高分辨率熔解HRM简介
早在上世纪六十年代，双链DNA的熔解靠吸光度监测，数微克的DNA样品以每分钟0.1-1.0℃的速度缓缓加热，待直至数小时后完成熔解。随后出现的利用荧光检测互补双链DNA是一个更灵敏的方法，这种方法需要先进行PCR富集DNA产物，它的流行得益于1997年问世的实时定量PCR仪Light- Cycler®。毛细管进样和小样品体积保证了良好的温控效果，使得熔解速率大大加速到每秒钟0.1-1.0℃。
高分辨率熔解分析High Resolution Melting (HRM)于2003年发明，是一项近年来备受关注的创新的技术，实现了通过研究PCR产物依赖于序列的熔解温度而对PCR产物进行鉴定。可用于检测样品中存在的双链DNA的单核苷酸多态性（SNPs）基因变异（Mutation）、多态性（Polymorphisms）和
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观遗传学（Epigenetic）差异。
HRM分析技术的神奇之处在于它是基于对核酸双链高温熔解行为的实时监测，仅仅是在普通荧光PCR之后加一步闭管的熔解步骤，操作简便，样品可随着其本身的序列、长度、GC含量及双链互补程度不同而被区分开。因此，甚至是单个碱基如SNPs也可轻易被鉴定出。
原则上来说，HRM分析技术的发展得益于三项技术上的进步：
1. 1. 发现了新一代的对DNA无抑制作用的饱和染料（如LC Green Plus，Resolight等）；
2. 2. 高度精密的荧光监控光学系统的问世；
3. 3. 发明了能够对熔解状况进行细致分析的新算法。
高分辨率熔解分析最重要的应用是基因扫描，相比传统基因分型技术，HRM具有许多优势：
1. 1. 省钱—相比较测序和Taqman® SNP分型技术，HRM更适合于大规模基因分型项目；
2. 2. 快速—能够在更短时间内精确分型；
3. 3. 简单—易上手操作，可在高分辨率的荧光PCR仪上方便实现。
由于突变导致的突变样本熔解曲线相对于参考样本的变化是可以明显识别出来的。基于这个原理，高分辨率熔解曲线可以用来检测样本中的纯合和杂合型的等位基因突变。更重要的是，与纯合型DNA 不同，来自杂合型二倍体的杂合型DNA在更低的温度下就分离成单链，因而具有完全不同的峰形。由于序列的不同，在一定的状态下，不同的杂合子可以生成不同的可区分的熔解曲线峰。除了峰型的不同之外，熔解曲线沿温度坐标（x-轴）相对于“野生型”的位置也会不同。
在一个
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基因扫描实验中，样本DNA首先通过qPCR掺入饱和染料。然后进行熔解曲线程序运行，同时以高频率采集荧光信号值，最后利用专业基因扫描软件分3步进行数据分析：
1. 1. 归一化处理Normalization：所有样品的熔解前（起始荧光）和熔解后（最终的荧光）信号值设置统一，相对值范围为0%~100%；
2. 2. 温度平移Temperature Shifting：经归一化处理后熔解曲线的温度轴被平移到某个点，在这个点上，所有的双链DNA均被完全变性。此时，通过不同的熔解曲线峰型图谱，杂合的SNPs样品就能被轻易地与野生型区别开；
3. 3. 差异作图Difference Plot：所有曲线峰同时减去其中一条参考曲线可实现将差别进一步的放大。
HRM应用领域广泛，其中包括：
发现未知突变(基因扫描)
物种鉴定
筛选杂合性缺失
体细胞获得性突变率
DNA指纹
HLA分型
SNP基因分型
关联的病例对照研究
单倍体特征
群体中等位基因优势分析
DNA甲基化分析
鉴定候选易感基因
DNA图谱
基因分型
由于HRM方法的灵敏度高、特异性好、简便、低成本（无需合成荧光探针）、操作容易，已经被广泛应用于基因分型，对于同一扩增子内的不同杂合体，通过曲线形状的差异也能区分开。Reed和Wittwer表示为了增加灵敏度，扩增子长度适合控制在80~100bp，其中G突变成A是最容易被区分开的。研究者发现发现针对于纯合子，突变的纯合子和野生纯合子的结果经常会较为类似，例如大多数病原微生物都是单倍体（相当于纯合子），Liew等发现在实验过程中通过加入少量已知基因型的DNA模板（已知基因型的基因组DNA或质粒），人为拉大突变型和野生型的差异，可以方便在实验中进行区分。Luming Zhou的研究表明：相邻SNP位点（2个SNP位点相邻9bp和13bp）的基因分型可以在同一个反应体系内用2条不同且不重叠的未标记探针进行检测而不相互影响；未标记探针的HRM分析除了鉴定已知SNP外，探针对应区域发生的其它SNP也能够被精确地识别。
基因扫描发现未知突变
与传统的扩增后需借助额外的仪器进行凝胶电泳的非均一性的突变检测（例如，dHPLC）相比，HRM提供了更高特异性和灵敏度的检测，同时允许了更高的样本检测通量，大大降低了成本。从理论上来讲由于与潜在多态位点相邻的序列未知，所以使用序列特异性的探针无法对扩增子进行扫描以发现未知的突变。现在，借助HRM的方法，使用高分辨率染料可以对任一的扩增子中的任何位置上的未知突变进行检测，而不需要等位基因特异性的引物和探针。
DNA 甲基化分析
丹麦Arhus大学的Wojdacz博士开创性地在LightCycler® 480实时荧光PCR仪上对NimbleGen人类DNA甲基化2.1M高级启动子芯片和现有的甲基化敏感性高分辨率熔解分析（MS-HRM）技术进行了整合，形成了一套针对性的工作
流程
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，能够快速有效地发现和初步验证DNA甲基化生物标志物。Wojdacz博士不仅重新发现了那些在乳腺癌发生过程中已被证实会出现DNA异常甲基化的位点，更重要的是，他们发现了新的甲基化异常的基因区域，基于MS-HRM的验证实验显示出与芯片数据之间很高的相互验证性，提示了它们将来在临床上的可能用途。
将HRM技术应用于单基因座甲基化研究，实现了在无甲基化背景下检测甲基化模板的灵敏度等于或在某些情况下高于亚硫酸氢钠测序法的灵敏度。它为被筛选的PCR产物的甲基化类型和甲基化水平的研究提供了一条有效途径。
临床诊断
Tze-Kiong Er在有关多酰基辅酶A脱氢酶缺乏症对核黄素响应效果研究中使用HRM方法，检测到3个ETFDH已知突变（c.250GNA，c380TNA，c.524GNT）和1个未知突变（c.1831GNA），研究者预计该热点突变c.250GNA台湾人口中的出现频率为1:125（0.8％）。在实验中每一个突变的HRM分析结果均被稍后的测序方法相互验证。因此，我们说HRM的分析方法可以成功地应用到筛选ETFDH突变，由于多酰基辅酶A脱氢酶缺乏症往往是可以治疗的，特别是与ETFDH突变相关的病例，越早确定ETFDH 突变，对这些病人的治愈越关键。
综上所述罗氏LightyCycler® 480实时定量PCR系统提供了一个快速、稳定、低成本又操作简便的高通量基因筛选的系统平台，可选的（96和384孔板）通量、高温度均一性、出色的光学检测元件以及友好而功能强大的分析软件无疑成为遗传变异的发现和研究分析工具的上乘之选。
浙公网安备 33021202002483