氨基酸类阳离子脂质体的合成及其基因转染效率评价（可编辑）

氨基酸类阳离子脂质体的合成及其基因转染效率评价（可编辑） 氨基酸类阳离子脂质体的合成及其基因转染效率评价 分类号 密级 学校代码学号氨基酸类阳离子脂质体的合成 及其基因转染效率评价 .. ????, 指导教师姓名、职称盆壅茎塾撞鲎垡盐型鏊撞 .??? 湖南师范大学学位评定委员会办公室 二零一一年五月摘要 基因治疗在肿瘤治疗和遗传病治疗方面有很好的前景,引起了广 泛关注。基因治疗面临的最主要的难题是寻找一种高效、低毒的基因 转染载体,将基因药物导入特定的细胞中,并能稳定地维持其功能。 目前,基因载体一般分为病毒载体和非病毒载体。而阳离子脂质体是 非病毒载体中最有潜力的基因载体之一。 本 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 以氨基酸为原料,经月桂醇或正辛醇的酯化反应、氯乙酰 氯酰胺化反应和季铵化反应,合成了一系列包括.、 一 ??、?、、 .、...、?..和... 在内的八种氨基酸类阳离子脂质。 采用超声波分散技术,用二次蒸馏水将自合成的阳离子脂质分散 成阳离子脂质体,再将脂质体与质粒混合制备成脂质体/ 质粒复合物。用 激光粒度仪测定了各阳离子脂质体 和脂质体/质粒复合物的平均粒径、粒径分布和电位。调节 复合物的/比,使’电位与平均粒径等物理结构参数满足最佳 的细胞转染条件。 以制备的各种阳离子脂质体为基因载体,装载质粒,对 细胞进行体外细胞转染实验,并采用商用转染试剂 进行阳性对照。实验结果表明,由伊 丙氨酸、广缬氨酸、广甲硫氨酸和甘氨酸制备的含单一疏水长链的阳离子脂 质体,..、.一.、... 、..?,不论任何/比都没有转染效率。而含双 疏水长链的阳离子脂质体却具有较好的转染效率,且谷氨酸型阳离子 脂质体..的转染效率高于天冬氨酸型阳离子脂质体 ?。但是,疏水链长度为个碳原子的脂质体 ..和不含季铵盐头基及连接臂的脂质体.没有转染效 率。 以脂质体...为基因载体,装载质粒,对 磁、耶、、、.、.、、、 、.、、、、.和十五种 细胞系进行转染。用法检测该脂质体的细胞毒性。实验结果表 明,脂质体...能适用于大多数细胞系,且转染效率与 相当,甚至优于,是一种广谱、高效和低毒的基 因转运载体。 关键词:基因治疗,基因载体,阳离子脂质体,氨基酸,基因转染.. ? . . , ,?,, ,?,?,一 ,?? ?,?,../ , . / . . .., ,一? ?,,. / ???. ..。 , , ,,,,,,,,, . ,一 . ., : , 目 录 摘要. 。’?儿 第一章绪论 .基因治疗简介一 .基因治疗载体简介 .阳离子脂质类载体 ..阳离子头基的调控 ..疏水性尾部的调控 ..连接臂的调控? .论文的研究思路和主要内容? 第二章氨基酸类阳离子脂质的设计与合成? .阳离子脂质分子的设计??. .试剂与仪器?.. ..实验试剂 ..实验仪器. .实验内容.. 谷氨酸类阳离子脂质的合成.. .谷氨酸类阳离子脂质的合成?。 ..伊丙氨酸类阳离子脂质的合成??.. 缬氨酸类阳离子脂质的合成.. .. .甲硫氨酸类阳离子脂质的合成??一 ..甘氨酸类阳离子脂质的合成??。 ..广天冬氨酸类阳离子脂质的合成. .结果与讨论?。. 第三章 阳离子脂质体纳米粒子、脂质体/复合物的制备及其性 能测试. .试剂与仪器??. .实验内容? ..阳离子脂质体纳米粒子的制备。 ..脂质体/复合物的制备??.. ..阳离子脂质体纳米粒子的粒径和表面电位测定??. ..脂质体/复合物的粒径和表面电位测定?. .结果与讨论. ..阳离子脂质体纳米粒子的制各?。 ..脂质体/复合物的制备?. ..阳离子脂质体纳米粒子的粒径和表面电位测定 ..脂质本/复合物的粒径和表面电位测定?. 第四章氨基酸类阳离子脂质体/复合物的体外基因转染与毒性 研究.主要试剂与仪器?.实验内容..细胞的培养 ..体外细胞转染?。 ..阳离子脂质体的细胞毒性实验??.. .结果与讨论??.:? ..体外细胞实验?. ..细胞毒性实验第五章结论与展望 .结仑.展望参考文献.. 附录一?.. 附录 二?.. 。;,’.....?.?................................................. ........, 致谢??。 湖南师范大学学位论文原创性声明?。 湖南师范大学学位论文版权使用授权书??..氨基酸类阳离子脂质体的合成 及其基冈转染效率评价 第一章 绪论 .基因治疗简介 随着以重组技术为代表的现代分子生物学技术的发展,基 因治疗已成为近年来一种新的生物医学治疗技术。所谓基因治疗, 是指将正常的或有治疗作用的外源基因通过一定方式导入人的病变 部位的靶细胞,通过外源基因的正常表达,补偿缺陷基因,抑制异常 基因的表达,从而达到根本上治疗疾病的一种新型医疗方法【。 年,美国科学家实现了首例基因治疗,即用逆转录病毒载 体装载正常腺苷脱氨酶基因治愈了一名重度联合免疫缺陷病 患割。从此,世界各地掀起了对基因治疗研究的热潮。年,我 国成功实现了第一例基因治疗临床试验,治愈了两名血友病患者, 表明我国基因治疗研究起步较早【】。目前,基因治疗技术已经可以用 于治疗一些获得性或遗传性疾病,如重症联合免疫缺陷【,囊性纤维 化和帕金森病网,并为传统化疗法治疗癌症提出了另一种选择【】。至 年底,世界范围内基因治疗的临床试验 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 已达一千多个,表 明基因治疗的发展越来越快,具有良好的发展前景。 基因治疗技术面临的首要挑战是研究出一种方法把治疗用的基 因安全、高效地运到病变部位的靶细胞或组织中去并且稳定地表达, 而这在很大程度上取决于基因治疗所用的载体系统。所以,安全有效 的新型基因载体的发现、合成与研究成为基因治疗的关键之一。 .基因治疗载体简介 硕士学位论文 目前,基因治疗载体主要分为病毒载体和非病毒载体两大类。理 想的基因载体需要具有三个最基本的原则:避免治疗基因在细胞 内被核酸酶降解;装载治疗基因穿过目的细胞的细胞膜并且进入 细胞核;没有毒副作用忉。 最先研究的是病毒载体,包括逆转录病毒、腺病毒嘲、腺相关病 毒、痘病毒、单纯疱疹病毒等【】在临床应用上,病毒载体占据主导 地位,因为病毒载体可以高效地介导基因转染,并且基因表达持续时 间长。虽然满足理想载体两个基本原则,但是具有很高的毒副作用。 在基因治疗临床试验中急性免疫反应强,自身免疫原性高,可随机整 合于宿主基因组中,活化癌基因,患者生命安全受到严重威胁,病毒 载体的实际生产与临床运用受到极大挑战。年,美国宾夕法尼 亚大学一项临床试验中,用重组腺病毒为基因载体治疗鸟氨酸转氨甲 酰酶缺乏病,致使一名志愿者不幸死亡【。因此,近年来非病毒基因 治疗载体的研究倍受学者的关注。 非病毒载体的优点有:无免疫原性,毒性较小,外源基因整合率 低;对装载基因的种类和大小没有限制,甚至还可装载细胞核或染色 体,容量大;制备容易,重复性好,可以大规模生产;具有一定的特 异靶向性。尽管非病毒载体具有一定的优势,但总体来说,非病毒载 体相对于病毒载体基因转染的效率低,基因表达持续时间短尤其在 体内.等一系列问题,这些就是非病毒载体的研究重点。 非病毒载体目前主要包括裸、阳离子聚合物载体以及最常 用的阳离子脂质体等【】。裸介导的基因治疗是最简单的一种治 氨基酸类阳离子脂质体的合成及其基因转染效率评价 疗形式,能够转染大多数细胞,易大量制备。但是转染效率低、稳定 性差,靶向性也差。阳离子聚合物载体有很多种,包括聚乙烯亚胺 、聚赖氨酸、多聚精氨酸、壳聚糖及其衍生物和糖类聚合物等。 聚乙烯亚胺作为转基因载体己用于不同给药途径的基因转移,如肾动 脉内给药、脑内注射和静脉注射,研究结果表明,其转染效率较高, 但基因表达的时间较短,给药后天已不能检出。等【】使 用天然高分子壳聚糖及其复合物制备纳米颗粒,获得了具有良好生物 相容性的转基因载体,但结果表明该载体的导入效率偏低。体外及少 量的体内实验均已证实阳离子非病毒转基因载体具有较好的转基因 效果,但由于阳离子多聚物与结合力较强,进入体内后仅有少 量释放出来而进行表达,大部分仍紧密结合在阳离子多聚物中, 导致其转染效率偏低,成为限制阳离子型聚合物非病毒转基因载体临 床应用的瓶颈。阳离子脂质载体是目前研究最透彻、技术最成熟、转 基因机制明确、应用最广泛的转基因技术【】。本文主要讨论阳离子脂 质载体。 .阳离子脂质类载体 脂质体介导的基因转染是最早将外源基因导入宿主细胞的技术 之一。上世纪年代,大量研究表明脂质体可以与细胞膜发生膜融 合,到年,报道了很多用脂质类载体介导外源球蛋白, 、染色体【】和】进入宿主细胞的文章。胸苷激酶基因在 细胞中的成功表达表明脂质体介导基因转染细胞技术的稳定形成。直 到年人们用“脂质转染来表述脂质体介导的基因 硕士学位论文 转染。常见的商用阳离子脂质体有.,;油酰氧基丙基】?, ?,甲基氯化铵、,一二油酰氧.【精胺羧基酰胺乙 基】. .二甲基..丙基.三氟乙酸铵‘、,.二油酰基.一三 甲胺基丙烷‘川和双十八氨基甘氨酰精胺‘?。图 叱 。卟, 八\/飞/\/~/武?、/\~ 掣儿。?~~.入~ /\/\/\/\/\/\/\/\/ 女一科~??~??? ” \ \/八/\/~卢式\/\/\~ 蠹一卤?趟~.? \ 。一 阳离子脂质体的转染机制已经阐明【。首先,带正电的阳离子脂 质与带负电的通过静电作用形成脂质体/复合物。然后, 氨基酸类阳离子脂质体的合成及其基因转染效率评价 脂质体/复合物进入细胞质,最初认为是直接通过细胞膜融合作 用【矧,但是现在已经证实脂质体介导基因转染主要是通过内吞作用 【。复合物经细胞内吞摄入后,阳离子脂质体复合物使内体膜去稳定 化,从而触发磷脂重组。这些磷脂然后扩散到脂质体中,并和脂质体 相互作用,从而从载体系统中解离而进入细胞质中,部分 进入细胞核并成功表达,补偿或替代病变基因,从而达到治疗疾病的 目的【。 阳离子脂质体包括三个部分:亲水性的阳离子头部、疏水性尾部 和连接两部分的连接臂。阳离子头部的正电荷可与上的负电荷 发生静电作用,是形成脂质体/复合物的主要作用力。疏水尾部 对形成脂质体稳定双分子层很重要。连接臂的长度与种类也会影响转 染效率。新型脂质体的合成无非是调控这三个部分的化学结构,先后 合成出、和.三种商用阳离子脂质体。多聚 胺阳离子脂质的构效关系呈现两个主要趋势:阳离子头端的密度 和性质影响脂质转染性能;对于给定的头基,烃类成分可以被操 控,但不可预见其对基因转染,台日匕的影响阳。 ..阳离子头基的调控 一些研究小组将阳离子头基的一价铵离子用不同的一价阳离子 替换。例如,和等将含膦的季铵盐脂质体中的铵离子 用磷或者砷来代替。等正利用这种衍生方法用磷、砷代替依地 福新和米替福新的铵根,既保持了这些药物的抗癌作用又大大降低了 毒性【。毒性降低是因为砷和磷的原子半径比氮大,使得脂质体复合 硕士学位论文 物粒径变大,电荷密度降低。并且】和/等证实含膦 的季磷盐脂质体与含膦的季砷盐脂质体的细胞毒性明显低于含膦的 季铵盐脂质体。而且实验证明衍生的磷、砷脂质体用于体外转染 细胞,转染效率随膦酸酯与阳离子头部间的亚甲基的数目的增加 而增加。磷、砷脂质体用于基因的体内转染,转染效 率是的倍【。除了将氮原子替换成磷和砷,还需要将 铵根离子替换成生物相容性更好的胺类。课题组将阳离子头 部构建成吡啶盐,可以离域阳离子的电荷,从而降低脂质体的毒性。 用吡啶盐类脂质体做基因载体体外转染细胞,转染率是的 ’ 至倍【】。 课题组将阳离子脂质体典型的铵官能团替换成尿苷,形 成新型的阳离子核苷脂质,试图提高转染效率。这些复合物除了阳离 子的铵与上阴离子的磷酸基团可发生静电作用外,还能够通过 氢键和.堆积作用与碱基对发生作用。尿苷类脂质结合 的能力比小,但毒性比低。令人失望的是,尿苷类 脂质体的转染效率明显低于与,可能是因为每个脂 质体结合的分子的数目较少或者释放在细胞质中而不是 细胞核中【。但是,提高脂质体/比例可提高基因转染效率,尤 其是.乙基二油基尿苷两亲化合物。 除了替换一价的阳离子铵脂质体外,只修饰部分铵也可以改变转 染效率。研究表明,单价阳离子脂质体的基因转染效果与其亲水的头 部有关【。脂质体的不稳定性导致阳离子脂质头基的水合程度降低, 氨基酸类阳离子脂质体的合成及其基因转染效率评价 这种不稳定可以提高复合膜融合的程度【。将三甲基铵盐中的一个甲 基用羟烷基代替也成功用于基因转染,羟乙基衍生的、 /.和四癸基铵类脂质体比各自甲胺类脂质体的转染率 都要高些。另外,以乳酬、阿拉伯糖或木糖踟为原料合成的羟乙基 铵盐的转染效率与未修饰的铵盐的转染率相比,前者更高。又有研究 发现,替换羟乙基修饰的脂质上的羟基形成伊铵乙基可以提高转染效 率【。 因为增加阳离子基团的数目可以提高脂质体与的结合率 【加,所以将阳离子头部基团从单价变为多价的研究对提高脂质体介导 基因转染的效率尤为重要。最早研究出的多价脂质体是胆固醇【和 类。等证实线形多价阳离子头部氨基基团间的间距 对转染效率有重要影响【。例如,有四个氨基阳离子头部的阳离子脂 质体的转染效率随着氨基间的间距的减小而降低......。 这个趋势可能是由于间距较短的阳离子脂质体在为.的条件下 净正电荷减少。此外,对于在为.时,有相同净电荷的阳离子 头基越易分散电荷的化合物转染效率越高......图。 和等认为这个特性对支链头基也很重要【。但是需要指 出的是如果增加的氨基基团导致脂质体的构型发生折叠,就会降低转 染效率。 图.糖类阳离子双子表面活性剂的合成路径 . . 氨基酸类阳离子脂质体的合成及其基因转染效率评价 除了直线形和支链多价头基外,还有树状阳离子头基的脂质,与 传统商用转染试剂相比后者在基因转染方面意义更深远图.。 等合成了树状脂质用于转染。头基代数较高的脂质可 以提高转染率,因为它有较高的缓冲能力【轫。如果将第三代 树状脂质与以:的比例混合,在有血清的存在下转染效果 好于和。若将链接到头基表 面,对血清的稳定性会增强。等也合成了多鸟氨酸树状脂质 用于转染。当第二代多鸟氨酸树状脂质与,.二油酰基.甘油磷脂酰 胆碱混合再结合,在阳离子脂质摩尔分数较小时脂质 体复合物比/复合物的转染率高【。等研究了。 多胺类树状两亲分子的转染效果。这些有阳离子树状头基的两亲分子 的转染效率比、和的转染率高。有人认为这是 因为树状头基有高的表面电荷可以提高缓冲能力【。 。 厶:工?嗍: 基《斜厂々?谣 地 州一锚~:弋?? 乙酸脱去其余氨基的保护。实验证明,在体内和体外都有 很好的转染效果【。在以后又合成出很多氨基糖苷类脂质 体。最近氨基糖苷类脂质体成功的运用于的传递与干涉【。 氨基酸类阳离子脂质体的合成及其基因转染效率评价 除了氨基糖苷类脂质体,有阳离子肽头基的脂质体也可以与商用脂质 体媲美。 ?.,?,.。, 姆洲?? 坚嫦 ’ 。蹴 ./ 堕曼坐型塑竺丝竺竺塑:坠型 旧 图. 的合成路径 . . ..疏水性尾部的调控 一些研究表明阳离子脂质脂肪链的长度和种类会影响脂质体的 转染效率。基于、甘氨酸甜菜碱【】、烷基酰基肉碱酯【、乳 酸和类衍生物的基因转染效率表明,转染率随着脂肪链长度 的增加而降低。而等发现精胺类脂质体的转染 效率与链的长度无关。和也发现用聚胺类脂质体装载基 因转染细胞和细胞时,转染率随着烷基链碳数从到 的递减而降低,毒性随着烷基链碳数的递减而增强。等研究 发现聚酰胺.胺类树状脂质体的基因转染率,烷基链个 碳的高于个碳链的,尤其是在有血清的情况下【。和 ”硕士学位论文 等以岛.三赖氨酸类双子表面活性剂为基因载体,发现烷基链 越长转染效率越高,但以口,口.三赖氨酸类表面活 性剂为载体,最长烷基链的转染效果还不及,相连的最短烷基链的 效果,说明要具有良好的转染效率既要有合适阳离子头基也要有合适 长度的疏水尾部。一些研究还表明引入两条不同长度的疏水链,可通 过改善内体逃逸性能,潜在地提高转染效率【刀。 提高转染率除了可以改变脂肪链的长度和种类,还可以选择不同 的疏水链图.。黄等用胆固醇和类固醇类代替阳离子脂质体中脂 肪链,是出于疏水链刚性、生物降解能力和膜融合力的考虑。归因于 刚性,特别是胆固醇的衍生物脂质体在雾化时表现出很好的稳定性, 从而使这些类似物更有利于气溶胶基因传趔。此外,使用基于胆汁 酸的阳离子双亲体,具有显著的体外转染效率【。这些表面两亲分子 能通过与膜穿透肽同样的途径提高基因的摄取,但毒性低,便宜易得 且更稳定。在基因转染试剂中,这些胆汁酸类阳离子表面两亲物有一 个特性一抗菌性酬。丁二炔类脂质体代替线性脂肪链成功于介导基因 转染【。此外,四烃基类表面活性剂也成功用于基因转染,这种脂质 体成锥形可促进内涵体膜融合【。这些化合物的基因转染效果都要高 于?,油烯基.?二甲基氯化铵。另外,高氟代烷基链 脂质体也成功应用于基因转染,因为它们不会与亲水性和亲脂性生化 物发生作用【。 氨基酸类阳离子脂质体的合成及其基因转染效率评价 ~~足 胆甾烷类脂质体 , 胆酸类脂质体 胆汁酸类脂质体 丁二炔类脂质体 \,,\/\/、/\/一、、/\/、、/\/ ,.沙~八/\/\?八/叭 /\ ? ‘艮???~个~?撼/ /、?、?、?、一一、?、,一、一一、?、 四烷基链类脂质体 高氟代类脂质体 图疏水链修饰后的两亲结构 . . ..连接臂的调控 用于基因转染的脂质体中,疏水部分和阳离子部分需要连接臂连 接,连接臂通常有氨、氨基甲酸酯、酯和醚。醚做连接臂有很好的稳 定性【明,避免进入细胞前就裂解;而酯一旦进入细胞就会裂解嗣,便 于释放;氨基甲酸酯既有稳定性又会易裂解。设计可裂解脂质 体化合物非常有意义,内吞后它可以轻松地释放出。这种可 裂解连接臂包括光敏感型、.敏感型、氧化还原反应型,酶降解型 等。而光可分解的连接臂更适合用于基因转染【剐,因为生物刺激释放 更有优势,不需要外在刺激诱导分解。敏感的连接臂包括乙烯基 醚【、缩酮、原酸酯和酰腙【】也成功应用于转染。酯可先转化为不稳 定的连接臂,这样才会成功运用于基因转染。最近研究显示,酯连接 硕士学位论文 臂的种类对转染率有很大影响【】。 .论文的研究思路和主要内容 基因治疗成功的关键是高效低毒的基因载体,非病毒载体中最受 关注的是阳离子脂质体,它具有亲水亲油特性,有低毒、低免疫反应、 易合成和靶向性等优点。氨基酸是生物功能大分子蛋白质的基本组成 单位,具有很好的生物相容性和生物可降解性。研究发现以氨基酸为 基础的阳离子脂质体在水相中能成形囊泡状或双层片层结构,其带正 电荷的亲水端可通过静电作用结合核酸药物,带长链的疏水端可与细 胞壁膦脂双分子层结合,通过融合内吞作用实现核酸药物从胞外到胞 内的转运。我们以氨基酸为母体设计合成了多种氨基酸类阳离子脂质 体,本论文主要工作着重于以下几个方面: 以不同的氨基酸为原料经月桂醇或正辛醇的酯化,氯乙酰氯的酰 另人 胺化和三甲胺的季铵化三步反应合成一系列碡.水链的数目、疏水链的 爿、 / /、“工 、拶、?工二 儿?,?一慑一三厶~肚上口,呐 长度、亲水性阳离子头基和氨基酸种类各有差异的阳离子脂质。采用 、 表征中间体与最终产物的结构。 将合成的阳离子脂质制备成阳离子脂质体,再与质粒混合 制备成脂质体/复合物。用激光粒度仪测定各阳离子脂质体和复 合物的平均粒径、粒径分布与电位,并通过调节脂质体与质粒 的/比将粒径与电位等物理结构参数满足最佳的细胞转 染条件。 以合成的阳离子脂质体为载体,装载质粒对人胚 肾上皮细胞进行体外转染实验,评价各阳离子脂质体的细胞转染效 氨基酸类阳离子脂质体的合成及其基因转染效率评价 率,探讨转染效率与阳离子脂质结构、复合物粒径和电位的关系。 再用转染效率较好的脂质体为载体,对非致瘤性人乳腺上皮 细胞、人胚肾细胞、人肺癌细胞、.精原细胞、 .人胃粘膜细胞、纤维肉瘤上皮细胞、人脐 静脉内皮细胞、人胶质瘤细胞、.鼠前脂肪细胞、 人结肠癌细胞、鼠胚胎成纤维细胞、子宫 颈癌细胞、.人乳腺癌细胞和人结肠癌细胞多种细 胞系进行转染,评价脂质体是否具有广谱性。并且用法检测脂 质体的细胞毒性。探讨各阳离子脂质在基因治疗中的应用前景。 硕士学位论文 第二章 氨基酸类阳离子脂质体的设计与合成 .阳离子脂质分子的设计 根据文献综述,目前已经合成出的阳离子脂质载体的结构一般包 括三部分:由烷基链组成的疏水端、季铵盐类阳离子头基组成的亲水 端以及连接疏水端和亲水端的连接臂。疏水部分的烷基链可以是饱和 长链也可以是不饱和长链,其中碳原子数目一般在到之间。连 接臂种类很多,常见的有醚键、酯键和酰胺键等。醚键较稳定,不易 断裂,做脂质体装载基因进入细胞,转染效率好,但是不易生物降解, 在细胞内积累增强细胞毒性。酯键不稳定,易断裂,做载体细胞毒性 较小,但是转染效率低。 根据以上分析,设计以氨基酸为原料,首先与月桂醇或正辛醇发 生酯化反应生成碳原子数为或的饱和长链疏水端文献 报道碳原子数为的阳离子脂质载体的转染效果最好,碳原子数为 和的效果都不理想【倒。若以一元羧酸类氨基酸为原料经过酯化 反应则生成一条疏水链,以二元羧酸类氨基酸为原料则生成两条疏水 链。一元羧酸类氨基酸选广甲硫氨酸、卢丙氨酸仔、缬 氨酸和甘氨酸,二元羧酸类氨基酸选谷氨酸和天 冬氨酸。其次,氨基酸的氨基与氯乙酰氯发生氯乙酰化反应, 使得连接臂为细胞毒性小且转染效率高的酰胺键。最后,酰胺与三甲 胺发生季铵盐化反应生成亲水端的季铵盐。即合成出了多种氨 基酸类,不同碳原子数,不同碳链数的阳离子脂质表.。 具体合成方案图?: 氨基酸月桂醇或正辛醇酯的合成 方法一:在反应瓶中依次加入定量的氨基酸、月桂醇或正辛醇 和一水合对甲苯磺酸,再加入溶剂甲苯,回流分水,检测,适时 恍 恍 ??旦业 儿 ????????????? ??/?啦 ’ 。 ?支 ?? 帐 图氨基酸类阳离子脂质的合成路线 ? . . ?氯乙酰基氨基酸酯的合成 将氨基酸醇酯盐酸盐或氨基酸醇酯加入反应瓶中,加入溶剂二氯 甲烷或?,甲基甲酰胺搅拌溶解,再加入适量三乙胺或吡啶实验 氨基酸类阳离子脂质体的合成及其基因转染效率评价 证明加入吡啶反应不能发生,室温搅拌片刻。降温至。,用注射器 缓慢加入定量氯乙酰氯,加毕,撤去冰浴,常温搅拌反应。检测, 适时停止反应,蒸出溶剂。二氯甲烷溶解,用水洗涤三次,有机层浓 缩,柱层析分离,得?氯乙酰基氨基酸酯。 ‘ 氨基酸酯季铵盐脂质的合成 将?氯乙酰基氨基酸酯加入圆底烧瓶中,加入溶剂四氢呋喃搅 拌溶解,加入定量三甲胺水溶液,常温或适当加热反应。检测, 适时停止反应,蒸出溶剂。柱层析分离,得氨基酸酯季铵盐。 .试剂与仪器 ..实验试剂 硕士学位论文 国药集团化学试剂有限公司四 上海振兴化工有限公司娘 天津市大茂化学试剂厂 上海山浦化工有限公司娘 天津市大茂化学试剂厂 天津市大茂化学试剂厂四 天津市大茂化学试剂厂 上海山浦化工有限公司四 国药集团化学试剂有限公司娘 天津市大茂化学试剂厂 天津市大茂化学试剂厂. 生产厂商 北京塞多利斯天平有限公司 郑州长城科工贸有限公司 上海司乐仪器有限公司 郑州长城科工贸有限公司 公司 .和.一.的合成 向 圆底烧瓶中依次加入谷氨酸. ,. 、月氨基酸类阳离子脂质体的合成及其基 因转染效率评价 ,. 桂醇. 、一水合对甲基苯磺酸. ,. 和甲 苯 ,回流分水 ,直到反应混合物变得澄清,酸乙酯: 甲醇:检测,反应已完全。蒸出甲苯,残留物用二氯甲烷溶解, 依次用%的碳酸钠水溶液和蒸馏水洗涤,有机相用无水硫酸钠干燥, 蒸出二氯甲烷。残留物用丙酮溶解,向丙酮溶液中滴加少量稀盐酸 /,有白色固体析出,抽滤,真空干燥,即得谷氨酸双月桂醇 酯盐酸盐. ,. ,.%。 ,, :., ,,.?., ,一, , 。,.?., ’一,.., ,‘一, , .., ,一,.?., ,. ,一. ,., ,, :. ,一, . ,一,.,. , ,. ,一唧, . ,一 , ,.,.,.,.,.,.,.,.,. ,, , ,. ,,. 一. 向 圆底烧瓶丁力.谷氨酸双月桂醇酯盐酸盐. , . ,. 和二氯甲烷 。搅拌溶解后,再加入三乙胺. ,. ,搅拌 。降温至,缓慢滴加氯乙酰氯. , , .%。 ,,:.,氨基酸类阳离子脂质体的合成及其基因转染效率评价 ,.?., ,‘, .., ,一,一‘, .., , ,。,.?., 。,.., , , ,.., ,,., . ,. ,,:.,., . ,一。, , 。,一‘,. ‘,. ,,.,. , 。,一。,.,.,.,.,.,., .,.,.,. ,, ,. ,. .. 谷氨酸类阳离子脂质...的合成 向 的单口烧瓶中依次加入一谷氨酸. ,. 、 叱. 正辛醇. 、一水合对甲基苯磺酸. ,. 和甲苯 ,.回流分水反应,乙酸乙酯:甲醇:检测, 后反应已完全。蒸出甲苯,二氯甲烷溶解,依次用%的碳酸钠溶 液和蒸馏水洗涤,有机相用无水硫酸钠干燥,蒸出二氯甲烷。柱层析 分离,得谷氨酸双正辛醇酯. ,. ,.%。 谷氨酸双正辛醇酯. ,. 、干燥的二氯甲烷 。 和胺. 儿,. 圆口烧瓶中,搅拌 依次加入 缓慢加入氯乙酰氯. ,. ,常温搅拌 ,油醚:, ,.,.,.,.,.,.,. , ,,. ,. ,. ..伊丙氨酸类阳离子脂质的合成氨基酸类阳离子脂质体的合成及其基因转 染效率评价 向 的三口烧瓶中依次加入伊丙氨酸. ,. 、 ,. 月桂醇. ,向反应液中通入干燥气体, 酸乙酯:甲醇:检测, 后反应已完全。向反应液中加乙酸 乙酯,有白色固体析出,抽滤,真空干燥,即得伊丙氨酸月桂醇酯. ‘ ,. ,.%。 向 单口烧瓶中加入肛丙氨酸月桂醇酯. ,. , 和干燥?,?二甲基甲酰胺 ,搅拌溶解,再加入三乙胺. . 儿. ,搅拌 。缓慢加入氯乙酰氯. ,常温搅 拌 ,石油醚:乙酸乙酯:检测,原料已反应完全。浓 缩,二氯甲烷与水分液,有机层用无水硫酸钠干燥,浓缩。柱层析分 离,得?氯乙酰基.肛丙氨酸月桂醇酯. ,. ,.%。 ,一,., ,,:., ,. ,,., ,, ,. ,一 .., ,,., ,.., ,,.?., ,. ,一,., ,一. 向 圆口烧瓶中.氯乙酰基.伊丙氨酸月桂醇酯. , . ,. ,四氢呋喃 ,搅拌溶解,再加入三甲胺. ,常温搅拌 。浓缩,柱层析分离乙酸乙酯:甲醇:, 得白色固体肛丙氨酸月桂醇酯季铵盐. ,. ,.%。 ,,:., ,‘, ,. ,. , ., ,,.,,. ,., ,. 向 圆口烧瓶中加入缬氨酸月桂醇酯. ,. 氨基酸类阳离子脂质体的合成及其基 因转染效率评价 . 和干燥的二氯甲烷 ,搅拌溶解,再加入三乙胺. 。缓幔加入氯乙酰氯. ,. ,常温搅拌 ,搅拌 ,石油醚:乙酸乙酯:检测,原料已反应完全。浓缩, 用二氯甲烷溶解,用水洗涤,有机层用无水硫酸钠干燥,浓缩。柱层 析分离,得?.氯乙酰基.缬氨酸月桂醇酯. ,. ,.%。 ,,:., ,.,. , , ,一,.., ,., , ,一,.?., ,.., ,,.?., ,. ,一,., ,二 ,. ,一. ,., 向 圆口烧瓶中加入?.氯乙酰基一缬氨酸月桂醇酯. , . ,. 和四氢呋喃 ,搅拌溶解,再加入三甲胺. ,常温搅拌 。浓缩,柱层析分离乙酸乙酯:甲醇:, 得无色粘稠液体缬氨酸月桂醇酯季铵盐. ,. ,.%。 ,. , ,, :., ,. 一,., ,一一, ,? .?., ,一,.?., ,一 ,., ,一,.., ,.?., ,一,.. ,. ,一 , ,,., ,. ,., ,..,. 后,往反应液中缓慢加入氯乙酰氯. 。继续常温搅拌 后, 反应,用刁油醚:乙酸乙酯:监测反应。反应 反应基本完全。过滤,浓缩,固体干燥即得?.氯乙酰基.广甲硫氨酸 月桂醇酯. ,. ,.%。 ,, :., ,一,.?., ,,., ,. ,,., ,,氨基酸类阳离子脂质体的合成及其基因转染效率评价 .?., ,一,.?., ,一?, ., ,一,.?., ,一一,.?., ,一,.?., ,, ,. ., ,一. 向 圆底烧瓶中依次加入?氯乙酰基.甲硫氨酸月桂醇 ,. 酯. ,. 、四氢呋喃 和胺. , 滴加三甲胺时,溶液将渐变为酒红色,常温搅拌反应。用乙酸 后,反应基本完全。蒸出四 乙酯:甲醇:监测反应。反应 氢呋喃,将旋蒸后的剩余液用柱层析的方法选用的固定相为硅胶, 洗脱剂为甲醇进行分离。即得无色粘稠液体,甲硫氨酸月桂醇酯季 铵盐. ,. ,.%。 ,,: ,. ., ,一,.., ,一 , .., ,一,.., ,一,., , ,. , 一,., ,一,.., ,.., ,,. ,. , ,.. ,, ,一 :. ,一,. , , ‘,. ’,. ,. ,一‘,. ,一, . ,,. ,一,., .,.,.,.,.,.,.,. ,一 ,,. ,,.