2_4_二硝基苯酚与肌红蛋白的相互作用

2_4_二硝基苯酚与肌红蛋白的相互作用 2,4, 二 硝基 苯 酚与 肌红 蛋白 的 相 互作 用 1,2 1,2 2 * 1,2,,,周秋华张红梅徐 倩王彦卿 ( 1, ,,224002;江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室盐城师范学院盐城 2, ,224002) 盐城师范学院应用化学与环境 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 研究所盐城 : 2,4 , 摘 要利用荧光光谱技术研究了 二硝基苯酚与肌红蛋白分子的相互作 。2,4 , ,用二硝基苯酚与肌红蛋白结合生成基态复合物导致肌红蛋白内源荧光 。,、的猝灭测定了二者结合反应的物理化学参数上述作用过程是一个熵增加自 ,; 、由能降低的自发分子间作用过程二者之间以疏水作用力为主并用同步荧光 2,4 , 。三维荧光光谱法探讨了 二硝基苯酚对肌红蛋白构象的影响 : 2,4 , ; ;; 关键词二硝基苯酚肌红蛋白荧光光谱相互作用 O657.3 A 04-074-04 : 1000-0720( 2011) ::文章编号中图分类号 文献标识码 ,pH =7 . 4 目前硝基苯酚类污染物已经属于国家严格控 的三羟甲基氨基甲 马心肌红蛋白用 ,。 ( Tris) ( 0. 10 mol/ L NaCl) 制排放的有害物质是环境监测的 重 要 指 标 之 一烷缓冲溶液内含 配制成 2,4 , ( 2,4 ,d initrophenol,2,4 , ) 3. 0 ol/ ( 4?) DNPmL二硝基苯酚能 中断μ储备溶液并于冰箱中 温度低于 ,1,,,。 2,4 ,) AR呼吸链直接作用于能量代谢过程毒性大研究。 ( 配 制 成保 存把 二 硝 基 苯 酚 ,、环境污染物与生物大分子的相互作用快速准 确地1. 5 ol /L; Tris ,mm的储备液待用除 为 生 化 试 剂 外 ,获得环境污染物与生物大分子的结合参数有 利于,( 其余试剂均为 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 纯实验用水为高纯水电阻率 ,2,。,18.2 M?cm) 。 对环境污染物的毒性效应进行评价近 年 来环为 Ω ,2 , 1. 2 境污染物与血清白蛋白相结合的研究已引起 重视实验方法 4,。( Mb) 2. 5 mL 3. 0 mol/ L Mb 1cm 肌红蛋白是哺乳动物肌细胞贮存 和分配移取 μ于 的石英比 ,氧的蛋白质在生物体内起着储存氧和促进 氧在细,1. 5 ol/ L mm色皿 中用 微 量 注 射 器 逐 次 加 入 的 ,5,2,4 。, DNP,胞中扩散的作用有关肌红蛋白与环境污 染物相溶液进行 荧 光 滴 定每 次 加 入 溶 液 后 混 。2,4 , DNP ,10 in ,280 nmm 互作用的研究少有报道本文以 作为研合均匀在 一 定 温 度 下 作 用 后于 ,2,4 , b DNP M。,究对象用荧光光谱技术研究了 与 激发波长下进行荧光扫描光源为脉冲式氙灯发 ,5. 0 的作用机理为研究硝基苯酚类污染物在血 液中的射 与 激 发 狭 缝 宽 度 均 为n,m 扫 描 速 度 作用机制以及对肌红蛋白性能的影响提供了 一些基500 nm /min,L 290 ,在 荧 光 分 光 光 度 计 上 记 录 。500 nm ; = 15 nm 础信息 波长范围 内 的 发 射 光 谱固 定 ?λ 1 = 60 nm,2,4 , D Mb 实验部分或?λ 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 与 作用的同步荧 1. 1 仪器与试剂。 ( Ex/ nm) : 200 ,光光 谱在 激 发 波 长 变 化 范 围 LS-50B ( 带 恒 温 系 统 的 型 荧 光 光 度 计 美 国 , 360 n ( / n) : mEmm及 发 射 波 长 变 化 范 围 270 Perkin-Elmer ) ; Spectral 50 , ( 公司紫外 可见光谱仪 德550 nb 2,4 ,mM条件 下 在 荧 光 光 谱 仪 上 记 录 及 ) ; PHS-3C pH 。DNP Mb 。 国耶拿公司型精密 计 与 混合溶液的三维荧光谱图 2010-07-01; : 2010-09-10: 收稿日期修订日期 : ( No, 09KJD150007) 基金项目江苏省高校自然科学基础研究项目资助 yqing7612 6, co w@m: ( 1953 ,) ,,; E-ail:m作者简介周秋华女副教授 2 ,DN P Mb ,Mb 结果与讨论,2,4 与 形成了基态复合物对 内 虑 2. 1 。 2,4,,DN P Mb 源性荧光的猝灭过程应为静态猝灭对 内源性荧光的猝灭 b ( Trp) ( Try) M2. 2 中由于 色 氨 酸 和 酪 氨 酸 的 2,4 ,DN P Mb 、与 结合位点数表观结合常数 存。153 及作用力类型在使其具有内源性荧光肌红蛋白含 个 氨 基 ,( Trp 7 Trp 14) 。 ,DN P Mb n 2,4 酸残基其中有两个色氨酸残基和 由在 分子上有 个相同且独立 设 ,, 79 Trp 7 ,的结合位点则二者的结合符合荧光物质 猝灭剂于第 位的半胱氨酸残基猝灭了 发射的 荧光 ,6,,8,b Trp 14。b : MM使 的内源荧光主要来源于 固 定 间的结合表达式 ,2,4 , DNP,1 ,F, F的浓度逐渐加入 可 知 如图 0 ( 1)lg, ,= lgK+n lg,Q, A F 2,4 , DNP Mb ,引起 的 内 源 荧 光 强 度 降 低峰 位 也 ,Q,2,4 ,DN P 。( 1) 式中为溶液中 的浓度由式作 335 nm 327 nm,2,4 ,DN P Mb 由 位 移 到 说 明 与 lg,( F, F) /F,, log ,,,Q图由 图 的 直 线 斜 率 及 截。之间存在着较强的相互作用 0 2,4 , DNP Mb 矩计算 不 同 温 度 下 与 表 观 结 合 常 K、n,: T =29 8,K=K数 结合位点数 结果如下 AA4 1. 86 ×1 0L/ ol,n =0 . 95; T =30 8,K =3 . 24 × mKA 4 10L/ mol,n = 1. 01。2,4 ,DN P 该 结 果 表 明 与 Mb , 分子之间具有较强的相互作用且大约每一个 2,4 , DNP 分 子 与 一 个 蛋 白 质 分 子 结 合 形 成 复 合 。,9,物根据文献利 用 相 应 的 热 力 学 公 式 可 以 求 Θ G、得结 合 反 应 的 标 准 吉 布 斯 自 由 能 变 Δ焓 变 Θ Θ Θ ,24 . 36 kJ/ mol,、S( T 29 8,GH=K= Δ熵变 ΔΔ Θ Θ H=42 . 35 kJ/ mol,S=224 . 85 kJ /( mol?K) ; ΔΔ ΘΘ T = 308K,G = ,26 . 60 kJ /mol,H = 42. 35 ΔΔ Θ , DNP Mb ( ,1 2,4 24图 对 荧光光谱的影响插图为 kJ /mol,S=223 . 86 kJ /( mol?K) 。Δ由 于 二 者 结 Θ Θ ,DN PMb Stern , Volmer ) 对 荧光猝灭的 图H， 0 ， 0,S合反应的 Δ及 Δ根 据 小 分 子 物 质 与 Fig.1 Effect of 2,4 ,DN P on fuoescence spectalrr生物大分子作用的有关热力学参数可以简单判断 ,9,of Mb ( T = 298K,pH7.4 0,λ= 280 nm,em 。其相互作用力类型主要为疏水作用力 he nse shows the Sen-ome plot foTirttrVlrr 2. 3 2,4 ,DN P Mb 和 作用距离计算 the quenching of Mb by 2,4 , DNP, c ( Mb) ,10,rster ,b FM根据 能 量 转 移 理 论根 据 荧 光 =3 , 0 mo / in all cases)lL μ2,4 ,DN P ,发射光谱与 吸收光谱的重叠图利用相 ,1 1: c1 = 0,3.0 ,6.0 ,9.0 ,12.0 , 曲 线 ( 2,4 , P)DN( E) 、应的能量效率关系式可以计算能量转移效率 15.0 ,18.0 ,21.0 ,24. 0,27.0 ,30. 0 ol/ Lmμ R) 、2,4 , DNP Mb ( 临界能量转移距离与 的结合 0 M( r) 。 2 2,距离 等图 为 荧 光 发 射 光 谱 与 tern-Volmer 2,4 , DNP MbS方程 处 理 对 根据 b , 4 DNP,,10,11,,7,吸收光谱的重叠图根据文献求得 ,1 ,2,4 , DNP 的荧光猝灭数据如图 中插图所示E =0 . 11; R=3 . 40 nm,r =4 . 82 nm,r，可以看出 0 0 Mb ,对 的猝灭曲线呈明显的线形趋势通过计算得 7 nm,2,4 ,DN P Mb ,与 之间的能量转移效率较大 2,4 ,DN P Mb :到 对 分子的荧光猝灭常数分别为 其结合是通过非辐射能量转移而促使蛋白质的荧4 12 T =29 8K,K= 3. 14 × 10 L/ mol,K= 3. 14 × 10 sv q 。 Mb 6. 36 × 2. 88 × 光猝 灭另 外 分 子 的 体 积 为 4 L /( mols) ; T =30 8K,K=3 . 03 ×10 L/ mol,K=? sv q 3 3. 56 n,2,4 , DNP b mM与 之 间 的 结 合 距 离 表 明12 12 10,3. 03 ×1 0L/ ( mol?s) 。K 的数值在 数量级 q 2,4 ,DN P b M的结合位点可能位于 分子的疏水腔10 L/ ( mol?s) ,.0 10 K2×远大 于 动 态 猝 灭 的 值 ,12,q ,Trp 14。 内作用距离更接近于 K,随着温度的升高 有所降低从这种意义上考 SV 2. 4 2,4 ,DN P Mb 对 构象的影响 ,=15 nm 对于蛋白质的同步荧光光 谱?λ 时 ,=60 nm 仅表现为酪氨 酸 残 基 的 荧 光?λ 时 则 显 , 示色氨酸残基的荧光其发射峰位置的变化能够表 。3 2,4 ,DN P 明其所处环 境 的 极 性 的 改 变图 为 Mb 。对 同 步 荧 光 光 谱 的 影 响从 图 中 可 以 看 ,出 2,4 ,DN P,引起酪氨 酸 和 色 氨 酸 残 基 荧 光 的 猝 灭 ,2,4 ,酪氨 酸 的 荧 光 发 射 峰 没 有 明 显 位 移表 明 DNP ,对酪氨 酸 残 基 所 处 微 环 境 的 影 响 较 小而 ,2,4 , 色 氨酸残基的荧光发射峰明显蓝移表明 2 Mb ( a) 2,4 ,DN P ( b)的荧光光谱与 的吸收光谱 DNP Mb 与 的结合使色氨酸残基所处环境的疏g. Fi2The fuoescence emission specta of Mb ( a) lrr。,水 性 增 加另外色氨酸的荧光发射峰峰位的移动 and the absorption spectrum of 2,4 ,D NP,和峰强 下降的程度都要比酪氨酸残基的荧光峰大 ( b)2,4 , DNP 这反映 了 与 色 氨 酸 残 基 的 作 用 比 与 酪 c= c=3 . 0 mol/ L μb 2,4 , MDNP ,。氨 酸 残 基强作用位点更接近于色氨酸残基 3 Mb 图 的同步荧光光谱 Synchronous fluorescence spectra of Mb Fig. 3 : c=0 ,3.0 ,6.0 ,9.0 ,12.0 ,15. 0,18.0 ,21.0 ,24.0 ,27.0 ,30. 0 mol /L曲线从上到下μ 2,4 , DNP pH7.4 0; T =29 8K; c=3 . 0 mol/ Lμ Mb , DNP b ,2,4 M三维 荧 光 光 谱 能 够 较 全 面 的 提 供 内 源 荧 光与 的结合形成反应物的体 积 并 明 ,13,。4 2,4 , b 。 4( ) 2 DNP MA:“”物质的荧光信息图 为 与 的 没 有 增 大图 中 个指 纹 峰荧 。4( A) 2 “ nm/ 325 nm / 三维荧光谱图图 中有 个形似铅 光 峰( /) 280nm( a) 230λλ为 峰 和 ex e m ”( 1 2) ,。329 n ( b) ,b 。 4mM笔 的 型纹线峰 和 峰 为 瑞 利 散 射 峰峰 是 的 荧 光 峰对 应 于 图 2,4( b) ,,,a 随 着 明显看出峰 的 形 状 发 生 了 变 化峰 和 峰 , DNP Mb ,b “”,2 与 的 结 合两 个 瑞 利 散 射 峰 强 度 发 的指纹区强 度 明 显 降 低而 且 个 荧 光 生4 ( ) ,a A峰 强 度比例与 图 明 显 不 同峰 峰 强 度 降 。 不同程度的降低,2,4 , DNP 低 的 大一点表明 分 子 中 的 苯 环 共 轭 2,4 ,DN P b , M由于 与 之 间 存 在 疏 水 作 用Mb 、体 系 易 于 中 的 色 氨 酸酪 氨 酸 残 基 的 芳 香 Mb ,, 。使 分子表 面 的 疏 水 性 增 加一 定 程 度 上 引 起 环 的 共 轭体系发生 π π 弱相互作用 Mb 。瑞利散射峰强 度 的 降 低另 外 结 合 反 应 物 体 ,14,,4 积 增 大 会 引 起 光 散 射 强 度 增 强图 结 果 表 , DNP Mb 4 2,4 图 与 相互作用的三维荧光光谱 Fig.4 The three-dimensional fluorescence map of Mb ( a) and 2,4 , DNP-Mb( b) c: a ,3 .0 mol /L; b ,3 .0 mol/ L; c: a , 0 mol/ L; b ,30 .0 mol/ L μμμμMb 2,4 ,DN P Huang Y M,Zhang Z J,Zhang D J,et al, Talanta ,, 8参考文献 2001,53: 835 Terada H, Environ Health Perspect,1990,87: 213,1, ,,,, ,2007,9, ,张红梅王 彦 卿张 根 成等分 析 试 验 室 ,2,,,, ,2004,,王 月肖 尚 友陈 环 境 化 学 华等 26( 3) : 118 23( 5) : 529 Sklar L A,Hudson B S,Simoni R D, Biochem,1977,,, 10,3, ,,,, ,2010,梁彦秋孙 小 寒冯 婧 微等分 析 试 验 室 16: 5100 29( 5) : 80 Gryczynski Z,Bucci E, Biophys Chem 1998,74: 18711, , ,,,, ,,20094, ,梁彦秋臧 树 良邓 斌等分 析 试 验 室 ,12,Chu K,Vojtechovsky J,Mcmahon BH,et al, Nature, 28( 3) : 74 2000,403: 921 ,,,, ,,5, 马 静郑 学 仿唐 乾等高 等 学 校 化 学 学 报 Lin G L,Liao Y Y,Wang X H,et al, Exp Gerontol,,13, 2008,29( 2) : 258 2006,41: 328Hargrove MS, Krzywda S, Wilkinson AJ, et ,6, Xiao J B,Chen X Q,Jiang X Y,et al, J Fluoresc,14, al,B iochem,1994,33: 11767 2008,18: 671,,,, ,1995, ,马贵斌高 飞任 斌 知等化 学 学 报7, 53( 12) : 1193 Studies on the interaction between2 ,4-dinitrophenol and myoglobin 1,2 1,2 2 * 1,2 ZHOU Qiu-hua, ZHANG Hong-mei, XU Qianand WANG aYn-qing( 1, Jiangsu Provincial Key Laboratory of Coastal etland Bioresources and Environental Protection,ancheng 224002; 2, Institute of pplied WmYAChemistry and Environmental Engineering,Yancheng Teachers University,Yancheng 224002) ,Fenxi Shiyanshi,2011,30( 4) : 74 , 77 Abstract: The interactions of 2, 4-dinitrophenol with myoglobin were investigated by fluorescence spectum techniques, 2,4-dinitrophenol effectively quenchedt he intrinsic fluorescence of myoglobin via static quenching, The binding process of 2,4-dinitrophenol to myoglobin was a spontaneous molecular interaction procedure, The binding constants and thermodynamic parameters at two different temperatures,the binding site,and the binding force were obtained, The hydrophobic interaction played a major role in stabilizing the 2,4-dinitrophenolyoglobin coplex,Th e conforation of yoglobin as discussed by synchronous and threediensional fluorescence -mmmmw-mtechniques,K eywords: 2,4 ,D initrophenol; yoglobin; Fluorescence spectroscopy; Interaction M