梅毒

梅毒常见实验室诊断方法及其进展 国外医学皮肤性病学分册1999年第25卷第5期北京市性病防治所任翊综述北京佑安医院刘德恭审校 摘要近年来梅毒的发病率有逐年增加的趋势、研究新的快速、价廉、简便、敏感且特异的诊断方法是当前主要研究热点,而设计新试剂盒的关键在于,对现有试剂盒优、缺点的认识和改良,利用人工合成梅毒螺旋体原设计出新的检测方法。对梅毒螺旋体抗原的分析及人工合成,国外早在1989年就已开始进行,几年来发展迅速,目前已有各种针对不同需要的试剂盒。 关键词梅毒血清学诊断合成抗原 目前虽然各国之间梅毒流行的情况送别很大,但它依旧是十分重要的社会和医学问题[1]。近年来,大多数欧洲国家梅毒发病率显著下降,已小于2/10万。但在前苏联国家中,梅毒的发病率却显著上升,如俄罗斯梅毒的发病率大于32/10万[2]。即使在美国,在特定的种族人群中梅毒的发病率依然很高[3]。在我国,梅毒的发病率逐年增多,所以研究新的快速、价廉、简便、敏感且特异的诊断方法,对该病的防治有着重要的意义。现对目前已有诊断方法的优缺点,以及最新诊断方法作一综述。 梅毒常用诊断方法 (一)检查梅毒螺旋体:可用病损处的渗出液进行暗视野、涂片银染色、免疫荧光染色、家兔感染试验(RIT)或PCR法检测,以及用酶免疫法(EIA)理论设计的,利用单克隆抗体检验梅毒螺旋体的方法,如Visuwell试验[4]。①暗视野显微镜检查由于对取材、检查技术要求较高;并且在口腔及肛门部位有口腔螺旋体、大齿密螺旋体、小齿密螺旋体及生殖器螺旋体等其他条件致病螺旋体存在,暗视野检查时不易与它们区分;此外梅毒螺旋体本身很脆弱,容易受外界条件如服用过抗生素、病损处外用一些化学药物等的影响,该方法敏感性较低,所以暗视野检查阳性也不能排除梅毒的可能性。但由于它特异性很高,经过训练的检验人员在暗视野显微镜下看到形态典型的梅毒螺旋体,结合临床症状即可作出早期诊断。②镀银染色法检查螺旋体,适用于缺乏暗神显微镜的基层单位。③免疫荧光染色是用抗梅毒螺旋体抗血清或单克隆抗体,加非致病性螺旋体培养物进行吸收,再与异硫氰酸荧光素(FITC)相结合,用此方法来染梅毒螺旋体,在荧光显微镜下读结果,阳性者可见绿色荧光螺旋体,其优点是可区分梅毒螺旋体与其他条件致病性螺旋体,对口腔、肛门等部位的损害有鉴别价值,且敏感性亦有所提高。④RIT是利用家兔对梅毒螺旋体的易感性,把梅毒螺旋体注射于成年新西兰白兔睾丸内,观察有无感染亦象。RIT是经典的梅毒诊断方法,由于其费用高、 检查时间长等弊病目前仅用于科学研究。⑤PCR法是较新的方法,它能对生殖器溃疡早期鉴别诊断,区分梅毒、生殖器疱疹及软下疳[5]。它可分为PCR和RTPCR,PCR的设计主要针对编码梅毒螺旋本特异性抗原和TpN47(Tpp47)的DNA开放编码区,常见的引物设计见附表。 由于在PCR中会偶然出现非特异的PCR产物而干扰结果,这就必须用特异性的DNA 探针进行DNA-DNA杂交来提高PCR的特异性及敏感性。此外用TpN47设计的PCR,由于TpN47的保守性,雅司螺旋体可产生类似的PCR产物,所以这种设计的PCR不能区分梅毒和雅司;但可以区分梅毒螺旋体和引博氏疏螺旋体,这就可以解决梅毒与莱姆病之间血清诊断中的免疫交叉问题[6]。另一种是RT-PCR,常见的设计是针对梅毒螺旋体的16s rRNA 366bp 片段[7],这种方法污染少,特异性敏感性高,但价格稍高。PCR在梅毒持续感染中的诊断价值目前尚无一致意见,理论上PCR可查出死亡的TP,所以治疗后PCR阳性并不意味着治疗失败,但死亡的TP从机体内清除较快(15~30天),而存活的TP从机体内清除至少需120天,所以治疗数周后PCR阳性意味着持续感染的可能[8]。 附表:针对编码梅毒螺旋47-kD抗原基因设计的常用引物起莱姆病的 引物名引物序列产物 KO3A 5%26acute;-GAAGTTTGTCCCAGTTGCGGTT(537-559) 261bp KO4 5%26acute;-CAGAGCCTCAGCCCTTTTCA(797-776) 47-1 5%26acute;-GACAA TGCTCACTGAGGATAGT(648-669) 658bp 47-2 3%26acute;-ACGCACAGAACCGATTCCTTG(1284-1305) 47-3 5%26acute;-TTGTGGTAGACACGGTGGGTAC 496bp 47-4 3%26acute;-TGATCGCTGACAAGCTTAGGCT(1187-1208) (二)梅毒血清试验:梅毒螺旋体感染机体后可产生两种抗体,一种是抗心磷脂抗体,即非特异性抗体,亦称反应素,主要方法有性病研究实验室试验(VDRI)、血清不需加热的反应素试验(USR)和快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)以及Capture-S试验——一种非螺旋体抗体因相红细胞吸附试验[9]。这种抗体滴度与梅毒活动有关,临床上主要用于观察疗效,复发及再感染。另一种是抗梅螺旋体抗体,即特异性抗体,主要有IgM和IgG检测方法有荧光螺旋抗体吸收试验(FTA-ABS)及梅毒螺旋体血凝试验(TPHA),以及利用螺旋体天然抗体原依照EIA原理设计的Captia select Syph-G试验[10],和新近出现的利用梅毒螺旋体合成抗原(TpH15、TpN17、TpN47)设计的ICE syphilis EIA试验和Syphilis Fast 试验[12]。这些方法一般用于梅毒的确认试验,由于检测的是抗梅毒螺旋体IgG抗体,所以 即使患者经足够的抗梅毒治疗,血清反应仍保持阳性。而近年来发展的检测抗梅毒螺旋体IgM抗体,却能早期诊断及判断疗效。主要方法有:①19S-IgM-荧光抗体吸收试验(19S-IgM-FTA-ABS):先用高压液相色谱或其他方法分离标本中的IgM,然后再做FTA-ABS,其特异性与敏感性均很高,但价格昂贵不易推广。②IgM固相血凝试验(IgM-SPHA)和梅毒螺旋体特异性IgM血凝试验(TP-IgM-HA)均是对现有方法的改良,要求事先分离IgM抗体。③梅毒特异性IgM抗体捕捉ELISA试验(IgM-CAP-ELISA)[13]:此方法是利用间接ELISA的原理,扰抗人IgM单抗包被在微量滴定板或其它固相载体上,加入待检血清以捕捉其中的IgM,再先后加入超声粉碎或基因重组获得的梅毒螺旋体抗原、生物素标记的抗梅毒螺旋体单抗、辣根过氧化物酶标记的链亲和素及底物,最后通过显色判定结果。④SDS-PAGE及免疫印迹法:把梅毒螺旋体溶解后的悬液或Triton x-114提取液,点于SDS-多聚丙烯酰胺凝胶中电泳,电泳后转移至硝酸纤维膜上,分别加入等检血清、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgM或IgG抗体、底物4-氯萘酚,当出现72、47、45、42、37、17、15kD中的一条或多条显色带即判定为阳性[14]。由于梅毒感染后血循环中首先产生的是IgM抗体,并且IgM抗体不能通过胎盘,而且梅毒患者抗TPIgM抗体的出现与梅毒的复发再感染或活动性有关,所以IgM抗体检测试验是早期梅毒、胎传梅毒诊断和疗效观察的十分敏感和特异的方法,通过检测抗TP igM抗体可提示是梅毒活动还是静止以及是否需要治疗等。 既往设计的酶联免疫试剂盒采用的是梅毒螺旋体Nichol株的天然提纯抗原,如Select syph-C。这种试验的缺点在于天然提纯抗原成分复杂,并且不能非常快速地得到结果,所以用分子克隆技术,人工合成梅毒螺旋体抗原是设计新试剂盒的关键,因为它能克服制备天然抗原时不可避免的兔蛋白污染,并且成分清晰固定,而且可以利用ELISA的全自动化、金标纸片法的快速化设计成各种试剂盒。 TP抗原的人工合成 早在1989年,Issacs等[15]就提出了人工合成梅毒螺旋体抗原进行梅毒血清学诊断的设想。同年Ijesselmuiden等[16]就合成了TpN44.5(TmpA)用于酶联免疫法检测梅毒,他们检验了938供血者血标本,148例未经治疗的梅毒患者,167例已经治疗的梅毒患者,190例性病门诊非梅毒患者,发现该方法特异性为99.6%,对一期梅毒的敏感性为76%、二期梅毒100%、早期潜伏梅毒98%。1995年Zrein等[17]合成了TpN15和TpN47用于酶免疫法检测梅毒,他们对1822例标本进行检测,发现该方法特异性达99.8%,敏感性接近100%。1996年Gerber等[18]对梅毒螺旋体抗原进行了较为全面的研究,他们用PCR法扩增了编码梅毒 螺旋体抗原的DNA,并插入大肠杆菌中使其表达,产生了TpN17、TpN29-35(TpD)、TpN44.5 (TmpA)TpN47、TpN35以及TpN39梅毒螺旋体抗原,并应用酶联免疫吸附试验对合成的抗原进行检测,结果发现TpN17、TpN47和TpN44.5的抗体滴度最高,而且这3种抗原联合起来的敏感性要比单一任何一种抗原的敏感性要高,并且与莱姆病螺旋体无交叉反应。1997年Fujimura等[19]也合成了分子量为17kD、15kD、47kD、42kD的梅毒螺旋体抗原,并用M代表成熟抗原、S代表含有目的序列的抗原、G代表谷胱甘肽-S转移酶融合抗原。他们发现M47、S42的表达水平较高,而M15、M17的表达水平很低,但G15、G17的表达水平很高,这使得用层析提纯法能获得大于95%的提纯抗原,他们用ELISA法以1∶1000稀释的血清检测这些提纯的抗原(G17、G15、M47、S42)发现G17抗原的敏感性最高。同年Centurion等[20]对梅毒15kD抗原的研究发现,TpN15的保守性很强,在梅毒螺旋体各株中,如Nichol株、Bal-3株、Gauthier株、Bosnia株以及Cuniculi a、H、K株,编码15kD 抗原的DNA序列没有明显变异,并且各株梅毒螺旋体增色表达该抗原,这说明15kD抗原的变异很少。综合以上对梅毒螺旋体抗原的研究,发现TpN15、TpN17、TpN44.5、TpN47的抗原性最强,并且综合抗原的敏感性和特异性比单一抗原更优越。 1998年Young合成了TpN15、TpN17和TpN47,并设计了快速诊断试剂盒Syphilis fast[13]和自动化程度很高的ICE Syphilis[12]试剂盒。Syphilis fast是将3种合成抗原包被在乳胶颗粒上,当与含有梅毒抗体的血清混合后,可在3分钟内产生肉眼可见的凝集,如果血清中没有抗体,乳胶颗粒将保持均质状。如果血清产生凝集则需要做重复试验,重复试验中血清首先与含有合成抗原(与包被抗原一样)的试剂预孵育1分钟,然后加入抗原包被的乳胶颗粒,混合后静置3分钟,如果没有凝集则说明血清中有梅毒抗体存在,而凝集现象被预孵育中的合成抗原抑制了;如果产生凝集则说明血清中没有梅毒抗体,第一次试验中的凝集现象不是由梅毒抗体产生的。这种试验简单、快速并且敏感性、特异性均很高,用Syphilis fast、Select Syph-G、VDRL、TPHA和FTA-ABS,以平行配对法检测1617例血清标本,结果发现Syphilis fast的特异性达99.9%,与Select Syph-G的特异性99.5%和VDRL的特异性99.4%相比有统计学差异(P<0.02),而Syphilis fast 95.6%的敏感性与TPHA和FTA-ABS相比统计学差异。Syphilis Fast和Select syph-G对未治疗的梅毒感染的敏感性均很高为96.8%,VDRL对未治疗的早期梅毒感染的敏感性也达92.3%,但对未治疗的晚期梅毒感染的敏感性仅为30.8%,而Syphilis fast和Selcet Syph-G对检测已治疗的梅毒,包括晚期梅毒的敏感性也高达95.7%。所以该方法可替代RPR、VDRL进行梅毒的初筛,并能克服心磷脂试验中的前带现象。 ICE Syphilis是基于EIA原理设计的试验,由于EIA试验自动化程度高、结果客观、能够减少主观操作失误,所以适用于大量标本的筛查。ICE syphilis的原理是用合成的3种梅毒抗原包被于微孔板上,同时包被在微孔板中的还有抗人IgG、IgM抗体,并用过氧化物酶标记的合成抗原(TpN15、TpN17、TpN47)检测被捕捉的抗梅毒螺旋体抗体。该方法总的敏感性拉近100%,而Select syph-G的敏感性为92.4%、TPHA 97.1%、FTA-ASB 92.4%、VDRL仅为37.5%,此外由于梅毒合并HIV感染的出现,可以使血清中的梅毒抗体水平很低,而ICE syphilis的抗体指数(血清吸光值/cut off值)比Select Syph-G的高(P<0.001),这意味着ICE syphilis更敏感,所以虽然原理一样,但ICE Syphilis用合成抗原要比Select syph-G用天然抗原更具优越性,而且99.8%的特异性、对已治疗患者和晚期梅毒患者的高度敏感性,使该方法适用于各种医疗机构。 目前梅毒检测方法的发展突飞猛进,有针对基层医疗单位的快速、简便的试剂盒,也有针对专门医疗机构,如血站、性病防治机构等每天需要检测大量标本的自动化程度很高的试剂盒。而国外进口的试剂价格昂贵,为了适应中国国情,必须加强试剂的国产化,以期降低成本。这方面有许多工作要做,而低成本合成梅毒螺旋体抗原是关键。 参考文献 1 Drusin LM.Int J STD AIDS,1996;7:7-9 2 Linglof T.Sex Transm Dis,1995;22:160-161 3 Nakashima AK et al.Sex Transm Dis,1996;23:16-23 4 Cummings MC et al.Sex Transm Dis,1996;34:49-54 5 Orle KA et al.J Clin Mirobiol,1996;34:49-54 6 Jennifer MB et al.J Clin Microbiol,1991;29:62-69 7 Centurion LA et al.J Clin Microbiol,1997;35(6):1348-1352 8 Wicher K et al.Infect Immun,1998;66:2509-2413 9 Stone DL et al.J Clin Microbiol,1997;35:217-222 10 Lefevre JC et al.J Clin Microbiol,1990;28:1704-11707 11 Young H et al.J Clin Microbiol,1998;36:913-917 12 Young H et al.Int J STD AIDS,1998;9:196-200 13 van der Sluis JJ et 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