PCR技术及应用

PCR技术及应用 PCR技术的研究与应用 班级:0814541 学号:081454115 姓名:刘俊 摘要 随着分子生物学的发展，PCR技术的应用已由实验室中的探索发展到各项事业的应 用中的一种技术。从研究PCR技术及相关注意操作到PCR技术在分子生物学、遗 传学、医学甚至考古学等方面的应用。当然，PCR技术的开发仍需进一步完善其精 确度和准确度，其应用前景将会在众多领域得到体现 关键字 PCR Taq酶 引物 PCR技术应用 一、PCR技术的基本原理及特点 PCR技术，即聚合酶链式反应，是美国cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，鼓又称基因的体外扩增法。 1、 PCR技术的基本原理 首先是双链DNA分子在临近沸点的温度下加热时分离成两条单链DNA分子，然后 DNA聚合酶以单链DNA为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 并利用反应混合物中的四种dNTPs合成新生DNA 互补链。此外，新合成DNA聚合酶同时需要有一小段双链DNA来启动(引导)新 链的合成。【1】 一般过程是: ? 反应系统加热到90,95?，底物双链DNA变性成两条单链DNA，作为互补链聚合反 应的模板 ? 降温至37,60?，使两条引物分别与模板DNA的3′一侧的互补序列杂交(复性) ? 升温至70,75?，耐热性DNA聚合酶催化引物按5′?3′方向延伸，合成模板DNA 链的互补链。【2】 2、 PCR技术的特点 PCR技术快速敏感，简单易行，其原理也并不复杂，与细胞内的DNA复制过程十分 相似，其中需要引物，DNA模板，四种脱氧核苷三磷酸(dNTTs)及DNA聚合酶。然 而，PCR技术有其固定的特点。 ? 新合成DNA链的起点是由在反应混合物中的一队寡核苷酸引物在模板DNA链两端 的退火位点决定的。 ? PCR反应的最后理论最高值得到的结果应为n。【3】 2 二、 DNA聚合酶 在早期进行PCR反应中使用的是大肠杆菌DNA聚合酶?的Klenow大片段，但此酶是热敏感的，在双链DNA解链所需的高温下，会被破坏掉。因此，每个循环都需要添加聚合酶。 1988年R.K.Saiki等人成功将TaqDNA聚合酶用于PCR扩增，提高了反应的特异性和敏感性。耐高温的TaqDNA聚合酶最初是由Erlich于1986年从一种生活在温度高达75?的热泉中的细菌,即水生嗜热菌中分离出来的,他的DNA聚合酶在此高温下能很好的工作,在94?也能稳定较长时间,这种酶在95?下半衰期长达38分钟,其最适温度是72?. located in the Tomb, Dong Shen Jia bang, defer the next day focused on the assassination. Linping, Zhejiang, 1 of which liquor wine masters (Wuzhen said information is Carpenter), who got A few bayonets, due to missed fatal, when night came 然而,在体外进行的纯化TaqDNA聚合酶已经失去了3′?5′方向的校正活性. TaqDNA聚合酶具有类似脱氧核苷酸末端转移酶的功能,可在新合成的双链产物的3′ 端加上poly(dA),这是一个非模板的碱基合成.【4】 三、 引物 引物是指在OCR反应中与待扩增的靶DNA区段两翼互补的寡聚核苷酸,其本质是单链 DNA片段,PCR扩增产物的大小及扩增的靶序列在基因组中的位置是由引物限定的.因此, 引物的选择对PCR成功与否具有决定意义. 引物设计质量是影响PCR扩增的关键因素，一般要考虑以下几个问题: 1、长度 引物的长度一般为16,30bp为宜，最佳为20,24bp，不形成稳定的复合物， 更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高有效性，扩增产物会增多 2、G+C含量一般为40%~60%为佳，两条引物的G+C含量应尽量相似，Tm最好接近， 差异最好在1?以内部超过5?。 3、两个引物之间不应发生互补，应尽量避免数个嘌呤或嘧啶连续排列，避免同源序列。 4、引物内部避免形成次级结构，尤其是发卡结构，若用人工判断，引物自身连续互补 碱基不能大于3bp。 5、引物的延伸从3'端开始，3'端不能进行任何修饰，也不能形成二级结构的可能，3' 端最后的一个碱基最好是G或C。 6、引物的5'端限定着PCR产物的长度，它对扩增产物的特异性影响不大。因此，可以 被修饰而不影响扩增的特异性。 7、引物的3'端不要终止于编码区或密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并， 会影响特异性与效率。【5】 四、PCR反应得条件 聚合酶链式反应的条件主要考虑以下几个方面:PCR反应体系的配制，变性的温度与时 间，退火的温度与时间，延伸的温度与时间，循环次数等。 1、PCR反应体系的设制 PCR是一种体外条件下模拟生物体内DNA复制达到在很短的时间内大量扩增的特异DNA 片段的技术。因此，反应体系中除添加DNA模板，一对寡聚核苷酸引物，适量的dNTPs， 耐热DNA聚合酶外，还应包含Mg2+的维系DNA聚合酶活性的缓冲液系统。 2、变性的温度与时间 在PCR反应中，能否成功地使DNA和PCR产物充分变性是反应成败的关键。一般情况下， 93?,95?足以使模板DNA变性，但反应温度不能过高，否则影响酶的活性。变性所需 的时间与DNA分子的长度有关，DNA分子越长，则所需时间越长。 3、退火的温度与时间 引物与模板复性所需的退火温度与时间取决于引物的长度，碱基组成及其浓度。引物长 度越短，G+C含量越低，所需退火温度就越低。 引物退火温度可通过Tm=4(G+C)+2(A+T)粗算，一般在算出的Tm值上减去5?，即为较 合适的反应设计退火温度。 4、延伸的温度及时间 延伸的温度取决于使用DNA聚合酶的最是温度。一般选择在70,75?之间，最适72?。 过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，PCR反应延伸的时间视待扩增片段的长度决 定。在最适温度下，核苷酸的渗入率为每秒35,100个核苷酸。延伸时间过长会导致非located in the Tomb, Dong Shen Jia bang, defer the next day focused on the assassination. Linping, Zhejiang, 1 of which liquor wine masters (Wuzhen said information is Carpenter), who got A few bayonets, due to missed fatal, when night came 特异性扩增带的出现。 5、循环次数 循环次数决定PCR扩增的程度，通常情况下，PCR循环次数主要取决于反应体系中最初 模板DNA的浓度。循环次数过多会增加非特异性产物量。一般循环次数在30,40。【6】 五、PCR技术的应用 1、分子生物学的理论研究 运用PCR方法可进行DNA序列的分析，尤其对特殊序列的DNA，如AT丰富区，GC 丰富区。长的卡夹结构等的分析，还可以进行核苷酸的定点突变，测定染色体上两个 位点之间的重组值，制备高标记的DNA探针等理论研究。 2、临床医学上的研究 可检测由基因的缺失、转位、单基因的点突变或者由于某种致病基因的存在(如遗传 或病毒感染等)所引起的各种疾病。 3、法医学和刑事侦破上的应用 应用聚合酶链式反应可以从罪犯的一根头发或一滴血斑中获得有关罪犯的基因类型 的证据。也可以进行亲子鉴定。 4、考古学上的应用 由于PCR对基因组DNA的完整性要求不高，而对分子考古学极为有用，可判定生物的 种类间的亲缘关系，进化途径等。【7】 参考文献 【1】吴乃虎 《基因工程原理》 第二版 上册 三年级上册必备古诗语文八年级上册教案下载人教社三年级上册数学 pdf四年级上册口算下载三年级数学教材上册pdf 科学出版社 2003.5 100,101 【2】楼士林 《基因工程》 科学出版社 2003.9 54,55 【3】吴乃虎 《基因工程原理》 第二版 上册 科学出版社 2003.5 100,101 【4】李立家 《基因工程》 科学出版社 2004.3 38,39 【5】何水林 《基因工程》 科学出版社 2008.5 82,83 【6】邹克琴 《基因工程原理和技术》 浙江大学出版社 2009.1 79,80 【7】贺淹才 《基因工程概论》 清华大学出版社 2008.4 162,163 located in the Tomb, Dong Shen Jia bang, defer the next day focused on the assassination. Linping, Zhejiang, 1 of which liquor wine masters (Wuzhen said information is Carpenter), who got A few bayonets, due to missed fatal, when night came