[doc] 高糖对THP-1细胞及平滑肌细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体4
表
关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf
达的影响
高糖对THP-1细胞及平滑肌细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体4表达的影响
?
852?
[文章编号]1000—4718(2008)05—0852—04
中国病理生理杂志
ChineseJournalofPathophysiology2008,24(5):852—855
高糖对THP一1细胞及平滑肌细胞肿瘤坏死因子
相关凋亡诱导配体受体4表达的影响木
梁文昌,李连喜,杨志红,张烁,何敏,金惠铭,胡仁明
(复旦大学附属华山医院内分泌科,复旦大学内分泌糖尿病研究所,上海200040;
复旦大学上海医学院生理与病理生理学系,上海200032)
【摘要]目的:探讨高糖对单核/巨噬细胞系THP一1细胞及人主动脉平滑肌细胞肿瘤坏死因子相关凋亡
诱导配体受体4(TRAIL—R4)表达的影响.方法:用PMA孵育THP,1细胞,诱导其分化成为巨噬细胞.流式细
胞仪检测成功诱导的巨噬细胞粘附分子CD11b及CD1lc.采用不同糖浓度干预THP一1细胞,用Westernblotting
技术检测TRAIL—R4的表达.用25mmol/L高糖培养液在不同时点
孵育人主动脉平滑肌细胞,观察TRAIL—R4
蛋白表达的变化.用PKC激动剂干预THP一1细胞后,用
Westernblotting技术检测TRAIL—R4的表达.结果:佛
波酯(PMA)孵育THP一1细胞48h可诱导其分化成为巨噬细
胞.20mmol/L高糖明显上调人THP一1细胞TRAIL
—
R4的表达.高糖对人主动脉平滑肌细胞TRAIL—R4表达上调的影
响随着刺激时间的增加而增加.PKC激活后
THP一1细胞TRAIL—R4的表达明显上调.结论:高糖上调
TRAIL—R4蛋白表达,TRAIL—R4通过抑制巨噬细胞
及平滑肌细胞的凋亡促进动脉粥样硬化.
[关键词]受体,肿瘤坏死因子;巨噬细胞;肌,平滑,血管
【中图分类号】11363【文献标识码]A
Highglucoseup--regulatesTRAIL--R4expressioninTHP--1cellsand
smoothmusclecells
LEONGMan—cheong.,LILian—X1
一,YANGZhi—hong.,ZHANGShuo.,HEMin.,JIN
Hui—ming2.
HURen一.ming.
(DepartmentofEndocrinology,HuashanHospital,InstituteofEndocrinolog
yandDiabetologyFudanUniversity,Shanghai
2O0O4O,China;DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,Shanghai
MedicalCollegeofFudanUniversity,Shanghai
200032,China.E—mail:renminghu@fudan.edu.ca)
relatedapoptosisi [ABSTRACT]AIM:ToevaluatetheexpressionofTNF—
nducingligandreceptor4(TRAIL—
R4)ofTHP一
1cellsandhumanaortaSmoothmusclecellsunderhighglucoseintervention.METHODS:Monoeyticcell
lineTHP一
1wasincubatedwithPMAtoinducetomaturemacrophage,AdhesionmoleculesCD11bandCD1lcwereas-
sessedbyFACS.TRAIL—R4levelsinTHP一
1cellstreatedwithdifferentglucoseconcentrationsweredeterminedby
Westernblotting.ThechangesofTRAIL—R4proteinexpressionswereobse
rvedatdifferenttimepointsinhumanaorta
smoothmusclecells.WesternblottingwasemployedtoevaluateTRAIL—R
4levelsaftertheinterventionofPKCactivator.
RESULTS:Incubationwith160nmol/LPMAinducedmaturemacrophages.TRAIL—R4expressionwasup—regulated
afterincubationwith20mmol/Lglucoseinmacrophages.TRAIL—R4Wase
levatedinatimecoursemannerunderhigh
出岛
selevelinhumanaortasmoothmusclecells.Moreover,activationofPKCinduc
edTRAIL—R4expressions.CON-
CLUSION:Up—regulatedTRAIL—R4proteinlevelsinducedbyhighglucoselevelsmightinhibitapoptosisofmonocytes
andsmoothmusclecellsandcontributetotheprogressionofatherosclerosis.
[KEYw0RDS]Receptors,tumournecrosisfactor;Macrophages;Muscle,s
mooth,vascular
糖尿病及其慢性并发症是常见的代谢性疾病之
一
,糖尿病大血管及微血管病变是糖尿病患者致死,
致残的主要原因,而高糖高脂是导致糖尿病血管病
变的主要因素.糖尿病患者的高血糖,高血脂可
导致内皮细胞损伤,单核细胞粘附,迁移,移行进入
血管壁并分化成为巨噬细胞.巨噬细胞一方面吞噬
脂质转变成泡沫细胞,同时表达,分泌多种细胞因
子.这些细胞因子一方面加剧了血管壁的慢性炎症
【收稿日期]2008—01—29【修回日期]2008—04—17
?【基金项目]国家863重大课题资助项目(No.2002BA711A05);上海
市科学技术委员会重大课题资助项目(No.04dz19504)
?通讯作者Tel:021—62481305;E—mail:renminghu@fudan.edu.cn
,
反应,同时也进一步加重了内皮细胞损伤,并促进血
管平滑肌细胞增殖及分泌细胞因子.血管平滑肌细
胞亦可吞噬脂质而转变成泡沫细胞,后者是糖尿病
动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的病理基础].
最近的研究显示,肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导
配体(TNF—relatedapoptosisinducingligand.TRAIL)
在血管生理及动脉粥样硬化的病理过程中发挥重要
作用.而TRAIL—R4是肿瘤坏死因子受体超家族
中的一员,它能够与TRAIL相互作用广泛调控细胞
凋亡,并可作为诱导受体中和TRAIL的生物学作
用J.本研究观察高糖对单核/巨噬细胞系THP一1
细胞和平滑肌细胞TRAIL—R4表达的影响,以更好
的了解糖尿病患者发生动脉粥样硬化的病理生理机
制.
材料和方法
1材料
THP一1细胞由中国科学院上海细胞生物学研
究所细胞库提供;人主动脉平滑肌细胞和231培养
液购自CascadeBiologics公司;RPMI一1640培养基,
购自Gibcol公司;胎牛血清(fetalbovineserllm,FBS)
购自Hyclone公司;牛血清白蛋白(BSA),佛波酯
(phorbolmyristateacetate,PMA)为Sigma公司产品.
CD1lb及CD11C购自上海晶美公司.
2方法
2.1细胞培养THP一1细胞培养用含有10%小
牛血清的RPMI一1640培养液,37.c,5%CO培养箱
中静置培养,培养液中加Hepes10mmoL/L和青霉
素,链霉素为1×10U/L,在每次实验前用160
nmol/LPMA孵育THP一1细胞48h,诱导其分化成巨
噬细胞.人主动脉平滑肌细胞用含有平滑肌生长补
充剂的231培养液培养,37?,5%CO培养箱中静置
培养.
2.2流式细胞仪检测CD11b及CD11C用160
nmol/LPMA诱导THP一1细胞48h后,胰酶消化贴
壁的THP一1细胞,分别做巨噬细胞表面分子的特殊
标记CD11b或CD11C,室温避光孵育30min,流式细
胞仪检测表达量.
2.3蛋白印迹验证TRAIL—R4的差异表达向细
胞内加入RIPA200L和PMSF2L,融化后吸人离
心管中.12000r/min4.c离心30min,吸取上清
液.分光光度计Bradford法进行蛋白定量,一2O?
保存.每次实验各取样品5Og蛋白进行12%SDS
—
PAGE电泳,100V30min;150V90min.转膜,
100V2h.5%脱脂奶粉封闭1h.TBST液10min
×3次洗膜.取兔抗人TRAIL—R4抗体(1:1500,
Calbiochem)或B—actin抗体(1:5000,SantaCruz)
与膜进行杂交,室温2h.TBST液洗膜10min×3
次.取辣根过氧化物酶(HRP)标记?抗(1:3000,
cellsignalingtechnology)与膜杂交,室温1h.TBST
液洗膜,10min×3次.ECL(上海普飞)显色5min.
然后依次进行曝光,显影,定影.TRAIL—R4表达以
TRAIL—R4/13一actin总灰度值表示.
3统计学处理
数据用均数?
标准
excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载
差(?s)表示,采用
SPSS15.0统计学软件进行数据处理,组间比较采用
方差
分析
定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析
.
结果
1THP一1细胞培养,诱导其分化成为巨噬细胞
用含有10%小牛血清的RPMI一1640培养液培
养THP一1细胞,待细胞进入对数生长期后,用160
nmol/LPMA孵育THP一1细胞48h后,THP一1细
胞从悬浮状态诱导成贴壁状态,细胞表面粘附分子
CD11b明显低表达,CD1lc呈相对高表达(图1),符
合巨噬细胞的特点o.
2高糖对单核/巨噬细胞系THP一1细胞TRAIL—
R4表达的影响
用不同糖浓度的培养液孵育THP一1细胞24h
后,抽取细胞总蛋白行Westernblotting检查可见2O
mmoL/L高糖能明显上调TRAIL—R4蛋白表达(图
2).
3高糖对人主动脉平滑肌细胞TRAIL—R4表达的
影响
用25mmoL/L高糖的培养液孵育人主动脉平滑
肌细胞,Westernblotting检测发现随着刺激时间的增
加,高糖(25mmol/L)对人主动脉平滑肌细胞TRAIL
—
R4表达的上调作用明显增加(图3).
4PKC激动剂对THP一1细胞TRAIL—R4蛋白
表达的影响
于THP一1细胞中加入不同浓度的PKC激动剂
干预24h后,Westernblotting检验发现TRAIL—R4
表达随PKC激动剂浓度增加而增加(图4).
讨论
TRAIL—R4是第四个被确认为TRAIL的受体.
其主要功能是通过竞争TRAIL与促凋亡受体TRAIL
—
R1,TRAIL—R2的结合从而抑制TRAIL的促凋亡
作用.生理情况下,TRAIL与TRAIL—R1或
TRAIL—R2结合后通过后者的死亡结构域募集
caspase一8及caspase一10的前体,活化的caspase一8
进一步切割caspase一3前体,生成有活性的caspase
一
3,从而触发外源性的凋亡通路.而TRAIL与
TRAIL—R4结合后,由于TRAIL—R4不具备完整的
死亡结构域而无法转导凋亡信号,从而抑制了细胞
凋亡].TRAIL不仅有着广泛的促凋亡活性J,它
?
854?
?
C
Q
>
In
N
0
THP-1f×200)
10.1011010
CDl1b
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C
U
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山
THP一1cellsstimulatedwithPMAfor48h(×200)
N
0
101010
CDl1C
Fig1Incubationwith160nmo~LPMAinducedmaturemacrophages,THP—lcellsbecameadherentafterinducedtomaturemacro—
phagebyincubationwith160nmo~LPMAfor48h.LowexpressionofCD1lb
andrelativehighexpressionofCD1lcwereob—
servedinTHP一1cells.whichwasinconcordwithmaturemacrophages.
图1PMA孵育THP一1细胞48h可诱导其分化成为巨噬细胞
A
TRAIL—R4
D—actin
Control2Q
Glucose(mmol/L)
A
TRA1L—R4
13-actin
Controll5mmo1/L20mmol/L
glucoseglucose
Fig2TheexpressionofTRIAL—R4inTHP一1cellsindifief—
entglucoseconcentrationsofcuhuralmedia.THP,1gj
cellswereincubatedwith20mmolfLglucosefor24h.
CellextractswereanalyzedforTRAIL—R4expressionby
Westernblotting,”p—regulationofTRAIL—R4wasob—
servedat20mmo~Lglucose.A:immunoblottingimage;
B:quantificationofimmunoblottingx4-s.n=3,P<
0.055control,
图2不同糖浓度对单核/巨噬细胞系THP一1细胞TRAIL图3
一
R4表达的影响
B2?5
C
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塞2.0
墨
1.5
.f1.0
复0.5
._
DDc0一??Q.I?Q寸.一,,
A
TRAIL—R4
13-actin
ControlQ!QQQ9
PMA(nmoi/L)
PMA(nmoi/L)
Fig4ActivationofPKCup—regulatedtheexpressionofTRAIL
—
R4inTHP—lceHs.THP—lcellswereincubated
withdifferentconcentrationsofPKCactivator(PMA)for
24h.TRAIL—R4expressionwasassessedbyWeslem
blotting.Up—regulationofTRAIL—R4wasfound.A:
Westernblottingimage.B:analysisofWesternblotting
from3experiments.面?s./1,:3.’P<O.05contro1.
圈4PKC激活后TRP一1细胞TRAIL—R4表达明显上调
还可以拮抗TNF—的促白细胞黏附作用,因此被
认为是抗炎因子?….研究显示TRAIL的表达与C
反应蛋白呈负相关,由于c反应蛋白与斑块的稳定
性与氧化应激密切相关,提示TRAIL有稳定斑块及
对动脉粥样硬化有保护作用.近来有研究发现1
型糖尿病患者外周血T细胞表达TRAIL—R4明显
高于对照组,由于TRAIL—R4有上述抑制细胞凋亡
的生理作用,提示TRAIL与TRAIL受体相互作用与
胰岛B细胞的凋亡有关.巨噬细胞的持续增殖
及平滑肌的增生是糖尿病大血管病变的重要病理生
理基础,本研究首次发现高糖干预情况下能上调
fnIP一1细胞及入主动脉平滑肌TRAIL—R4的表
达,且TRAIL—R4的上调随PKC激动剂浓度增加而
增强.提示THP一1细胞于高糖情况下凋亡减少,从
而间接促进增殖,加剧炎症反应的恶化.本研究显
示TRAIL—R4可能成为干预糖尿病血管并发症的
靶点之一.
高糖情况下PKC通路的激活是糖尿病最重要的
发病机制之一.PKC通路的激活不仅是糖尿病微血
管病变的主要因素,也在动脉粥样硬化中扮演重要
角色.由PKC激活介导的巨噬细胞增殖是糖尿病血
管并发症的重要病理生理过程,但其中巨噬细胞增
殖的靶点至今尚未明确?.本研究应用不同剂量
PKC受体激动剂PMA干预巨噬细胞后,发现TRAIL
—
R4表达上调,说明TRAIL—R4的表达受PKC调
控,由于TRAIL—R4具有抑制凋亡作用,因此提示
?
855?
在高糖激活PKC所导致的巨噬细胞和平滑肌细胞增
殖中TRAIL—R4扮演了重要角色,高糖刺激后巨噬
细胞和平滑肌细胞TRAIL—R4表达的上调对动脉
粥样硬化的发病可能起促进作用.
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