解冻温度对大额牛（Bos frontalis）精子活率及形态的影响

解冻温度对大额牛（Bos frontalis）精子活率及形态的影响 解冻温度对大额牛(Bos frontalis)精子活 率及形态的影响 2009年22卷4期 VoI.22Nn4 西南农业学报 SouthwestChinaJournalofAgriculturalSciences1093 文章编号:1001—4829(2009)04—1093—06 解冻温度对大额牛(Bosfrontalis) 精子活率及形态的影响 和占星,赵家才,黄必志,袁希平 (1.云南省草地动物科学研究院,云南昆明650212;2.云南省家畜冷冻精液站,云南昆明650212) 摘要:分别用32,35,38,4l和44?水浴解冻大额牛细营冻猜,解冻后在常温(平均温度l8.06?1.50?,相对湿度46.64?4.52 %)下保存4Oh,分别在0,6,12,18,24,30,36,38,39和40h取样在显微镜下观察记录精子活率和活力;并在解冻后0,6,12,18和 24h用姬姆萨染色,在显微镜下观察记录精子形态,统计分析5个时段的精子畸形率.研究结果:0)35?解冻的精子复苏率为68. 8O%,极显着高于44?解冻的54.2%(P<0.01),但与其它3个解冻温度比较差异不显着(P>0.05).?以38,44?解冻的精 子存活时间在38—39h之间,以32?解冻的存活时间最短,仅为36h.?解冻后0h的精子活率在42.5O%,50.o0%之间,不 同解冻温度问差异不显着(P>0.05);保存6,12和18h时,分别以35,38和4I?显着高于44?(P<0.05);保存24h后,各解冻 温度间差异不显着P>0.05).?解冻后0h的精子活力以35?极显着高于44?(P<0.O1);保存6h以32,41?显着高于44 ?(P<0.05);保存18h,以32和41?高于4_4?(P<0.05);保存24h后各解冻温度问差异不显着(P>0.05).(用41和44? 解冻的总精子畸形率极显着高于38?(P<O.01),显着高于35?(P<O.05),32,35和38?问及32,41和44?间差异不显着(P >0.05),用35和38?解冻对精子形态损伤较小.研究表明:解冻温度越高大额牛冻精的精子活率和活力降低速度越快,精子畸 形率也高,且解冻温度对精子头部和尾部形态的影响最大;大额牛细菅冻精宜用38?3?水浴10s解冻,解冻后在l8?以下常温 下保存6h对其精子活力等影响不大. 关键词:大额牛;精子;解冻温度;活力;畸形 中图分类号:$823文献标识码:A EffectofThawingTemperatureonLiveSpermCountandMorphological ProfileofGayal(Bosfrontalis)SemenunderNormalTemperature HEZhan—xing,ZttAOJia—cai,HUANGBi.zhi’,YUANXi—ping (1.AcademeofGrasslandandAnimalScience,YunnanKunming650212,China;2.LivestockFrozenSemenStolonofYunnanProvince, YunnanKunming650212,China) Abstract:Theobjectiveofpaperwastoprovidethepracticalthawtemperatureofgayal(Bosfrontalis)frozensemeninordertoimproveutili— zationrateoffrozensemenandpregnancyrateofartificialinsemination(AI)ofgayalwithsemi-wildnessthroushcarefulstudyofthaw temperatureonthelivespermatozoacount(%),livabletime,progressivemotility(%)andmorphologicalprofileofgayalthawingfrozen semenunderroomtemperature.Straw0zensemenofgayalwasthawedat32,35,38,41and44? byawaterbath.Andpost—thawstraw semenwasleftinroomtemperature(averagetemperatureandrelativehumidityrecordedduringtheexperimentunder18.06?1.50?and 46.64%?4.52%,respectively)for40h,andespeciallylivespermcountandprogressivemotilityofgayal8咖semeuwereobservedand countedat0,6,12,18,24,30,36,38,39and40h,respectively.Meanwhile,morphologicalprofileofgayalsemenwithGiemsastai— ningwasobservedfromvariousfieldsundercompoundmicroscopeat400×magnificationandthenumberofnormalandabnormalwereeoun— tedat0,6,12,I8,24handappropriatelyexpressedaspereentagevalue.Theresultswereshowedthat(i)Resuscitaterateofthawsemen at35?was68.8%,andsignificantlyhi曲erthanthatat44? Livabletime(54.2%)(P<0.O1),andnotsignificantlyhigherthan thoseofotherthreethawtemperature(P>0.05).(ii)Livabletimeofthawedsemenat38-44? lastedf0r38—39h,andthawedsemen werecompletelydeBdat40h.Moreover.livabletimeofthawedzemenat32? lastedhardlyfor36h.(iii)Thelivespermatozoacountof 收稿日期:2008一l2—30 基金项目:云南省应用基础研究 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 面上项目(2006CO068M); 云南省草地动物科学研究院院长基金项目(YNBP2006DF002); 云南省科技攻关与高新技术发展项目(2006HG23) 作者简介:和占星(1963一),男,云南丽江市人,副研究员,研究 方向:动物繁殖技术,E—mail:hezx81@126.corn,?为通讯作者. thawedsemenatOhwas42.5O%一5O.oo%.andtherewasnota significantdifferenceamongdifferentthawedtemperature(P>O.05); Thelivespermcountofthawspermatozoaat35.38and41?leftin roomtemperaturefor6.12and18hwereinturn45%,40%and 16.3%,andsignificanthierthanthoseat44?(尸<0.05),and therewasnotasignificantdifferenceamongthedifferentthawtemper- 1094西南农业学报22卷 atureoffrozenstrawsemenfor24hofplacement(P>O.05).(iv)Progressivemotilityofthawsemenat35?inOhwashigherthanthat ofat44?,32-41?washigherthan44oCin6h,38?Washigherthan44?in12h,32and41? Washigherthan44?(P<O.05) in18h.Andtherewasnotasignificantdifferenceamongdifferentthawsementemperatureuntil24hofsto rage(P>O.o5).(v)rnlemor- phologicalabnormality(%)ofthawspermat41?and44? were31.5%and31.7%,andsignificantlyhisherthanthoseat38oC(P <O.O1)and35? (P<O.05).Butabnormalityratesofthawspermwerenosignificantdifferenceamongthawedtemperatu reat32,35 and38? (P>0.05).Under32,41and44?,theabnormalityrateswerealsonotsignificant(P>0.05).Itsuggest edthattherewasless damageonthesemeninthetreatmentofthawtemperatureat35and38?.Theresultsindicatethatllvespermatozoacountandprogressive motilityofsemenwerereducedfastwithgraduallyincreasingthawtemperatureofstrawfrozensperm.A sthethawtemperaturewentup.the abnormalityrateofsemenwouldbeincreased.hcouldbeconcludedthattheidealthawtemperatureforstr awsemenofgayalWas38?3? forlOsbyawaterbath.Whenthetemperaturewaslowerthan18?.itdidnotaffectsemenprogressivemotilityofgayalleftintheroom temperaturef0r8ixhours. Keywords:Gayal;Spermatozoa;Thawtemperature;Progressivemotility;Abnormalities. 自Polge等…用甘油作为冷冻保护剂在一79? 保存牛精液并通过人工授精成功产下世界上首例牛 犊以来,牛冷冻精液技术得到迅速发展,并日臻成 熟.人工授精被认为是繁殖技术的一次革命,在牛 繁殖改良中发挥着极其重要的作用.解冻温度和解 冻时间对解冻后精液品质影响极大,最终影响人工 授精的受胎率J.国内有关解冻温度,保存温度对 牛精子品质影响进行了较多研究】,并在实际生 产中得到应用. 大额牛(Bosfrontalis)是一种半野生珍稀牛种. 主要分布于印度,缅甸,孟加拉国,不丹以及中国云 南高黎贡山的独龙江和怒江流域山区.大额牛的染 色体数目2n=58条,介于黄牛(Bostctttrus),瘤牛 (Bosindicus)60条和野牛(Bosgaurus)56条之间, 是Bos属中一个独立种.国外报道了大额牛母 牛的繁殖性能J,公牛采精方法?..,精液的冷藏保 存[1?,精子畸形率调查?,人工授精n等研究成 果.国内用电刺激法和假阴道法对大额牛进行采 精,并成功制作冷冻精液?H;婆罗门牛超数排卵 后用大额牛冻精人工授精成功获得发育良好的胚 胎,并获得首例大额牛与婆罗门牛的种间杂交牛 犊H引,随后获得批量杂交F代?,显示了大额牛 冻精在纯种扩繁和杂交利用中的应用前景.但由于 大额牛驯养难度大,野性强,不易采精,目前仅有1 头公牛的冻精,而且存量相当有限,如何提高精液利 用率等值得研究.目前未见国内外有关解冻温度对 大额牛精子活力及形态等影响的研究报道.本研究 旨在以肉,奶牛常用的解冻温度为基准,首次探讨大 额牛冻精用不同温度解冻后在室温保存对精子存活 时间,活率及形态的影响,从而筛选出适用的解冻温 度,为提高珍稀牛种冻精的利用率,人工授精的受胎率 以及在体内胚胎生产和体外受精中应用提供依据. 1材料与方法 1.1试验材料 大额牛细管冻精(规格0.25mL/支,原精活力 6O%,云南省家畜冷冻精液站生产,批号 19990311),液氮,解冻杯,Leica倒置显微镜,SONY 数码相机,血球分类计数器,中性福尔马林固定液, 磷酸盐缓冲液,姬姆萨原液和蒸馏水等. 1.2试验方法 1.2.1试验设计解冻温度设32,35,38,4l和44 ?共5组,每组4重复,每重复用同批次大额牛细管 冻精2支,共40支;解冻后的精液在温度(18.06? 1.50)?,相对湿度(46.644-4.52)%的室内保存40 h,并分别在解冻后0,6,12,18,24,30,36,38,39和 40h观察记录精子活率和活力;分别在解冻后0,6, 12,18和24h观察记录精子形态和数量. 1.2.2冻精解冻冻精按设计温度水浴10S解冻 后,用专用细管剪剪开封I21端,推出30—5Ol精液 于载玻片上,加盖玻片供活力检查用,再推一滴于另 一 载玻片上涂片后供染色之用,然后重新封口保存, 供下次时段观察. 1.2.3精子活率和活力观察在带有恒温板(事 先保温4O?)的显微镜下观察精子的活率和活力, 每片观察3个视野,按实验设计在每个观察时间段 每组各4片即4重复. 1.2.4精子形态观察?制片与染色:取用不同温 度解冻后的精液抹片,室内风干5一10min;用中性 福尔马林液固定15,20min,用清水漂洗固定液,室 内风干;用姬姆萨染液染色1.5h,随即用清水缓漂 染液,室内晾干待检.按实验设计的每个时间段各 抹片,染色一次.?观察与计数:将制备好的抹片在 显微镜(400X)下观察,每个解冻温度在每个观察 时间段各4片即4重复(每片观察3个视野),用数 码相机拍照完整的一个视野,每张抹片拍3个视野, 对每张照片进行编号记录,再将照片导人电脑,在电 脑显示屏上观察并记录各类形态精子的数量(事先 选用与电脑屏幕相同尺寸的透明塑料板,在上面用 记号笔画出10cmX10cm的方格,将其贴在屏幕 上).观察记录的畸形精子包括头过大,头过小,瘤 4期和占星等:解冻温度对大额牛(Bosfiontalis)精子活率及形态的影响 表1不同解冻温度对精子存活时间(h)及活率(%)的影晌 Table1Effectofthawingtemperatureonlivabletime(h)andlivespermcount(%)ofgayalspermatozoain normaltemperature 注:同行中不l司小写字母表不差异达5%显着水平. Note:Valueswithdifferentlowemaselettersinthesamerowmeanssignificantat5%leve1. 状头或梨形头,双头,无头,头部着色不良,顶体严重后的精子复苏率分别为60.40%,68.80%,62.50 异常,颈部倒折和卷曲,中段膨大,双条中段,中段卷%,62.50%和54.20%,以35?组最高,44?组最 曲,中段断尾,具原生质滴,无尾,双尾,尾部卷曲,尾低,两者间差异极显着(P<0.01),但与32?,38 部短小等.?和41?组比较差异不显着(P>0.05). 1.3统计分析2.2解冻温度对大额牛精子活率和存活时间的影 冻精的复苏率,活率,活力和畸形率的计算:复晌 苏率(%)=鲜精活力/解冻后精子活力×100%; 活率(%)=活动的精子数/总精子数×100%;活 力(%)=前进运动精子数/精子总数×100%;畸 形率(%)=畸形精子数/精子总数(正常+畸形) ×100%.用SPSS10.0软件包对试验数据进行 One—wayANOVA的分析,用Student—Newman-Keuls (SNK)f=匕较,用Excel2003进行百分率计算和卡方()(2) 检验.表中数据均采用平均数?标准误(?瑚n4-). 2结果与分析 由表1可见,冻精用32—44?解冻后在常温下 保存,精子存活时间在36—39h.冻精解冻后在各 保存时间段的精子活率如下:0h,以35?组最高, 但各组问差异不显着(P>0.05);6h,以35和4l? 组最高,显着高于44?(P<0.05),但32,35,38和 41?间差异不显着(P>0.05);12h,以38?组最 高,显着高于44c【=(P<0.05);18h,以41?组最 高,显着高于44?组(P<0.05);24h,32?组高于 35,44cI:组,但差异不显着(P>0.05);30h以上各 组问差异不显着(P>0.05). 2.1解冻温度对大额牛精子复苏率的影响2.3解冻温度对大额牛精子活力的影响 大额牛细管冻精用32,35,38,41和44?解冻解冻温度对大额牛精子活力的影响如表2所 表2解冻温度对大额牛精子活力(%)的影响 Table2Effectofthawingtemperatureonpmgressivemotility(%)ofgayalspermatozoainroomtemperat urestorage 注:同行中不同大,小写字母分别表示差异达到1%和5%显着水平. Note:Differentcapitalandlowercaselettersinthesamelowmeanssignificantat1%and5%levels,respec tively 1O96西南农业学扳22卷 表3不同解冻温度下大额牛精子头部,颈部和中部以及尾部畸形率(%)的变化 Table3’Thechangesofabnormalitiesofhead,neckmidpieceandtailofgayalspermatozo~withdifferent thawtemperature 注:同列中不同大,小写字母分别表示差异达到1%和5%显着水平. Note:Differentcapitalandlowercaselettersinthesamec~umnmeanssi~camat1%and5%levels.respec tively. 表4解冻后精液在常温下保存0,6.12,18和24h对精子畸形率(%)的影响 Table4Totalmorphologicalabnormalities(mean?s:,determinedbyaddinguptheabnormalitiesofhead ,neck,midpieceandtail)ofgayalsper- matozoaspost—thawedevaluatedat0,6,12,18and24hofinnormaltemperaturestorage 注:f司行中不f司大,小写字母分别表示差异达到1%和5%显着水平. Note:DifferentcapitalandlowercaselettersinthesameIOWmeanssignificantat1%and5%levels.respe ctively. 示,解冻后0h,35?组极显着高于44?组(P<0.随保存时间延长而增加,尤以保存18和24h的精 01),但与32,38和41?组比较差异不显着(P>0.子畸形率极显着高于0,6和12h(P<0.01);用35 05);解冻后6h,44?组显着低于32,35,38和41—44?解冻的精子畸形率并不明显地随保存时间 c【=组(P<0.05),32—41组问差异不显着(P>0.推移而增加(P>0.05);各保存时问段的平均精子 O5);解冻后12h,38oC组显着高于44?组(P<0.畸形率差异也不显着(P>0.05). 05);但其它各组间差异不显着(P>0.05),解冻后2.5采用数码照片在电脑屏幕上显示观察精子形 18h,32和41cC组显着高于44?组(P<0.05);解态的优点 冻后24h,各组间差异不显着(P>0.05).染色后的抹片在显微镜下观察,选定区域后用 2.4解冻温度对大额牛精子形态的影响数码相机逐一进行拍照记录,然后将照片导入电脑, 解冻温度对精子形态的影响见表3和图1.总按编号顺序在屏幕上观察精子形态,并记录正常和 精子畸形率以解冻温度35和38?组分别显着和极畸形精子数量方法的优点是:?观察直观,清晰;? 显着低于41?组(P<0.05)和44?组(P<0.01),不易引起视觉疲劳;?记数准确;?可将图片放大观 但32,35和38?组问差异不显着(P>0.05),32,察,提高判断准确性.为避免记录时出错,可采用拍 41和44?组间差异也不显着(P>0.05),表明用完一抹片,观察计数一片的方法. 35和38?解冻对精子形态损伤较小.另外,精子 头部畸形率以32?组显着高于44?组(P<0. 05),而精子尾部畸形率则44?组显着高于其它组 (P<0.05),表明解冻温度低精子头部畸形率高,解 冻温度高则尾部畸形率高,但解冻温度对精子颈部 和中段致畸率较小(P>0.05). 大额牛冻精解冻后在常温下保存时间对精子畸 形率的影响见表4.用32o【=解冻后的精子畸形率 3讨论 3.1解冻温度对精子复苏率的影响 本研究中大额牛冻精用35?解冻的复苏率达 68.8O%,38和4l?解冻的复苏率均为62.50%, 38?和41?解冻的复苏率与赵家才等用40? 2.0?解冻的复苏率(59.93%)基本一致;单从复 苏率分析,大额牛冻精解冻温度以35—38?为宜. 4期和占星等:解冻温度对大额牛(Bos加撒;z,s)精子活率及形态的影响1097 K N B A.正常形态Normalshape;B.无颈,尾Rupturedneckandtail;C.瘤状或梨状头Roundheadorpearhead;D.双头Doubleheed;E.双头并 中段弯曲Doubleheadwithbendmidpiece;F.头部发育不良Underdevelopedheed;G.顶体破裂,脱落Breakedandcastedacmsome;H.颈部 扭曲Distortedneck;f.头与颈间断裂Theneckofpartraptured;工颈与中段间断裂Themidpieceofpartraptured;K.中段弯曲Bendmid piece;L.中段扭曲Distortedmidpiece;M.外膜脱落Ectoblasteast;N.双中段(断裂)Doublemidpiece(ruptured)anddoubletail;O.中段和 尾部卷曲MidpieceandtcrminaUycoiled;P.无头Decapitated;Q.尾部弯曲Bendtail;R.尾部卷曲Terminallycoiled;S.原生质滴Protoplasm droplet.T.双尾,卷曲Doubletail,terminallycoiled;u.双头和双尾Doubleheadanddoubletail. 图1解冻后的大额牛精子形态 Fig.1Mo~hdogicalofgayalspermatozoapost—thawed 3.2解冻温度对精子存活时间和活力的影响研究所用大额牛冻精是1999年通过电刺激采精获 奶牛细管冻精用38?解冻后0,4?保存,精得的,冻精用35和41?解冻后在常温下保存6h的 子存活时间可达161h,13,16?保存能存活40h,精子活力与解冻时基本一致,保存12h的精子活力 24—27?保存仅能存活13hM,表明奶牛细管冻精为3O%左右,保存24h则降至1O%以下,到36h 以38?解冻,0—5oC保存效果最好;黑白花奶牛冻已接近0.提示虽然大额牛精液解冻后在常温下保 精用38?水浴15s解冻,在5,8?冰水中保存I2存12h仍具有较高的精子活力,但解冻后最好在6 h的平均活力(32%)极显着高于在37?恒温箱内h内完成输精. 保存4h的l6%;精子活力为75.3%的大额牛鲜牛细管冻精用4lcI=解冻后人工授精的情期受 精在4?保存12,24,36和48h,其精子活力分别降胎率(48.78%)显着高于35和47?,以41?2oC 至55%,4O%,3O%和15%,而大额牛细管冻精解15s解冻为宜[1引.然而,奶牛细管冻精用人体温3O 冻后在5—8?保存24h的活力为27.4,32.1min,40?20s,70oC5s和90oC4s解冻后人工授 %?.本研究中大额牛冻精用38—44qC解冻后在精的受胎率以9O4s解冻最高,40cI=20s最 常温下保存,精子存活时间可达39h,与傅春泉低引.可见,解冻温度和解冻时间合理组合也是非 等用38qC解冻奶牛冻精在13一l6?保存的精子常重要的.用38?10s解冻大额牛冻精对婆罗门 存活时间基本一致.说明解冻温度及解冻后保存温牛母牛进行人工授精,情期受胎率达58.20%J, 度对精液品质均有较大的影响,精子的存活时间随与本研究用35,4l?10s解冻后活力较高的结果 保存温度升高而缩短.同时也表明低温保存更有利相一致.大额牛冻精用7O,9O?短时或瞬间解冻 于延长精子存活时间和保持较高的活力-3-4,15].本能否获得更好的效果,尚待研究. lO98西南农业学报22卷 3.3解冻温度和解冻后常温下保存时间对精子形 态的影响 用75?2S解冻荷斯坦牛冻精的精子畸形率 (14.30%)显着低于用37?10s解冻的23.76% 和用15?20S解冻的25.62%,以75?短时解冻 效果最好J.本研究结果以32?解冻的精子畸形 率显着高于35和38?,但用4l和44?解冻的精 子畸形率则分别极显着和显着高于38和35?,可 能与解冻时间有关. 印度大额牛鲜精的畸形率为18.44%,其中头 部,中段和尾部的畸形率分别为9.08%,2.93%和 6.43%u引,说明鲜精的精子畸形率也较高,而且 头,尾部畸形率高于中段.本研究得到相同的结果. 即解冻温度低(32?)精子头部畸形率高,解冻温度 高(44?)则尾部畸形率高,解冻温度对精子中段影 响不大.同时研究表明,大额牛冻精解冻后的精子 畸形率并不随保存时间推移而显着增加,精子总畸 形率以用38?解冻的精子最低(26.3%),相当于 大额牛鲜精用卵黄稀释后在4?下冷藏60h的畸 形率26.32%,略高于用37?解冻荷斯坦牛冻精的 精子畸形率23.76%J. 荷斯坦牛和娟姗牛精液用液氮冷冻保存1个月 后的精子活力显着降低-1;夏洛来牛的精子畸形率 显着高于利木赞牛’加;冻后水牛精子正常顶体率比 奶牛少28.9%[211;野牦牛精子冷冻后仅颈部和尾 部畸形率达28.29%J.说明冷冻和冷冻保存时 间,解冻和解冻后保存温度,保存时间对牛的精子品 质均有影响,而且温度等因素对不同种,品种牛精子 的影响程度不尽相同.由于目前未见有关解冻温度 对大额牛精子畸形率影响的报道,需用不同批次的 冻精开展进一步的研究. 4结论 大额牛细管冻精用38qc水浴10s解冻的精子 复苏率和活力高,存活时间长,畸形率相对较低,解 冻后在18?左右常温下保存6h对精子活力影响 不大;当解冻温度超过41?时,虽然精子存活时间 相对较长,但活力下降速度快,精子畸形率偏高,提 示需缩短解冻时间.因此,大额牛细管冻精宜甩38 ?水浴10s解冻,气温低于l8?,解冻后可在常温 下保存6h. 参考文献: [1]PolgeC,RowsonLEA.Fertilizingcapacityofbullspermatozoaaf- terfreezingat-79?[J].Nature,1952,169:626. [2]MedesrosCM0,ForellF,OliveiraATD,eta1.Currentstatusof spermeryopreservation:Whyisn’titbe~er[J].Theriogenologe, 2002.57:327—344. [3]李淑坤,边风玉,刘彩兰,等.不同保存温度对解冻后细管冻精精 子存活时间影响的试验[J].黑龙江畜牧兽医,1992(5):7—8. [4]傅春泉,徐苏凌,徐玉花.提高奶牛冷冻精液效果的措施[J].中 国奶牛,2002(5):42-43. [5]b书海,孙志杰,李青旺,等.不同解冻方法对奶牛冻精活力的影 响[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2002,30(5):40 — 43., [6]聂德宝,李孝娟,郝爱玲,等.牛冷冻精液解冻后不同保存环境对 精液品质的影响[J].黑龙江动物繁殖,2008,16(1):37—38. [7]曾养志,单祥年,陈宜峰,等.我国大额牛的描述及其染色体的研 究[J].自然杂志,1979,2(11):662-663. [83单祥年,陈宜峰,罗丽华,等.我国黄牛属(80s)五个种的染色体 比较研究[J].动物学研究,1980,1(1):75—81. [9]GiasuddinM,HuqueKS.AlamJ.Reproductivepotentialsofgayal (BosFrontalis)undersemi?intensivemanagement[J].Asian—Aust J.Anim.Sci.,2003,16(3):331—334. [10]BhattachacyaHK,KumarSubodh,MondalSK,eta1.Estimation ofsomeseminalattributesofgayal(Bosfrontails)[J].TheIndian JournalofAnimalSciences,2004,74(5):514—515. [11]BhattacharyaHK,KumarSubodh,MondalSK,ctalRajkhowa Chandan.Aninvestigationonspermatozoaldefectsingayal8emen [J].TheIndianJournalofAnimalSciences,2004,74(5):516— 517. [12]DhaliA,Kanlnakal~lnM,MechA,eta1.Birthofthefirstgayal (Bosfrontalis)calfthroughartificialinsemination[J].Animal. 2006,2(6):879—882. [13]和协超,沈放,季维智,等.电刺激采集大额牛精液及其低温 冷冻的初步研究[J].兽类学报,2000,20(3):239—240. [14]赵家才,何华川,张翠兰.大额牛冷冻精液技术的研究[J].黄牛 杂志,2005,31(4):16—18. [15]和占星,张继才,亏开兴,等.大额牛冻精在瘤牛超排中的应用 效果及Fl代的亲子鉴定[J],中国农业科学,2008,41(8):2436 — 2441. [16]和占星,亏开兴,张继才,等.大额牛与婆罗门牛种间杂种优势 利用潜能研究[A].中国畜牧兽医学会动物繁殖分会第十四届 学术研讨会 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 集[C],2008. [17]汪友谊,何光中,张克凡,等.细管冻精不同解冻温度对受胎率 的影响[J].贵州畜牧兽医,2001,25(3):7. [18]赵文灵,张桂花.不同温度解冻精液对母牛受胎率影响的试验 [J].山西农业(畜牧兽医),2007.11:21-22. [19]Pate1KV,DhamiAJ,ChauhanMK,eta1.Freezability,enzyme leakage.andfertilityofbovinespermatozoa[J].IndianJournalof DairyScience,20oo,53(4):284—290. [2O]李俊杰,桑润滋,田树军,等.不同季节肉用种公牛精液品质与 生理常值,血清及精液生化指标相关关系研究[J].畜牧兽医学 报,2006,37(3):232—241. [21]刘铁铮,谢成侠.不同温度下水牛和奶牛精子微细结构与细胞 外酶活性的变化[J].南京农学院学报,1983,3:69—81. [22]阎萍,林金杏,郭宪,等.野牦牛精子超微结构的研究[A].中 国畜牧兽医学会动物繁殖分会第十四届学术研讨会论文集 [C].2008. (责任编辑谢晓慧)