细说HEK293 细胞的传代、建库与高效表达的研究.doc

细说HEK293 细胞的传代、建库与高效表达的研究.doc 细说HEK293 细胞的传代、建库与高效表达的研究 HEK293 细胞是转染腺病毒EIA 基因的人肾上皮细胞系，由加拿大Graham 教授于1976 年用DNA 转染技术构建而成，用于特异性腺病毒和腺相关病毒的培养。HEK293 含有SV40 复制起始点与启动子区的质粒，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许腺病毒和其他血清型腺病毒在其上复制，目前常用于以腺病毒作为载体的相关生物药和疫苗的研究。腺病毒在生物医药和基因治疗中因其具有以下优点，被广泛用作于载体:外源基因容量大，最大承载可达37 kb;感染范围广，能将目的基因转移到分裂或静息的细胞中;安全性高，感染细胞时其DNA 不整合到宿主染色体中，潜在的致癌危险小;能同时表达多个基因，它是第1 个可以在同一细胞株或组织中用来 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 表达多个基因的表达系统。腺病毒粒子相对稳定，外源基因插入片段在病毒连续复制几个周期后仍保持不变;外源基因表达水平较高，病毒滴度高，易于制备和纯化。目前已经证实人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)与宫颈癌的发生有关，其中高危型HPV 病毒(HPV16 和HPV18)感染占宫颈癌病例的80%。对HPV 预防性的疫苗目前已经面世，HPV治疗性疫苗主要针对HPV16 和HPV18 的早期肿瘤抗原E6 和E7。笔者和合作单位联合研发的能高效表达HPV16-E6E7 融合蛋白的重组腺病毒，在HEK293 细胞上培养，以期获得能诱发强免疫应答的HPV16 型治疗性疫苗[6]。本研究按中国药典2010 版?部对疫苗研发用细胞基质的要求，对HEK293 细胞进行主库和工作库的建立，并能高效表达重组的HPV16-E6E7腺病毒，达到疫苗下一步研发的要求。 1 材料 1.1 细胞 HEK293 细胞(35 代)，购自美国ATCC(编号:CRL-1573)。 1.2 重组 HPV16-E6E7 腺病毒根据技术合作协议由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所田厚文教授研究团队提供的重组腺病毒rAd5-HPV16SmE7E6 株(12 代)。 1.3 试剂和耗材 DMEM 培养基(Gibco 公司);胎牛血清(Sigma公司);8% NaHCO3、3%谷氨酰胺、1%胰蛋白酶由本研究室制备。CF10 细胞培养用细胞工厂(NUNC);细胞培养瓶(美国CORNING);离心管(美国BECKMAN)。酶切反应中所用的限制性内切酶(美国NEB 公司);病毒基因提取盒(北京康为世纪生物科技公司)。 2 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 2.1 HEK293 细胞库的传代和建库 HEK293 细胞35 代1 支，将细胞放入40 ?水浴中融化，待完全融化后，以无菌操作法将细胞液转移至15 mL 离心管中，加入生长液6 mL 吹打分散细胞，分装至25 cm2 小方瓶内，37 ?+5% CO2培养。细胞培养2~3 d 长成单层后进行细胞传代，弃去细胞生长液， 0.25%胰酶消化液37 ?消化约1 min，细胞出现裂纹后弃去消化液，加入细胞生长液，按同样方法传3 个代次至38 代，建立细胞原始库;继续传2 代至40 代，建立细胞主库;主库细胞传3 代至43 代，建立细胞工作库。 2.2 细胞库的检验细胞库的检验 参照中国药典2010 版?部附录? A。其中无菌试验和支原体检测参照中国药典2010 版?部附录? B。 2.3 重组HPV16-E6E7 腺病毒滴度的测定 用组织培养半数感染量(TCID50)方法:细胞培养方法同上。将待测样品10 倍倍比稀释，选用10,4到10,11，8 个稀释度进行上样，每个稀释度10 个复孔，同时设2 个正常细胞对照孔。在37 ?，5%CO2 条件下培养48 h，弃去细胞生长液固定细胞，加腺病毒Hexon 单抗，37 ?水浴1 h，PBS 溶液洗3 遍;加酶标二抗，37 ?水浴1 h，PBS 溶液洗3遍，DAB 显色，15 min 后在显微镜下观察细胞，计数 出现褐色或黑色的细胞斑点数，计算TCID50结果。滴度T=101+d(s,0.5)，d= 稀释度10 log =1(对于10 倍的稀释度而言);s=阳性比率之和。 2.4 重组HPV16-E6E7 腺病毒插入目的基因和基因组酶切图谱鉴定 2.4.1 PCR 反应步骤 取0.01~1 μL 样品进行PCR 反应。样品包括阴性对照(不含重组基因的空腺病毒，Ad5 空)，阳性对照(rAd5HPV16SmE7E6)，2 个待测样品(主种子库MSB，工作种子库WSB)，空白对照(只有试剂不含任何样品)，共5 个样本。 2.4.2 目的基因PCR 扩增 扩增引物为mCMVup__ CAGTCTTCGGTCTGACCACCG，pE6dn GGCCGAATTCATCACAGCTGGGTCTCTCTTC。PCR 扩增程序，循环参数:94 ?预变性50 s，94 ?变性30 s，51 ?退火30 s，72 ?延伸1 min，35 个循环，72 ?延伸10 min，取5 μL PCR 反应溶液上1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物的大小;应该在800 bp 左右处出现清晰的目的条带。 2.4.3 酶切图谱反应步骤 取样品5 mL，置于30 kda 超滤管中，3 000 r?min,1 离心超滤浓缩，将供试品浓缩至0.2~0.6 mL，按基因组提取试剂盒提取病毒基因组，提取后的基因组用50 μL TE 液洗脱，所得基因液4 ?待用。在冰浴中，Buffer 2 μL，基因组DNA 0.5~1 μg，Xho?0.5 μL，BSA 0.2 μL，加H2O 至20 μL，混合液稍加离心。将配制好的酶切体系置于37 ?水浴中反应2 h 以上。直接取10 μL 酶切产物与Loading Buffer 混匀，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。 2.5 重组HPV16-E6E7 腺病毒全基因检测采用第2 代高通量测序法，委托北京诺赛基因组研究中心有限公司，分别对以HEK293 工作细胞库表达的重组HPV16-E6E7 腺病毒主种子库(14 代)、工作种子库(15 代)、工作种子库加1 代(16代)这3 个代次的病毒基因进行全基因测序。 3 结果 3.1 HEK293 细胞传代建库 3.1.1 HEK293 细胞生长 显微镜下观察HEK293细胞的生长状态，细胞呈圆形或卵圆形，胞质透明，大小均匀，有少许颗粒，呈致密生长，同上皮细胞形态，与ATCC 对HEK293 细胞的生长状态描述一致，结果见图1。细胞从贴壁培养第1 天至培养第15 天一直处于致密状态，符合对腺病毒的培养要求;根据镜下观察结果，最佳培养时间为细胞贴壁培养后第5 天和第10 天，培养第15天细胞有衰老现象，不利于腺病毒的培养。 3.1.2 HEK293 细胞建库 根据中国药典2010 年版?部“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规程”的要求[7]，建立将来为疫苗生产所需要的细胞库。细胞库的建立可为生物制品的生产提供已标定好的、细胞质量相同的及能持续稳定传代的细胞种子。根据以上要求，建立了HEK293细胞的原始细胞库，主细胞库和工作细胞库，不同细胞库之间的传代数，细胞浓度和装量均符合基质制备和检定规程。 3.1.3 HEK293 细胞检验 用于生物制品生产的细胞系均须通 过全面的检定，并经国家药品监督管理部门的批准。根据要求对HEK293 细胞系全面检定委托中国食品药品检定研究院进行，在此之前需要对建立好的细胞系进行无菌试验和支原体检测。这是细胞系质量检查中最常规和最基本的项目。无菌试验采用薄膜过滤法，用全封闭集菌培养器无菌培养，支原体检查培养用2 种培养基接种法。检定结果HEK293 原始细胞库、主细胞库、工作细胞库无菌试验和支原体检测均为阴性，符合细胞基质要求。 3.2 高效表达重组HPV16-E6E7 腺病毒的检定 3.2.1 高效表达重组HPV16-E6E7 腺病毒滴度的测定 用HEK293 工作细胞库的细胞对重组HPV16-E6E7 腺病毒的二级病毒种子进行培养和病毒滴度的检测，检测结果显示，重组腺病毒滴度分别为6.31×109 IU?mL,1 和3.98×109 IU?mL,1。根据笔者早期研究，重组HPV16-E6E7腺病毒对动物的免疫保护作用初步拟定的制剂剂量为1.0×107 IU?mL,1，据此推算建立的HEK293工作细胞库能高效表达重组HPV16-E6E7 腺病毒，并能达到制剂的要求。 3.2.2 重组HPV16-E6E7 腺病毒插入目的基因和基因组酶切图谱检定 用HEK293 工作细胞库的细胞对重组HPV16-E6E7 腺病毒的二级病毒种子培养的收获物进行插入目的基因与基因组酶切图谱检定，结果HPV16-E6E7-Ad5-2(P14) 和HPV16-E6E7-Ad5-3(P15)插入目的基因与rAd5-HPV16SmE7E6 株相同。HPV16-E6E7-Ad5-2(P14)和HPV16-E6E7-Ad5-3(P15)酶切图谱均有7 个DNA 片段，根据DNA Marker 判断，7 个DNA 片段大小分别接近:14 500，8 474，3 476，2 466，1 445，806，595 bp，与合作研究单位提供的重组腺病毒rAd5-HPV16SmE7E6 株相符合， 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 用HEK293 工作细胞库对重组腺病毒培养收获的目的蛋白表达及稳定性好。 3.2.3 重组HPV16-E6E7 腺病毒全基因检测 用HEK293 工作细胞库的细胞培养， 对重组HPV16-E6E7 腺病毒主种子库(14 代)、工作种子库(15 代)、工作库+1 代(16 代)3 个代次的病毒基因组全基因测序，用NCBI BLAST 比对，经比对，3个代次种子基因组序列与Gene Bank 中的基因组序列完全相符。 4 讨论 HEK293 细胞是用5 型腺病毒75 株系转化，含有Ad5E1 区的人胚肾亚三倍体细胞系，是一种E1 区缺陷互补细胞系。其他293 细胞的衍生细胞系如293A 倾向于形成单层细胞，适合于早期研究病毒数量的空斑试验;293S 主要用于悬浮细胞培养;293T 细胞表达E1A 蛋白，S40 大T 抗原，对含有S40 复制起始点与启动子区的质粒可以复制;293FT 细胞能制造高滴度的慢病毒。相比较各细胞特性，选择HEK293 作为本疫苗培养细胞是因为它最适于用作腺病毒的生长扩增。293 细胞的缺陷是生长过程中贴壁强度比较小，所以在实验过程中容易流失，从而影响实验结果。细胞培养的方式有3 种:贴壁培养、微载体培养和无血清悬浮培养。在建立细胞库的过程中，本实验使用贴壁培养方法。根据实际的操作经验，293 细胞在无Ca2+或含Ca2+的培养基中可同样生长，也可生长在血清浓度降低的培养基中，单层细胞在5%~10%FBS-DMEM 中能生长很好。一般来讲1?10 转代后，1 周可以长满。严禁过度生长，这点很重要，因为会导致细胞密度加大和堆积，影响病毒斑的形成，转染传代时也不易打散。 在细胞建库后传代检定工作中，将原始细胞库38 代传至40 代，主细胞库40 代传至44 代，工作细胞库43 代传至47 代，腺病毒培养过程中终未细胞传至65 代，并观察终未细胞加10 代至75 代，HEK293 细胞一直是贴壁依赖型呈上皮样细胞，表现出典型的腺病毒转化细胞的表型，细胞允许重组的腺病毒在其上增殖。根据文献 报道，HEK293细胞在传代120 次以后，其表型可能改变，生长状况不再完全是单层了，偶尔会形成局部的细胞成团聚集，应立即抛弃，重新引用新传代的细胞。 腺病毒作为载体目前已被广泛地用于基因治疗和疫苗领域，根据国外文献报道，多个应用于肿瘤疫苗的研究和临床试验正在不断进行中，如Lubaraff 等用腺病毒载体表达前列腺特异性抗原，用于治疗前列腺癌，已完成一期临床试验;Smith 等用新型腺病毒适应性免疫治疗方法治疗转移型EB 病毒相关的鼻咽癌。以此为发展目标，笔者和合作单位共同研发的以HPV16-E6E7为靶抗原，腺病毒5 型作为载体，构建成功的rAd5-HPV16SmE6E7 疫苗种子已完成。重组HPV16-E6E7 种子能否在HEK293 细胞上高效表达是下一步研发疫苗的关键。 腺病毒载体的安全性问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 主要在于在293 细胞复制过程中保留E1 序列具有复制成分的腺病毒(RCAs)的随机出现，由此在腺病毒载体的质量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 中有关RCAs 的检测控制在1 RCAs/3.0x1010VP;另外腺病毒残余基因的表达也会引起细胞毒性反应和宿主的免疫反应;腺病毒载体外源基因的增强和目的蛋白的过表达是否具有致瘤性还有待更多的研究。目前，近三分之一的基因治疗临床试验中采用腺病毒 载体，而其中5 型腺病毒的使用最为广泛，其安全性已得到了证实。 本次研究结果显示，经过HEK293 细胞传代培养的重组HPV16-E6E7 腺病毒种子滴度达到3.0×109 IU?mL,1 以上，表达的目的蛋白稳定，符合对疫苗研发用病毒种子的要求，同时通过中国食品药品研究院的全面检定，符合中国药典2010版?部对疫苗用细胞基质的要求，为下一步的中试研发提供了技术保障。