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基因组DNA提取步骤.doc

基因组DNA提取步骤

再见高傲的低贱
2017-10-19 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《基因组DNA提取步骤doc》,可适用于职业岗位领域

基因组DNA提取步骤基因组DNA提取步骤从无水乙醇中取出少许组织(约mg)加入干净灭菌的EP管中剪碎加入ul,的SDSul(mgml)的蛋白酶K充分浸润入摇床(转分)期间振荡助溶至澄清(h)取出消化液加入molL的NaClul氯仿ul轻柔正反颠倒使其充分乳化转分离心min取出上清(约ul)加入等体积氯仿抽提一次轻柔颠倒后转分离心min上清加入μlRNaseA(μgμl),分钟,除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响可省略该步骤)。取上清加入等体积异丙醇轻柔混匀后沉淀min转分离心min弃上清用,乙醇洗涤次(ul转分离心min)弃上清冰冻无水乙醇洗涤次(ul转分离心min)弃上清自然晾干或烘干DDW溶解ul。基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中,可用玻棒将其取出而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部,从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚氯仿抽提、混匀过程要轻缓,以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库,初始DNA长度必须在kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析,DNA长度可短至kb,在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般kb以下)。不同生物(植物、动物、微生物)的基因组DNA的提取方法有所不同不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法,以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时,应考虑除去多糖和酚类物质。本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。从植物组织提取基因组DNA一、材料水稻幼苗或其它禾本科植物李(苹果)幼嫩叶子。二、设备移液器冷冻高速离心机台式高速离心机水浴锅陶瓷研钵ml离心管(有盖)及ml和ml离心管弯成钩状的小玻棒。三、试剂:mmolLTrisCl,pH,mmolLEDTA,mmolLNaCl,、提取缓冲液SDS。、提取缓冲液:g葡萄糖g二乙基二硫代碳酸钠gPVPul巯基乙醇加水至ml。、::氯仿:戊醇:乙醇、RnaseA母液:配方见第一章。、其它试剂:液氮、异丙醇、TE缓冲液无水乙醇、乙醇、molLNaAc。四、操作步骤:(一)水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取在ml离心管中加入ml提取缓冲液,水浴预热。水稻幼苗或叶子g,剪碎,在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中,剧烈摇动混匀,水浴保温分钟(时间长,DNA产量高),不时摇动。加入ml氯仿戊醇乙醇溶液,颠倒混匀(需带手套,防止损伤皮肤)室温下静置分钟,使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。室温下rpm离心分钟。仔细移取上清液至另一ml离心管,加入倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。在mleppendorf中加入mlTE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE的离心管中,DNA很快溶解于TE。如DNA不形成絮状沉淀,则可用rpm离心分钟,再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在水浴放置分钟以上以帮助溶解。将DNA溶液rpm离心分钟,上清液倒入干净的ml离心管。加入μlRNaseA(μgμl),分钟,除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响可省略该步骤)。加入体积的molLNaAc及×体积的冰乙醇,混匀,放置分钟左右,DNA形成絮状沉淀。用玻棒捞出DNA沉淀,乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。将DNA重溶解于mlTE,贮存。取μlDNA样品在Agarose胶上电泳,检测DNA的分子大小。同时取μl稀释倍,测定ODOD,检测DNA含量及质量。注意g样品可保证获得μgDNA,足供RFLP、PCR等分析之用。(二)从李(苹果)叶子提取基因组DNA取克嫩叶,液氮磨成粉状。加入提取缓冲液ml,再研磨至溶浆状。rpm,min。去上清液,沉淀加提取液ml,混匀。,min,常摇动。同本节(一)中步骤操作。从动物组织提取基因组DNA一、材料哺乳动物新鲜组织。二、设备移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。三、试剂、分离缓冲液:mmolLTrisClpH,mmolLNaCl,mmolLEDTA。、其它试剂:SDS蛋白酶K(mgml或粉剂)乙醚酚:氯仿:异戊醇(::)无水乙醇及乙醇molLNaClmolLNaAcTE。四、操作步骤:切取组织g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。倒入液氮,磨成粉末,加ml分离缓冲液。加mlSDS,混匀,此时样品变得很粘稠。加ul或mg蛋白酶K,保温小时,直到组织完全解体。加mlmolLNaCl,混匀,rpm离心数秒钟。取上清液于新离心管用等体积酚:氯仿:异戊醇(::)抽提。待分层后,rpm离心分钟。取上层水相至干净离心管,加倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。移去上层乙醚,保留下层水相。加体积molLNaAc,及倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止分钟DNA沉淀形成白色絮状物。用玻棒钩出DNA沉淀,乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于mlTE中,保存。如果DNA溶液中有不溶解颗粒,可在rpm短暂离心,取上清如要除去其中的RNA,可加μlRNaseA(μgμl),保温分钟,用酚抽提后,按步骤重沉淀DNA。细菌基因组DNA的制备一、材料细菌培养物。二、设备移液管,高速冷冻离心机,台式离心机水浴锅。

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