闰，(,可以看到，二,次,,,扩增的条带多，分析可能魁模扳燕多威是引物和模板的特异性不高，因此将二次,,,扩增的带全部同收，进行,,,测序，同时分别选择多个质粒克隆测序，测序结果如,生，卜,所示。 幽中逐一列出,?,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,序列、,?,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,序列、,?,,,,,,,,,,,序列、质粒,,,,,, ,,, ,和,,,,,, ,(, ,序列、,,,,,,,,, ,,,,,序列(,,,,,,,登录号:,,,,,,)、,,,,,,,,,,,,,序列(,,,,,,,登录号;,,,,,,)。从,笙， ,(,中看出。,?,,,,,,,,,,,的,?末端碱基足,，之币的碱基是,，两种质粒的序列除去,?,,,, ,,,,,,,已知序列之外紧跟其后的第一个碱基都是,，从而确定卵清蛋白的转录起始点是,。 真核生物的基因启动于是在基因转录起始位点十,及其,?上游近端人约,,,,,,,,,的一组具有独立功能的,,,序列，，,:在。,,,一,,处富食,,的典烈元仆,,,,盒。根据幽，,,确定了转录起始点为,(,,，,，在上游(,,处有,,,,结构。将序列输入，,,，—,，,,,,,,,,,,, ;,,,,,数据库分析(结果显示:(,,附近存在卵清蛋白启动子区(,,,,(,,,,,,,,,)，(,,,附近存在负调节元件(,,,,,,,,,,,,,,,)，(,,,附近存在雌激素依赖的应答元件, (,,,,(,)(一,,,附近存在雌激素依赖的应答元件,(,,,,(,)(这与,,,(,,, ,,,,〔,,等报道的结果是一致的。结果如图,,,所示。,(, 讨论 真核基因启动子是在基因转录起始点，,及其,?上游近端人约,,,,,,,,,以内的一组具有独立功能的,,,序列，每个元件长度约为,,,,,,(是决定,,,聚合酶，,转录起始点和转录频率关键元件“,。所以我们利,,,,帽子位点中,?端单核前酸连接一段已知序硎接头，通过序列分析可知转录起始点的位置。,,,,年,,,,,”?等确立的鸡卵清蛋冉,,,,帽子位点为,，在幽,,,中，,位置，而本实验结果证明转录起始点为,，往幽,,,中十,位置。,,,,,,,,等指山,,,,,,,,, ,,,,有三种不同的帽子结构，其中一种与我?,实验所证实的位点一致。转录起始点山现多种位点的现象，在,,,,,, ,,,,,,,文中也有报道。出现这种情况我们分析一方面可能烂物种差异所致，或者在,,,扩增、克隆时出现碱基突变利移码。为了保证实验结果的准确性和可信度，我们采,,商保真聚台酶扩增,,,产物”经过多个质粒测序得出上述结果。 , 坞卵清蛋由基因序列调拉人口,抗膻蛋白,，蠢因在,,,?胞中的表逮,?,?,,?吐,,，,,,?, ,;,,?,,口;口?,,?，?,，，; ”，,:,,,, ,?,，;,,,?,,,, ;,?;,,,?,,,, ，,,, ,,;,,,,，,,?宴„船，,?，„?, ,;,,?,,,;?，,岛??,矗„?;?;,,;叠,,,, ;,,,,,,,,,,,,,,,?,，冀??„,,,—,? ?，;,,,，,,:,,,,口;,,?;,，，争，,,，?，,阻，;，甜“,曲一， , ,，?;,,,,,,,,,, ,,,,;,,,,,,,，„峒， ?，?懈,直，?疆， ,，;， ?， ,;,,“,,;,，,,，?，辛，，;„?, ?;?;,,;矗,,?, ;,,,;,,,,，,,,,?,,?;?,,,?,,,—, , ,，;，,;,拍，，，口,,,,，,,, ,;;,,,，睇，,,;，，„;,;，，，，,，,„，;, ?，,，,,??，，蛐,,,???, ,,,,,,?口,，,,,?,且,:,,„??，?,?,?,, ,，,，,,,,,，，?,,,,，,,日,,,,,?,,，,,,,，口,,,，?,(?，,从,, ,，,，,,,，,，，?;,,,，,, ,,,,,,?口,，,,,，，,,,,，?，,，,“,,日“?,,。, ,„,?计,,?, ,?„钾,,,,?,„,计,„，, ,“,,?,,,，?,,,,,,,,, ,，,?,,,,，, ;，,?岫,,,;?,,,,?;?冉,，，?;，,,?，，,,,,?,,,,,,，,,,辅，,，—,, ,，,,,,,,„, ,?,,,尊,,,,?，,,,,掌,，々,??宣,，,,,?，,,,,尊,,,, ，?,,口,,;,?,;掌,;亭;?, ,“囊;?,,,„?,，,,,,,,,;,,,,, ,,拿 ,,,,,?, ,“,,?,,,，?,,,,寺, ;，,，,,,;，; ;”,的;,;;，,;奇吖寺;，, ;，，尊;，,,,，,,,,,,量,,, ?—,?,,媚，—冉? ,?,,,?,,,??,,?,,,,???钾,,?,,?詹 ，,;,，，,?,„，,??,,?,?, 口，,,,，,,,，??，口?,,，??钾,,，,,?, ?,,?,?，,，?;?,,,,;,，,,?,,,，，??? ,?,,?,,,??,,?,,,,???,,,,，,,?? ,,,?，,,，,?，,，,,,,,,, ,，,口,，,,;，，??晖,,，?，帅;,，,,?, ,,,“?,，口?，,，,;,,;?， 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