附录1 得克隆的提取方法
步骤
生物体处理
底泥处理
水样处理
具体操作
具体操作
具体操作
一,
研磨
研磨瓶中研磨后,称5g装入烧杯。
称10g底泥装入烧杯中
1.将分液漏斗,阀门,瓶塞用丙酮冲洗干净吹干后固定在铁架台上,
2.加入纯水观察是否漏水
3.将1000ml水样通过三角漏斗倒入分液漏斗中,每次加完后分液漏斗都需用丙酮冲洗,水样瓶中在加入100ml二氯甲烷冲洗后倒入分液漏斗中,
4.每个分液漏斗中用枪加入100μl代标
5.用力摇晃分液漏斗3-4min,定时拧开阀门放气,
6.摇晃后将漏斗放在铁架台上拧开瓶塞,等液面分层,
7.为每个分液漏斗准备250ml平底烧瓶,三角漏斗,漏斗里放置脱脂棉,无水硫酸钠,
8.液面分层后打开阀门让液体流入三角漏斗至分层处关闭阀门,
9.用少量正己烷冲洗三角漏斗,10.分液漏斗中加入50ml二氯甲烷,后摇晃3-4min,放置铁架台静置到分层,打开阀门让液体流入三角漏斗至分层处关闭阀门,11.重复步骤9和10.后用正己烷冲洗三角漏斗三次,带样品流经扣将平底烧瓶盖上瓶塞。
二,
去水
BLK,SPK瓶为空
同生物体
烧杯中加入无水硫酸钠搅拌均匀
三,
萃取(需测含水率)
平底烧瓶中加入200ml混合液
同生物体
将去水样品加入纸盒中,放入索式,索式中加入混合液至纸盒外沿下,烧杯中的残余样品用混合液冲洗后倒入索式
索式盖上铝箔静置30min
烧杯中加入沸石
所有样品均加入代标各100μl,SPK中单独加入PCB&OCP SPK std 100μl
标样用后缠生胶带放入冰柜中冷冻
将索式放在水浴锅60℃萃取24h后冷却至室温,循环水关闭
将索式内剩余液体倒入烧杯中(若液体偏少,也可用丙酮冲洗索式内壁残液)将瓶中沸石取出,盖上瓶塞
四,
旋蒸(置换出丙酮/二氯甲烷混合液)
事先将旋蒸仪调至2℃,水温能加热至28℃
同生物体
1.旋蒸至1ml
2.加入10ml正己烷,
3.旋蒸至1ml
旋蒸至1ml
加入10ml(或20ml)正己烷,继续旋蒸至1ml
再加入10ml(或20ml)正己烷,继续旋蒸至1ml
五,
去水
标记250ml平底烧瓶后加入三角漏斗,漏斗里放入棉花,无水硫酸钠
同生物体
无
将旋蒸后的样品直接倒在三角漏斗里,用正己烷反复冲洗烧瓶3遍(标记部分应始终朝上)及无水硫酸钠,待无液体流入烧瓶,轻磕漏斗下部使剩余液体进入盖紧瓶塞
六,旋蒸
样品旋蒸至1ml
同生物体
无
七,定容
将样品移入定容管中,正己烷定容到10ml
无
无
八,
留样
将试管在混匀机上混匀
无
(若留同生物体)
无
(若留同生物体)
取5ml移至标记好的留样瓶中,留样瓶用生胶带缠好
九,
测脂肪含量
给每个样品备一个小烧杯,上面盖铝箔,钻2-3个小孔无
无
烧杯在天平上称重
在剩余的5ml试管中搅匀(若不留样则为10ml)
用1ml枪头移取1ml样品至烧杯中,并立即称重
烧杯放纸箱中每三天称重一次,称3次
十,
磺化
支好250ml分液漏斗(阀门/瓶塞)
同生物体
无
(若水质不好可进行此操作)
分液漏斗中加入纯水后静置10min看是否漏水
将水排空
将第八步剩余样品(4ml或9ml)直接倒入分液漏斗中,用正己烷冲洗至20ml左右
量取5ml浓硫酸倒入分液漏斗中充分混匀(过程中需要开盖放弃),后加盖塞子(塞子用纯水冲洗),静置分液漏斗5-12h,直到液面出现分层,打开阀门使下部液体流入废液缸(此过程重复3次)
量取25ml纯水加入分液漏斗充分混匀,静置,待分层后将下部液体流入废液缸(此过程重复5次)
支好平底烧杯+三角漏斗(漏斗里放入棉花,无水硫酸钠)
打开分液漏斗阀门将剩余液体流入三角漏斗中,用正己烷反复冲洗三遍,待漏斗下部不再有液体流出后,轻磕其下部,使剩余液体流入三角瓶中,盖紧瓶塞
十一、旋蒸
样品旋蒸至1mL
同生物体
无
十二,
过柱
将柱子、活塞安装好
同生物体
同生物体
柱子底部加棉花,用玻璃棒压实
加无水硫酸钠1cm左右
加正己烷5ml,边加边用橡皮棒敲打柱子赶走气泡
用小烧杯称取5.5~5.7 g硅胶,加入正己烷用药匙搅匀
将烧杯中的硅胶倒入柱子中,残留硅胶用正己烷冲净
在柱子下放置废液瓶,打开活塞阀门接废液。当柱液面降到浑浊层5cm处即可。同时用正己烷冲洗内壁。
加入无水硫酸钠1cm
待液面降到表层时加入5ml混合液(HEX:DCM=1:1)冲洗柱子
待液面降至无水硫酸钠顶部时关闭阀门
用250ml平底烧瓶更换废液瓶
用移液管将旋蒸后的液体移到柱内,加入三次1ml混合液用于冲洗残液,同时打开阀门留液待液面降至无水硫酸钠顶部时加入50ml混合液进行淋洗,阀门流速不要过快
待液面降至无水硫酸钠顶部时全部打开阀门,待流干后即可
取下柱子,底部敲打洗瓶口是残液流入洗瓶口使残液流入洗瓶中
十三,旋蒸
样品旋蒸至1ml
同生物体
同生物体
十四,
氮吹
旋蒸后液体用吸管转移至浓缩瓶中,残留用正己烷1ml洗三次同生物体
同生物体
将1000ul枪头套在氮吹仪上(隔一套一),共六个
将浓缩瓶夹在氮吹仪底部弹簧上,枪头不要接触浓缩瓶中液面打开氮气罐阀门(开一半)
调节氮吹仪气杆上的阀门至适度
待吹至0.2~0.3ml时加入异辛烷1.5~2.0ml
加入内标100μl
在振荡器上搅匀
继续氮吹至1ml
用吸管移至色谱瓶中
色谱平用胶带缠好放入冷柜
1.、测含水率须在烘箱中至少7个小时。
2、代标需提前半个小时从冰箱拿出。
3、提前一天配置混合液(丙酮:二氯甲烷=1:1)。
3、每个索氏配一把镊子用丙酮冲洗好。
4、硅胶需提前在烘箱中烘干7小时,后按3.3%含水率加水,96.7g硅胶,3.3g水。
5、若过柱时硅胶不加水灭活,则需加入10g,若加水激活只需5.5g。
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