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两株自养型氨氧化细菌的分离鉴定及系统发育分析.doc

两株自养型氨氧化细菌的分离鉴定及系统发育分析

zhou晓慧
2017-11-11 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《两株自养型氨氧化细菌的分离鉴定及系统发育分析doc》,可适用于综合领域

两株自养型氨氧化细菌的分离鉴定及系统发育分析、两株自养型氨氧化细菌的分离鉴定及系统发育分析*窦立军蒋进元黄永亨周岳溪崔俊涛李越(吉林农业大学资源与环境学院吉林长春(中国环境科学研究院水污染控制技术研究中心北京(威远县水产渔政局四川威远:、摘要以水产养殖废水处理工程的生物膜为菌源采用传统的富集分离纯化等微生物学手段筛选出株自养型氨氧化PA,PdPA,PA,A,菌和量检测结果表明菌株和细并将其转接至液体分离培养基中培养定的氨氮,,率均到对去除可达以上株菌的形态特征与生理生化性质分析结果表明株菌与假单胞菌属成员相似进一SrDNAGenBankMEGA步测定株菌的基因序列测序结果提交至进行同源性检索分析并通过软件进行比对和,析结果显示株菌均属于假单胞菌属与门多萨假单胞菌的同源性最高达以上系统发育分:关键词氨氧化细菌富集分离克系统发育:隆文章编号::(),,GA,中图分类号文献标志码SeparationIdentificationandPhylogeneticAnalysisofTwoStrainsofAutotrophicAmmoniaOxidizingBacteriaDOULijunJIANGJinyuanHUANGYonghengZHOUYuexiCUIJuntaoLIYue(CoegeofResourcesanEdnvronmentJnAgrcuturaUnverstyChangchunChnalliiliilliii(ResearchCenterofWatPeorllutionControlTechnologyChineseResearchAcademyEofnvironmentalSciencesBeijingChina(BureauofAquaticProductsandisFheriesAdministrationinWeiyuanCountyWeiyuanChinaAbstract:TwostrainsofautotrophicAmmoniaOxidizingBacteria(AOB)A,PandA,Pwereisolatedfromtheibofilmofanaquaculturewastewatertreatmentlanptusingtraditionalmicrobiologymeansincludingenrichmentisolationandpurificationtransferredtoliquidseparationmediumandculturedfordays,QuantitativetestresultsindicatedthattheammonianitrogenconversationrateofthetwostrainsA,PandA,Pcouldbothreachabove,ThemorphologicalcharacteristicsandphysiologicalandbiochemicalpropertiesofthetwostrainswereprimarilyanalyzedandidentifiedasapseciesofAOB,AblasthomologysearchwasdonwiethgenesequencesthrougPhCRamplificationofSrDNAcloning,SequencewseresubmittedtoGenBankandcombinedwithcomparativeandphylogeneticanalysisthroughMEGAsoftwarethetwostrainswerefnaydetermnedtobeongtothegenusoPfseudomonasandassgnedthePseudomonassp,TherhomoogytoilliliilPseudomonasmendocnawasashghas,iiKeywords:ammoniaoxidizingbacteriaenrichmentseparationcloningphylogeneticanalysis题生物脱氮技术作为去除废水中氮素污染的水体富营养化是水环境面临的主要污染问最有效方法而成为水处理领域的一个研究热:,,,:,收稿日期修订日期(点生:基金项目,,)AAZ)((国家高技术研究发展计划项目物脱氮由硝化作用和反硝化作用共同完成:作者简介()窦立军男吉林舒兰:,硝化作用分为个阶段第一阶段为亚硝化阶,人AOB)NHNNON把氧化为第二阶段由硝doulijunduotom(com(段由*(,)蒋元男四川内江副研究主要责任作者进人员NtrteoxdzngBacteraNOB)(iiiiii化细菌简称把stgercomIi从事水污染控制技术研究(AmmoniaOxidizingBacteria氨氧,化细菌,,简称NNONNO氧化为氨氧化细菌是革兰,(:、第期窦立军等两株自养型氨氧化细菌的分离鉴定及系统发育分析,,氏阴性专性化能自养细菌以氧化铵盐来满足:mL硅胶平板分离培养基将水玻璃其能量需求喜欢微碱性的环境生长极为缓,,g(mL硅酸钠加入到蒸馏水中搅拌溶慢因此成为污水生物脱氮的限制性因)mL(mL解和稀酸液超纯水中加入(素虽mLmL相对密度为的浓硫酸超纯水中、然氨氧化细菌在自然界分布广泛如在海洋淡水、、加入湖泊沉积物土壤及废水处理器等环境中皆有氨,,,氧化细菌的研究报道但是由于氨氧化细菌mL)相对密度为的浓盐酸二者混合均匀在一般的自然土壤和污水处理系统中的含量较置于小烧杯中快速搅拌混匀倒入培养皿中min,,AgNO浸洗次每次的用低具有生长在固体表面上的习性在液体培养((,静置凝固将凝固后的硅胶板放入水槽中用自基中主要附着在固体颗粒和器壁上粘连在一起Cl溶液检查去除效果如呈白色则继续冲在实验室对氨氧化细菌的分离通常比较困难以来水(洗当致有关它们的细菌学和生物化学的研究工作进,Cl除去之后硅胶板再用冷却开水浸洗次展缓()无菌水或蒸馏水清洗次倒置过夜晾慢因此分离鉴定氨氧化细菌进一步深入研,,(干在每(究氨氧化细菌的作用机理对有效利用氨氧化细mL一硅胶板表层加入氨氧化细菌分离培养液菌促进生物脱氮技术的应用与发展减轻水环,,h然后放入烘箱中维持至境中的氮素污染和实现废水的达标排放等具有表层无营养液流动然后与培养皿盖子一同在紫非常外重要的意,,min(灯下照射即可(,义生理生化测定试剂LB:g培养基胰化蛋白胨酵母提取物:水产养殖废水属于低碳高氨氮废水脱氮试剂酒精生理盐水二甲苯草酸铵结晶gNaClg(LpH蒸馏水是水产养殖废水处理需要关注的重点采用较紫染色液卢戈氏碘液番红复染液蛋白胨葡萄多的糖牛肉膏明胶可溶性淀粉甲基红碘琼,,(方法是好氧生物膜法该研究采用水产养殖脂硫代硫酸钠醋酸铅吲哚试剂溴甲酚紫废KNONHHPOKHPO过氧化氢柠檬酸钠溴麝水处理设施生物膜作为菌源通过连续个月(香草酚蓝:g的富集培养淘汰杂菌从而使氨氧化细菌成为格里斯试剂甲液对氨基苯甲酸醋()mL(优势酸棕色瓶保存格里斯试剂:,g)mL(菌群然后采用硅胶平板和琼脂平板进行分离培乙液α萘胺醋酸蒸材料与方法,,mL(养采用传统微生物学方法和现代分子生物学馏水棕色瓶保存使用前将甲液和乙液,菌株来源(等体积混合即可新型手段对分离出的氨氧化细菌菌株进行鉴采自某水产养殖废水处理设施的生物膜处,,,定结果表明分离出的株菌均属于假单孢菌菌种的富集及分离培养,理系统(属同源性高达富集培养,培养基mL将菌源进行驯化之后取污泥置于装:(NH)SOgKHPO富集培养基rmni有玻璃珠的锥形瓶中在的条gCaClHOgMgSOHOg甲酚mni件下空气浴恒温振荡培养箱振荡使污泥mgFeEDTAmgLpH红蒸馏水为充:,分打散污泥颗粒或菌胶团中的活菌释放出:(NH)SOgKHPO分离培养基,来打gNaHPOgMnSOHOgMgSO()散后的污泥按体积比加入到盛有氨氧HOgCaCOgLpH蒸馏水为化细菌富集培养液的无菌锥形瓶中置于,(,恒温振荡培养箱中黑暗培养在富集培养过程:琼脂平板分离培养基以质量分数为,中用格的NNO色出现和红色的深浅可以判断是否有)生(NNO琼脂做平板分离支持物里斯试剂检测的生成情况格里斯试剂),,卷第环境科学研究NHminsmin((成及其含量的大小同时测定ρ和退火延伸个,,,N)循min(PCR环后延伸产物经NON)((ρ衡量富集培养的氨氮转化率当氨琼氮marker(DL)脂糖凝胶电泳分析通过和比()去除率达到以上时按体积比吸取(较片段大小确定是否为目的片段富集后的菌液至盛有新鲜富集培养液的无菌锥形,,瓶中继续富集培养以此来不断淘汰其他杂菌克隆(分离纯化连续富集培养个月富集培养过程中设空白使用宝生物琼脂糖凝胶回收试剂盒对片段大(对照mL吸取红色较深的富集培养液采用涂kbpPCR小为左右的产物进行片段回布法均匀涂布在硅胶平板上恒温黑暗培,收在养LPCRLLμ管中加入μ胶回收的产物和μ,(周观察菌落生长状况长出针尖大小pEASYblunt载体轻弹混匀室温反应“的菌落后挑取单菌落到琼脂平板上采用十min,L将上述反应产物转至μ大肠杆菌字交叉TransT感受”,划线法进行平板分离培养恒温黑暗min态细胞中轻弹混匀冰浴热激培养,、分离菌株的形态结构观察革兰氏染色和sminLLB立刻置于冰上然后加入μ培养生:d观察菌落生长情况重复划线分离基理生化试验,次(Amp)rmin不含中孵育肉眼和光学显微镜观察琼脂糖平板上生长,分离培养过程中设空白对照《(菌落形态特征参照伯杰细菌鉴定手册第min,取的八,,LLB(Amp)μ菌液均匀涂布在平板含上)》,版进行表观形态鉴定CAGGAAACAGCTATGACCPCR产物经琼,,《》h参照微生物学试验对分离菌株进行革(倒置培养挑取平板上的白色菌落于Marker(DL)脂糖凝胶电泳分析通过和比:兰氏染色试验和相应的生理生化试验淀粉水LLB(Amp)μ的培养基含中较、、、解试验靛基质和硫化氢试验糖发酵试验硝(片段大小确定是否克隆成功克隆成功的样品rminhPCR培养对菌液扩增进行重组子阳、、、酸盐还原试验明胶液化试验接触酶试验柠、送北京市三博远志生物有限公司进行正反链,MFMR性检测重组子阳性检测采用和引、)(V,P,)、檬酸盐利用试验伏普试验试验MFMR,双向测序测序引物为和甲基红试验物,,系统发育(M,R,),试验和需氧性试验MFTGTAAAACGACGGCCAGTMR为为SrDNAPCR,、的扩增克隆和系统发育分析分析BLAST将测序所得到的基因组序列经程序与TIANampBacteriaDNAKit采用试剂盒提取GenBank(http:核酸数据库DNASrDNA株具有氨氧化作用菌株的用作扩www,ncbi,nlm,govBlast)进行比对分析(增的模板从中挑选一部分相似性较高的菌种以及一些常见的氨氧化细菌作系统发育分析及同源性比,PCR扩增MEGA对用软件中的邻接法,PrimerPremier使用软件设计引物扩增(NeighborJoining)构建系统发育,分离菌株的氨氮转化率检测kbp(F'片段的大小为左右正向引物为,树对分离得到的初步确定为氨氧化细菌的菌株,AGAGTTTGATCCTCAG,'R反向引物(进行氨氮转化率检测挑取菌株至氨氧化细菌为液PCR',GCTTACCTTACGACT,T'()生工生物技术有限公司北京合成引部物序合列由上,、d体分离培养基中恒温黑暗培养测(成NHN)NON)TN)(((ρρ和ρ的变化情海BufferTM定((L):×PrimeSTAR况反应体系μ组成,主要检测指标的测定方法(Mgpus)lMixture(mmolL)μLdNTPNHN)(ρ采用紫外可见光分光光度计LDNAL(pmoL)μ模板μ正反向引物各(棱TM,LPrimesSTARN)NON)((HSDNAPoymerase(lμ光测定ρ采用离子色谱仪器型UL)LL(DIONEXIC,μμ灭菌超纯水μ阴离子分离柱号LonPadPCRmin:反应条件预变性变AS,HCECD,电导检测淋洗器液性:、第期窦立军等两株自养型氨氧化细菌的分离鉴定及系统发育分析mmolLNaOH(m水样用孔径为μ的混色针尖大小的菌(合纤落、分离菌株的形态观察革兰氏染色和生理mL)维滤膜进行过滤进样量为法测定生SHIMADZU(采用总有机碳分析仪仪器型TN)(ρ化试验号TOC,VTNM,总氮附件型号载气高纯CPH通过对富集培养个月后的菌液连续代空“”十字划线法的平板纯化分离培养结合菌kPamL气载气压力载气流速落形min(m、水样用孔径为μ的混合纤维滤膜态观察革兰氏染色和相应的生理生化试验结,,min)进行过滤加入过硫酸钾消解测《()》果参照伯杰细菌鉴定手册第八版初步结果与讨论,,(定确定,氨氧化细菌的富集培养及分离培养活性污泥中分离出的株菌属于假单胞菌属命氨氧化细菌的富集培养A,PA,P,名为和经过连续个月的富集培养反复更新富A,PA,P菌株和的形态为针尖大集培养基不断淘汰杂菌使氨氧化细菌成为优,,,小圆形表面湿润菌落颜色呈黄色革兰氏染aWGPS的形态一艳分离得到的氨氧化细菌NNO势菌群同时每天用格里斯试剂定性检测(致色为阴性光学显微镜观察菌体形态为杆的A(PA(P,菌株和的生理生化试验结状结果与王((生成情况随着时间推移红色逐渐加深在(、)、果见表其中革兰氏染色伏普试验淀第个月时接入新鲜富集培养基的富集培养液、,,粉水解酶试验硫化氢试验以及明胶液化试验:的格里斯试剂检测结果为第天略微呈现粉红琼芳等分离得到的氨氧化细菌不一致其余试的结果与罗色第(验结果均一致,天颜色没有明显的变化第天颜色变为表菌株生理生化试验,,红色第天红色明显加深第天TablePhysiologicalandbiochemicalexperimentsofstrains呈现玫瑰红色而空白对照格里斯试剂检测结(P(PAA试验项目,,革兰氏染色(果一直不呈红色与此同时进行的富集培养的除率达到以上大部分NHN转化为,伏普试氨氧化效果定量检测结果如图所示第天,NON自养型氨氧化细菌的富集培养取得预期验甲基红试时氨氮去验(效果硝酸盐还原试验柠檬酸盐利用试验接触酶试验,,淀粉酶水解试验,,靛基质试验硫化氢试验需氧性试验,,产酸不产气产酸不产气明胶液化试验糖酵解试验“”“)”:注表示阳性,表示阴性,SrDNAPCR、、的扩增克隆测序和系统发育分析A,PA,PSrDNAPCR菌株和的的图富集菌液的氨氧化作用,产物的琼脂糖凝胶电泳图如图所示由图可Fig,Ammoniumoxidationofkbp,知所需目的片段大小为左右将片enrchmentcuturebacterailikbpPCR段大小为左右的产物切胶回收PCRpEASYblunt回收的产物与载体连接后转化氨氧化细菌的分离培养TransTAmp至大肠杆菌感受态细胞中用含的,经过周硅胶平板分离培养平板上长LBh平板进行筛选倒置培养挑取白色菌落出至含有(若干株黄色针尖大小的菌落在琼脂平板上通过连续代单菌落纯化培养最后分离得到株黄卷第环境科学研究AmpminLBr的培养基中培养hPCR(对菌液扩增进行阳性检测由阳性检测的琼脂糖凝胶电泳图可知菌落的阳性率高达(A,PA,P图菌株和的系统发育树Fig,PhylogenetictreeofstrainA,PandA,PA,PA,PSrDNAPCR图和的的扩增FgAmpfcatonofA,Pandi,liiiA,P'sSrDNAbyPCR对阳性样品进行测序分析获得序列长度分bpbp别为和将测序结果提交GenBankBastA(Pl进行检索结果表明菌株A(PPseudomonas和分别与已报道的mendocina的,PA图菌株的氨氧化作用Pseudomonasalcaliphila序列相似性高达与Fg,Ammonumoxdatonofbacteraiiiii,的序列相似性为从中挑选一部分相似性A,P较高的菌种以及一些常见的氨氧化细菌作系统发育MEGA分析及同源性比对应用软件采用NeighborJoining法构建系统发育树确定其进化,地位结果如图所示从系统发育树图可知A,PA,PP,mendocina和均与已报道的P,olevorans的遗传距离最近与的遗传距离较NitrosococcusoceanusAcidovorax近与较远而与delafielii,的遗传距离最远A,P图菌株的氨氧化作用,分离菌株的氨氮转化率测Fig,Ammoniumoxidationofbacteria定PA(P,NHNA(出和在第天A,P,,A,PA,P从平板上挑取菌落和转接的转(氮转化率可达以上章正勇等报道的氨到分离培养基中进行氨氮转化率的检测氧,化率较低不足第天为菌株的对A,PA,P,和的氨氮转化率见图从(化细菌的氨氮转化率最高为由此可见经数NNH进入稳定生长期在第天几乎全部转图可以看该研究筛选得到的氨氧化细菌的氨氮转化率略生长期氨氮转化速率最高第和天细,NA(PA(PNO化为株有效菌株和(高一些菌的氨:、第期窦立军等两株自养型氨氧化细菌的分离鉴定及系统发育分析,J,(():(土壤A(PA(P和的氨氮转化速率见表,J,((周娟李君文郑金来亚硝酸细菌研究进展环境,,(由表(S):(科学与技术,可知在第天为菌株的对数生长A(PPA(和的氨氮转化速率分别达到了adsorptioninaEumWANGYZHANGYP(NH,,期mgOrthic和(Ld),AnthrosolatdifferentsolutionsoilratiosandtemperaturesA,PA,P表和的氨氮转化速率J,,(,,TableA(PandA(P'stheremovalrateofNHPedosphere():N(mg〔氨氮转化速率时间ROTTHAUWEJHWITZELKPLIESACKW(The(Ld)〕PPA(A(dammonamonooxygenasestructurageneamoaasfunactonaililmarker:moecuarfnescaeanayssofnaturaammonallillili,,oxidizingpopulations,J,(AppleEnvironMicrobiol():,,(,J,((李黄菌的分离研西郭爱莲振海淑菊硝化细究:():(北大学学报自然科学版结论,,(蒋进元宋宏宾周岳溪等三级生物膜工艺处理水产J,(():,殖循环水的研究环境科学研究养使用氨氧化细菌富集和分离培养基从水产养殖废水处理设施的生物膜中筛选出株自养型,,氨((陈梅娟蒋进元周岳溪等城市污水处理厂自养硝化(A(PA(P)氧化细菌和通过对分离的菌SrDNA,J,,、鉴及系统发育分菌的分离定析环境细,,PCRSrDNA():,株进行形态观察扩增克隆测序科学研究,,M,,许光辉郑洪元土壤微生物学分析方法手册北和同源性分析结合菌株的形态学和生理学特:,:京农业出版社BUCHANANREGLBBENSNE,伯杰细菌鉴定手册性确定这株菌均属于假单孢菌属,,,M,,《》中国科学院微生物研究所伯杰细菌鉴定手册翻(Pseudomonas)均与门多萨假单孢菌:,,:,译组版北京科学出版社,,(Pseudomonasmendocina),的相似性为氨王,验,M,,:肖明雨净微生物学试北京科学出版社NNH去除率均能达到以上氨氮转化速:氮的转化率测定结果表明株菌对mg率达,,(Ld),,efeences)(Rr:参考文献,,M,,:赵斌何绍江微生物学试验北京科学出版社(,,王刘汪苹斌军同步硝化反硝化处理氨氮废水过程中:气,J,(():态脱氮产物的研究环境科学研究,,,VANPARYSABSPIECKBEHEYLENAKetal,The,,(phylogenyofthegenusnitrobacterbasedonocmparativerepPROSSERIJ(Autotrophicnitrificationinbacteria,,PCRSrRNAandnitriteoxidoreductasegenesequence,,,J,(AdvancaMicrobiolPhysiol:nalysis,J,,SystematicandAppliedMicrobiology(():,,,,,(林褚海等土胡君利嫌贵燕壤氨氧化细菌的分离方,,M,,国家环境保护总局水和废水监测分析方法,J,(():(研究土壤法:,,:版北京中国环境科学出版社LIXinyuZHANGHuiwenWUMinnaetal,Impact,、、王艳耐高温高盐氨氧化细菌的分离筛选鉴定及氨氧ofacetochloronammoniaoxidizingbacteriainmicrocosm,,,,:,,D,,:化特性研究成都四川大学soils,罗琼芳徐恒张学俊等一株氨氧化菌的分离及其生,J,,JEnvironSci:,J,,:然科学学特性研究四川大学学报自版物,():(:)责任编辑郑朔方,,GERDIBRIGITTEKTUIJAVetal,Traceabilityofammoniaoxidizingbacteriaincomposttreatedsoils,,J,,SoBoogy,Bochemstry:,ililii,章正勇陈旭安立超氨氧化细菌富集培养的试验研,王一明彭光浩异养硝化微生物的分子生物学研究进究展,J,,():化学与生物工程,file:C|UsersAdministratorDesktop新建文本文档txt涵盖各行业最丰富完备的资料文献,最前瞻权威的行业动态,是专业人士的不二选择。file:C|UsersAdministratorDesktop新建文本文档txt::

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