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蚯蚓虫蚓激酶和复合氨基酸的提取分离纯化及活力的研究.doc

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上传者: 自-浮生未 2017-10-24 评分 0 0 0 0 0 0 暂无简介 简介 举报

简介:本文档为《蚯蚓虫蚓激酶和复合氨基酸的提取分离纯化及活力的研究doc》,可适用于高等教育领域,主题内容包含蚯蚓虫蚓激酶和复合氨基酸的提取分离纯化及活力的研究蚯蚓虫蚓激酶和复合氨基酸的提取分离纯化及活力的研究::,,,::::,,西华大学学位论文独创性声明符等。

蚯蚓虫蚓激酶和复合氨基酸的提取分离纯化及活力的研究蚯蚓虫蚓激酶和复合氨基酸的提取分离纯化及活力的研究::,,,::::,,西华大学学位论文独创性声明作者郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知,除文中已经注明引用内容和致谢的地方外,本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果,也不包含其他已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。若有不实之处,本人愿意承担相关法律责任。学位论文作者签名:复缸一一日期:誓翥篇:移刁乞日期,,‖,西华大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,在校攻读学位期间论文工作的知识产权属于西华大学,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅,西华大学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复印手段保存和汇编本学位论文。保密的论文在解密后遵守此规定学位论文作者签名:撕壮絮胳谚翻易日期:乒肛,幻日期彦吖,“’一西华大学硕士学位论文摘要蚯蚓是一种常用的动物药材,其体内含有丰富的蛋白质和活性物质。蚯蚓与人类关系十分密切,除作为传统中药外,还可提取蚓激酶、多种氨基酸等活性成分。蚓激酶是从蚯蚓中提取的一类具有纤溶酶活性的蛋白质,具有溶解血栓的作用,是目前最具有开发前景的纤溶药物之一。蚯蚓体内含还有多种氨基酸,本文采用多种酶水解法对蚯蚓提取物中蛋白浆液水解,研究了蚯蚓中的复合氨基酸。本文主要综述了目前研究现状,对蚯蚓部分有效成分开展了基础研究。本论文采用分级盐析法对赤子爱胜蚯蚓中蚓激酶的提取工艺进行研究,通过纤维蛋白溶解圈面积和蚯蚓蛋白质含量的比值来表征蚓激酶的比活力。并通过单因素实验设计研究了提取缓冲液、第一次盐析硫酸铵浓度、第二次盐析硫酸铵浓度对蚓激酶提取的影响,并用测定了酶的分子量,并探讨了金属离子对酶活力的影响。在复合氨基酸的制备中,对蚯蚓进行了脱脂、脱色、除臭试验进行了研究,选取提取温度、水解时间、、底物浓度对水解条件的影响。并采用正交实验设计考察最佳提取温度、最佳提取时间、最佳、最佳底物浓度,优化了提取工艺条件。蚓激酶的提取工艺结果表明,蚓激酶的最佳提取条件为:缓冲液为,第一次盐析时最佳饱和硫酸铵浓度为,第二次盐析硫酸铵浓度为,此条件下蚓激酶的比活力最高。提高酶活力的离子为、、孑、、,而为抑制剂。通过电泳实验可知,蚯蚓中提取的蛋白质的分子量分布很广,从到都有分布,主要分布在、、和附近。通过对蚯蚓的脱脂、脱色、除臭试验研究,得出以下结论:就脱脂、除臭、脱色的方法而言,索式提取法优于浸提法。就溶剂的脱脂、除臭、脱色的性能而言,研究所选溶剂以丙酮最佳。当以丙酮为溶剂时,索式提取法、液固比为:的条件下,回流时间的延长对脱色、脱脂、脱臭无影响,均可获得白色、无臭的蚯蚓蛋白,脱脂率可达而无水乙醇在相同条件下索式提取法、液固比为:,回流时间的延长对脱色无影响,对脱脂效果微有增长,但除臭效果甚差,不能根除腥味。本实验采用多种蛋白酶对蚯蚓浆液进行水解,由于不同蛋白酶的酶切位点不同,这样就可以使水解更为彻底。中性蛋白酶水解蛋白浆液,在底物浓度为,调节为左右,保持温度为,水解后,测得氨基氮含量为蚯蚓中蚓激酶和复合氨基酸的提取分离纯化及活力研究碱性蛋白酶水解蛋白浆液,在底物浓度为,调节为左右,保持温度为。,水解后,测得氨基氮含量为胰蛋白酶水解蛋白浆液,在底物浓度为,调节为左右,保持温度为。。,水解后,测得氨基氮含量为关键词:蚯蚓蚓激酶复合氨基酸提取综合利用西华大学硕士学位论文,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:,,,,孑十,,如巩,,,,:,,,,,,:,,,,,蚯蚓中蚓激酶和复合氨基酸的提取分离纯化及活力研究蠡,:,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,:西华大学硕士学位论文目录摘要引言第一章绪论蚯蚓的习性及成分蚯蚓的应用情况在药物和保健品方面的应用在动物饲养方面的应用在农业利用方面的应用在治理环境污染方面的应用在食品方面的应用蚯蚓系列产品的加工与利用地龙干蚯蚓粉蚯蚓液一有效成分的研究现状一蚓激酶蚯蚓中的复合氨基酸第二章蚓激酶的提取工艺及其性质研究主要材料、试剂与设备材料试验试剂主要仪器与设备实验方法蚓激酶比活力测定方法与原理蚯蚓提取物蛋白质含量的计算蚓激酶活力测定酶的提取条件与性质实验结果与分析单因素实验结果与分析缓冲液对提取条件影响硫酸铵饱和度对盐析的影响蚯蚓中蚓激酶和复合氨基酸的提取分离纯化及活力研究正交试验设计金属离子对蚓激酶酶活力影响实验结论实验讨论第三章蚓激酶的分子量测定材料与方法实验试剂实验方法结果与分析实验结论第四章复合氨基酸的制备材料与方法材料与试剂主要仪器与设备实验方法鲜活蚯蚓的处理冷冻蚯蚓脱脂脱色除臭酶解法制备蚯蚓氨基酸甲醛滴定法测氨基氮含量蚯蚓氨基酸制备工艺影响因素研究正交实验条件设计结果与分析蚯蚓氨基酸的影响因素分析蚯蚓氨基酸的制备优化结果分析实验结论论结参考文献致谢西华大学硕士学位论文引言蚯蚓是一种软体多汁、蛋白质含量达的软体动物,在中医学上称为“地龙”,地龙性寒、味微苦,具有清热定惊、通络、平喘、利尿之功效,是传统的中药。蚯蚓喜食腐质的有机废弃物,有机废弃物通过蚯蚓的消化系统在蚯蚓肠道中的蛋白酶、脂肪分解酶、纤维酶、淀粉酶的作用下转化成为自身或其他生物易于利用的活性物质,同时生成的蚯蚓蛋白质和氨基酸等不会对环境产生二次污染。随着现代科学技术的不断深入发展,科学工作者证明蚯蚓体内含有丰富的氨基酸、酶类和活性物质,其中蚓激酶是应用现代手段从蚯蚓蛋白粗提取物中分离得到的具有纤溶酶活性的蛋白质,具有溶栓作用,是目前最具有开发前景的纤溶药物之一。蚓激酶的分离纯化、酶学活性、药物学作用等是国内外学者目前对于该领域的研究热点同样,蚯蚓体内的多肽活性物质,主要包括抗菌肽等,具有抗菌作用,在动植物抗菌领域具有广阔前景。蚯蚓蛋白质含量很高,约占鲜重的、干重的,最高可达,且富含多种氨基酸,蚯蚓蛋白质更可弥补我国每年数百万吨蛋白进口的空白。并且,蚯蚓提取蚓激酶、多肽活性物质后的剩余残渣同样富含蛋白质,通过酶解制备水解液可作为生产绿色肥料、生物农药等高经济附加值产品。综上所述,本研究对蚯蚓进行综合开发利用,不仅研究了活性物质的提取工艺,而且收集提取后的残渣进行蛋白水解液的制备,真正实现变废为宝,得到的产品层次多、经济效益高。研究表明,蚯蚓对于处理污水厂的污泥、造纸厂纸浆残渣等也具有很强的能力,对其中的重金属去除效率高,消解后的污泥中重金属含量接近土壤中的背景值,此类研究也可成为今后对于蚯蚓综合利用的研究方向之一。蚯蚓在医药、食品环保等方面都具有极高的价值,综合循环利用将是未来该领域的研究发展方向,而此类研究必须有科学的方法做支撑,因此研究蚯蚓的综合开发利用是一项具有重大现实意义的课题。第一章绪论蚯蚓的习性及成分蚯蚂是一种环保动物,世界上有余种蚯蚓,我国亦有多种。蚯蚓喜湿、喜暖、畏光、昼伏夜出,食性庞杂,而且是最不怕脏的动物。蚯蚓能适宜湿度为的环境,湿度范围很广。蚯蚓的适宜温度为至,低于时进入休眠状态,一以下就会死亡,而最高致死温度略低于其他无脊椎动物如赤子爱胜蚓为。,异唇蚓为。。蚯蚓靠大气扩散到土壤、饵料中的氧份和水中的溶养进行蚯蚓中蚓激酶和复合氨基酸的提取分离纯化及活力研究呼吸,空气越充足、越新鲜,新陈代谢越旺盛,生长也越快,产卵也越多。蚯蚓无眼睛,但却畏光,因此昼伏夜出。蚯蚓穿梭于土壤之中,同时分解土中微生物,为泥土中的微生物建立了一个舒适居所,对于土质改善、维系自然环境、促进生态循环以及物种多样性等方面均起到了重要作用。蚯蚓喜欢在微酸性至中性的环境中生活,而对强酸、强碱的反应都很敏感。蚯蚓的食性广泛,除金属、玻璃、塑料及橡胶外,几乎什么都可以吃,甚至污水、淤泥、生活垃圾等都是它的好食品【。目前许多国家利用蚯蚓来处理生活垃圾、有机废物和净化污水。据测定,蚓体的蛋白质含量很高,约占鲜重的‰,约占干重的,最高可达,脂肪含量为~,碳水化合物~,灰分【圳。蚓体的营养丰富,且富含人体必需的各种氨基酸,特别是赖氨酸含量为牛肉的倍,为猪肉的倍,还含丰富的维生素、矿物质和糖类,既是蓄禽的优质饲料,又是人们的高蛋白食品。若在饼干的配料中加入经提纯处理的蚯蚓粉可提高蛋白质含量个百分点,减少总糖含量个百分剧引。蚯蚓的应用情况在药物和保健品方面的应用年日本学者美源恒等应用现代分离技术从蚯蚓蛋白粗提物中分离到多组具有纤溶酶活性的蛋白质,并首次命名为“蚓激酶”,此后国内外对蚓激酶的分离纯化、理化性质、酶学活性、药物学作用及药效性等进行了大量研究,是该领域的研究热点。利用现代生物技术,科学工作者可从蚯蚓中提取种防治疾病的药品和保健品:有一定抗癌作用的药品溶解血栓的药品富含种氨基酸的高级营养保健品治疗烧烫伤的外用药。通过现代医学研究和临床治疗证明蚯蚓体内的活性物质具有增强免疫力、促进伤口愈合、溶解血栓、降压、抗癌、解热镇痛和抑菌作用。目前,国外发达国家利用蚯蚓提取新型抗癌药物,治疗心脑血管疾病等已初具规模,作为主要原材料的干蚯蚓目前国际市场售价每吨万元,且逐年升高。近年来,保健食品的开发和销售在全世界范围内异军突起。日本研制的蚯蚓粉保健食品,可调节人类机体疲劳,降胆固醇,是“三高”患者的难得良药。以蚯蚓为主要原料的药用酒、饮料、生长剂、有机肥料、食品、药膳等产业正蓬勃发展。我国无锡己生产“纯地龙粉”即蚯蚓粉出口欧美等地南京医药企业生产以蚯蚓为原料的“龙舒泰胶囊”药品,用于治疗心血管疾病甘肃兰州也生产以蚯蚓为原料的“班龙胶囊”药品,用于治疗心脑血管疾病,防治血栓,改善微循环,促进血液流动。用蚯蚓制成的“高活性蚓激酶,用于治疗和预防动脉硬化、心脑血管病,可改善血小板功能,对心脑血管病引起的瘫痪西华大学硕士学位论文和语言障碍的疗效尤其显著。江西的科技工作者,从蚯蚓活体提取超氧化物岐化酶获得成功,成功研制出帝龙天然系列产品,从而使该项技术的开发应用获得了新发展。超氧化物岐化酶,即,具有很强的抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、增强免疫功能等作用,还可治疗高血压、心脏病、肺气肿等。在化妆品方面,作为抗衰老主要成分被广泛使用。蚯蚓在中医学上名叫地龙,性寒,味微咸,是传统的动物性药材,在《本草纲目》中由地龙配制的药方就有多种,分别可用于治疗热结尿闭、高热烦躁、经闭、抽搐、咳嗽哮喘、行动不便、高血压、肾炎、结石、先天性癫痫、肺炎、痹症、风湿、黄疸、小儿惊风等多种疾病。中国药典年版收载的地龙为钜蚓科动物参环毛蚓、威廉环毛蚓、通俗环毛蚓的干燥体【。除药典或栉盲环毛蚓收藏品种外:湖北环毛蚓、直隶环毛蚓、异毛环毛蚓、白颈环毛蚓、背暗异唇蚓、赤子爱胜蚓等品种也具有潜在的药用价值。近些年来,科学工作者运用最新科学技术不断研究,对地龙的成分、作用都做了更进一步地探索研究,其体内的多种药物成分和作用均已被报道。目前知道,蚯蚓体内含有多种药用成分,如地龙解毒素、地龙素、地龙解热素、族维生素、抗组织胺、胆碱、黄瞟呤、核酸等多种药用成分。通过研究技术和实验仪器的不断更新,已经能从蚯蚓中提取几种有效活性成分,制成各类药品及保健品,例如治疗血栓的龙津胶囊、溶栓胶囊、血脂康、百奥蚓激酶等治疗癌症的药物清华号、福乃康等等。据报道,在蚯蚓中可获得多种氨基酸和酶,利用它们能制成护肤品等,可有效改善新陈代谢、抑制肌肤衰老和增强弹性。蚯蚓溶出液甚至能治疗烫伤和溃疡病等。日本企业开发研制地蚯蚓类食品,其蛋白质含量可达,并且还含有维生素、亚油酸等,经临床使用后证明,具有改善人体疲劳,除去血管内多余胆固醇成分,特别适合高血压患者。地龙素主要含有酪氨酸,可扩张支气管,具有抗组织胺作用,可降低血压,促进子宫平滑肌的收缩。我国科学家利用蚯蚓制成地龙注射液,临床治疗支气管哮喘及哮喘性支气管炎,特别是热喘病,疗效较高。国内研究人员已经开发出多种药物,如清华大学生物科学与技术系曹跃辉等研究人员与东风制药厂共同开发的“蚓激酶”,适用于治疗各种血栓性疾病、静脉曲张、静脉炎和风湿性关节炎等症。北京大学生命中心,用蚯蚓提取物研制出血脂康,经临床试验,疗效甚佳。中国科学院与北京康宁医药保健品有限公司合作研制的“福乃康胶囊”,是从蚯蚓体中提取的活性物质,有较强抑制肿瘤细胞的能力,可以减少癌细胞的扩散和转移,提高机体免疫功能。在中医治疗中,将活蚯蚓和白糖匀浆后外用治疗烫伤一直是经典药方,效果显著【,。蚯蚓中蚓激酶和复合氨基酸的提取分离纯化及活力研究在动物饲养方面的应用近年来,世界各国畜禽、水产养殖业迅速发展,对动物性蛋白质的需求量越来越大,但是由于环境污染,以及对鱼类的过渡捕捞,导致原有的鱼粉等饲料严重不足。因此,很多国家地区大力开展蚯蚓饲养,以蚯蚓为切入点,开展蛋白质原料来源的探索。研究得到,蚯蚓中富含蛋白质,其含量高于目前常用的酵母、豆饼等,只是略低于国外进口鱼粉,为大豆蛋白质含量的倍以上。蚯蚓的脂肪含量也较高,每公斤能量约为。焦耳,仅次于玉米,而高于进口原料、酵母、豆饼,含量接近鱼粉另外蚯蚓体内还含有丰富的维生素、、等多种矿物质及微量元素。据测定,,维生素。蚯蚓体内铁的含量是豆饼的每蚯蚓体内含有维生素多倍,为鱼粉的倍铜含量为鱼粉的倍锰含量是豆饼或鱼粉的倍以上锌含量为豆饼或鱼粉的倍以上尤其是蚯蚓体内可利用的磷比率达到左右。用蚯蚓喂鸡【】、刚】等家禽增重快,产蛋量大,肉质也好用蚯蚓喂猪,猪不但增重得快,肉质鲜美【】,而且最重要的是避免了激素滥用对人体的伤害。用蚯蚓喂鱼、龟、鳖等水生类动物最好是投喂鲜蚯蚓,投喂量约为,根据种类和大小区别对待。蚯蚓喂鱼可使幼鱼的成活率增高、生长加快、抗病力增强、体质健壮。根据经验,饲养亲龟过程中,完全投喂蚯蚓搭配适量莴苣叶,是最佳饲科配方,产卵、孵化和成活率都是最高的。此外,蚯蚓粪便同样具有利用价值,其含有多种微量元素和少量蛋白质。日本食品权威研究中心过去曾分析过蚯蚓粪的成分,得到的结果为:蚓粪内含的全氮约,相当于粗蛋白含量左右。因此,蚓粪也用来饲养鱼类和家禽。国外许多饲料厂将蚯蚓粉作为动物的配合饲料成分用于养鸡、养猪、养鱼等,取得了良好的效果。国内许多研究单位也对蚯蚓作为畜禽、鱼等饲料进行了研究和应用。另外据报道,每日每头猪喂食鲜蚯蚓,可增重而不喂蚯蚓的猪每天只增重。用蚯蚓喂鸭,可使鸭子每天都产蛋,并且每个蛋比饲喂蚯蚓前平均增重。另有报道,蚯蚓粉可促进仔猪生长【制。在农业利用方面的应用达尔文所著的《蚯蚓的习性和它对形成植物土壤的作用》书中讲到蚯蚓是是土壤改良的“关键先生”是农业的挖掘机。对于此类研究工作,已有很多人在国内外期刊杂志报道过。蚯蚓的掘穴、挖土、排粪活动,一方面改变了泥土的结构,另一方面还能改变土中化学成分比例,使贫瘠板结的土壤变得疏松多孔、富含氧分、变得肥沃进而能促进植物根系生长。蚯蚓的活动疏松土质,改善了土壤结构,增加了土壤的透气性,提高肥力。据调查我国每公顷土地内大约有蚯蚓万~万条。由于蚯蚓的掘地性和杂食性,每西华大学硕士学位论文年每公顷土地内的蚯蚓排出的蚓粪就可以达到几十吨至几百吨,这种蚓粪除含氮、磷、钾等常规元素外,还含有农作物必须的多种微量元素,不但是粮油作物的好肥料,更是花园,苗圃的高级有机肥。近些年来,有人研究了蚯蚓对土壤结构的形成速度,并通过形态和微结构的观测和蚯蚓团聚体的性质及有机和无机复合体的电子显微镜观察,认为蚯蚓具有较好的水稳定性以及优良的保肥供肥能力,故称之为“微型的改土加工厂”。实验证明,有蚯蚓存在的土壤中,许多无机盐如磷、钙、钾、镁等元素含量倍增。蚓粪中腐殖质含量较之原土增加,全氮提高,速效氮增加,其中速效磷增加,速效钾增加。可以看出,蚓粪较之畜粪的磷、钾、钙以及有机物的含量高出数倍,其肥力比畜粪要好很多。蚓粪不但可以提高土壤的肥力,使植物生长迅速、发育良好,而且还可增强植物抗病害的能力。据杨珍型等人试验,在放养蚯蚓的土壤中栽种豌豆、番茄、菜豆、谷子、胡萝等,具有明显的增产效果。有人做过试验,在用蚓粪做基肥的土壤中种植油菜、豌豆、黑麦、玉米、马铃薯,可以分别增产:油菜倍,豌豆倍,黑麦倍,玉米倍,马铃薯倍。另外,可利用园林中的落果,农村中的秸杆、厩肥、沼气池的内容物、废渣、食用菌渣等有机物,并且还可与养蘑菇、养猪、养蜗牛、养牛等结合起来进行蚯蚓养殖,发展生态农业,不仅提高有机物中氮素、碳素的利用率,而且由于进行了综合利用,能产生明显的经济效益和社会效益【州。在治理环境污染方面的应用蚯蚓在地球上分布广、数量多,是一项巨大的生物资源,其分解、转化有机物的能力很强,对于生态平衡和物质循环具有极其重要的作用。众所周知,土壤微生物对死亡的植物残体、动物尸体的分解起着重要的作用,但植物的落叶、秸秆,动物的角质和甲壳等,则必须先经过蚯蚓等土壤动物的粉碎,微生物才能进一步分解。在草原上,许多牲畜粪便和枯草则主要靠蚯蚓的破碎和分解。因此,蚯蚓在自然界的存在,大大加快了许多有机物的腐殖质化过程。蚯蚓的纵横穿梭于土壤中,降解微生物的行为,不但改善了泥土中微生物的活性,为泥土中有机物的生长繁殖提供了条件,并且,很多微生物可寄宿于蚯蚓体内。很难想象,没有蚯蚓等微生物去分解其他动、植物的地球生态圈,也许真的会尸横遍野,甚至人类因此而无法生存。蚯蚓能够分泌出许多特殊酶类,有着惊人的消化能力。蚯蚓分泌的特殊酶能分解蛋白质、脂肪、木质纤维素等,可以消化和吸收造纸工业、食品工业废渣以及污泥、垃圾等几乎所有的天然有机物,改善生态环境。世界上许多个国家都利用蚯蚓来处理如食品加工、造纸、酿造、木材加工以及纺织等行业的渣、浆、污泥等工业废弃物。据报道,美国加利福尼亚州一个公司养殖蚯蚓亿余条,每天可以处理废弃物。在日本,蚯蚓中蚓激酶和复合氨基酸的提取分离纯化及活力研究用蚯蚓处理造纸污泥已进入应用化的阶段。另外,还可以利用蚯蚓处理畜禽和水产品加工厂的废水和废弃物,如日本利用蚯蚓每月可处理的废弃物多达,用蚓粪中微生物群来分解废水中的污泥,使其产生沉淀,可达到净化污水的目的。蚯蚓还用于处理城市的生活垃圾,例如,北美有一个蚯蚓养殖厂,可以处理万人口的城市生活垃圾。目前,有些国家还利用蚯蚓来处理农药和重金属类有害物质,蚯蚓对农药和重金属铅、镉、汞等的积聚力很强。美、英等国在农田或重金属矿区周围的耕作区养殖大量的蚯蚓,结果大量重金属或有害的农药富集到蚯蚓的体里,使得已经荒芜的农田又变得肥沃起来,能够用来再次种植庄稼【。在食品方面的应用蚯蚓作为食品,在我国古代已有记载,但仅在广东和福建一带有人食用。目前,国内也只在台湾、海南岛和贵州的少数民族中有食用蚯蚓的习惯。蚯蚓在台湾是个热门的商品,仅在食用方面用途就很广,常见的蚯蚓食品有通心粉和地龙糕等,蚯蚓莱肴有千龙戏珠即蚯蚓煮鸽蛋、地龙风巢即蚯蚓炒蛋或爆蛋、龙凤配即蚯蚓炖鸡等。由于以蚯蚓为原料可制成几十种的烹调莱肴和点心,所以在当地也被称为蚯蚓大餐。在我国的台湾和江浙一带,也有蚯蚓食品和蚯蚓菜肴。近些年来,在一些经济发达的国家和地区,如美国和西欧等,从营养和保健的角度考虑,食用蚯蚓己很普遍。美国有些食品公司利用蚯蚓制作成各种食品,如蚯蚓浓汤罐头和蚯蚓饼干,畅销欧美国家。蚯蚓的烹饪以蒸、炒、煎、炸为主,红烧蚯蚓味道鲜美,胜过海鲜。还可以加工成蚯蚓蛋糕、蚯蚓面包、蚯蚓干酪等。用蚯蚓沫加苹果汁可做成的蚯蚓苹果蛋糕,另外还有蚯蚓烤面包、蚯蚓干酪、炖蚯蚓、蘑菇蚯蚓等。年,在美国纽约街头出现了食用蚯蚓特餐,这种特餐很受欢迎,并且现在已成为纽约人的喜好。甚至,新西兰的毛利人以种蚯蚓作为食用的佳品和礼物,互相赠送。蚯蚓系列产品的加工与利用无论将蚯蚓作饵料、饲料,还是作为药材和食品,都必须注意安全问题。使用前须认真仔细地分析和检查,一方面是看蚯蚓是否已感染寄生虫蚯蚓是某些寄生绦虫和线虫的中间宿主,另一方面还要检查蚯蚓体内有无铅、汞、镉等重金属元素,或有机磷、氯等农药的富集,一般要求样品重金属含量不得超过百万分之三十。这就要求在蚯蚓的饲养过程中,严格禁止使用被重金属或有机磷、氯等农药污染了的或带有寄生虫的饲料喂养蚯蚓,以此保证所养殖出来的蚯蚓的安全性。特别是在当今社会食品安全己成为人们关心的头等大事的前提下,作为人类食品、中药材用的蚯蚓,其前期检测工作就显得西华大学硕士学位论文尤为重要,除了注意其安全性外,还要尽量保证以蚯蚓为原材料的产品的清洁卫生。另外,作为饲料用的蚓粪需经发酵或烘干处理以杀灭其中有害的细菌和虫卵。地龙干将蚯蚓加工成各类药材时,先用温水浸泡,洗去体表粘液,再放入草木灰中呛死,之后去灰,随即用小刀剖开蚯蚓身体,洗去内脏与污泥,贴在木板或竹片上烘干或晒干即成。为了增强蚯蚓的临床疗效,改变作用的部位和趋向,使患者愿意服用,常用煎炒、酒制、滑石粉制、甘草水制等方法处理以达到上述效果。加工好的地龙干应贮存在干燥容器内,置于通风干燥处,防蛀、防霉。炒地龙:取干净蚯蚓段,置于锅内,文火加热,翻炒,炒至表面颜色变深时,取出,放备用。酒地龙:取干净蚯蚓段,加入黄酒搅拌均匀,置于锅内,文火加热,炒至表面呈棕色时,取出、放、备用。每蚯蚓用黄酒。滑石粉制地龙:取少量滑石粉,置于锅中中火加热,加入少量洗净的蚯蚓段,翻炒至蚯蚓微微胀起后,取出,筛去滑石粉,放备用。甘草地龙:取若干甘草置于锅内,加少许水熬成浓汤,然后放入洗净蚯蚓段,浸泡两小时,捞出,晒干备用。蚯蚓粉收获的成蚓,除了直接应用外,有时还需要贮存。为防止腐烂,提高适口性,有些蚯蚓还需要进行干燥粉碎,加工制成蚯蚓粉。加工蚯蚓粉的方法易于操作,较为简单,首先将蚯蚓清洗干净,再对其烘干、粉碎即得。干蚯蚓粉最大的优点就是可以长期存放,同时可像鱼粉一般加入不同禽畜基础饲料中,便于禽畜食用。干蚯蚓粉蛋白质高,可达,其蛋白质含量几乎相当于外国进口鱼粉,含量高于国产鱼粉。试验表明,以蚯蚓粉代替鱼粉,不但经济实惠,而且饲养出来的鸡鸭等肉质更好、口感鲜美。另外,蚯蚓粉中含有解热碱、蚯蚓毒素和蚯蚓素等,可用于治疗高血压、高烧、头痛哮喘、小便不畅、水肿、半身不遂等疾病。蚯蚓液蚯蚓的体腔液中含有多种纤溶酶和蛋白水解酶,对蛋白质的分解有很强的活性。宋春阳等人利用酶解法水解蚯蚓,蚯蚓液中的氨基酸总和为‖,并且含有多种维生素、微量元素等营养物质。蚯蚓液作为新型蛋白饲料添加剂,可促进畜禽生长和提高抗病能力。蚯蚓浸出液的制作方法为:在清水中放置鲜蚯蚓,待其排净蚯蚓消化道蚯蚓中蚓激酶和复合氨基酸的提取分离纯化及活力研究中的粪便泥土,同时洗去蚯蚓表面附着物后,放入洁净容器内,再加入的白糖,搅拌均匀,大约后,即可得到左右的蚯蚓渗出液,然后再用纱布等滤过,所可得咖啡色的滤液,再经过高温高压消毒,可置于冰箱内长期储存备用。有效成分的研究现状蚯蚓全身都是宝,是难得的多功能性生物资源,不但能净化环境,肥沃土壤,还能提供动物需要的蛋白质、氨基酸、维生素,矿物元素等营养成分。蚯蚓的体内含有多种活性成分,消化道内有多种蛋白水解酶,这些蛋白水解酶类对蛋白质都有很强的水解能力,利用蚯蚓自身地水解酶类分解蚯蚓蛋白质,可得到蚯蚓水解液,这些水解液营养价值高,其营养成分包含种氨基酸与少量短肽等,其中氨基酸约占,短肽和小分子蛋白质约占】。还含有抗氧化酶、纤溶酶、抗肿瘤成分及溶血素等生物活性物质。蚯蚓来源广泛,养殖成本低【,早在上世纪四、五十年代就有许多国家开展蚯蚓养殖与相关的应用技术研究【,其已经可部分替代鱼粉作为一种新型饲料原料,经济效益好,极具发展潜力,目前在水产养殖中蚯蚓大部分以直接投喂水产动物为主,造成浪费严重、有效利用过少的问题,深层次开发利用蚯蚓中的活性成分,迸一步深入研究工艺已经成为当前的研究热点。目前通过酶法水解动植物蛋白很少破坏氨基酸,反应条件易于实现,不产生消旋作用,酶解生成物较少破坏,酶解得到的某些氨基酸具有生物活性,可增强动物的生产能力和免疫能力,成为提高饲料蛋白资源的一个新的亮点和热点引。国内外学者在此领域做了大量实验研究,贾久满等【】通过琼脂糖蛋白平板测定了蚯蚓蛋白水解酶对大豆蛋白的分解作用,同时测定并比较了蚯蚓豆粕反应物的氨基酸含量。其研究结果表明蚯蚓蛋白水解酶对大豆蛋白具有一定的酶解活性,其水解度达,利用蚯蚓处理豆粕,反应物中多种氨基酸含量均有不同程度增加,氨基酸总量与豆粕相比上升了,而且各种必需氨基酸的比例也更趋合理因此。利用蚯蚓蛋白水解酶对大豆蛋白的分解作用可以有效地改善豆粕饲料的品质。自世纪年代日本学者美原恒教授从蚯蚓中提取到具有极高活性的纤溶酶以来,国内外学者对蚯蚓的研究空前活跃,有关蚓激酶和复合氨基酸等的研究更是成为热点,取得了很大的进展。西华大学硕士学位论文蚓激酶蚓激酶的发现蚯蚓作为中药称为“地龙”,我国很早以前就已经将其作为药用。药用功能有:清热、平肝、止喘、通络。主治高热狂燥,惊风抽搐,风热头痛,目赤、半身不遂等。年,日本宫崎医科大学的美源恒教授首次报告了可以从人工大量养殖的特种蚯蚓分离得到含有纤溶活性很高的溶栓酶并命名为蚓激酶【】。此酶具有直接溶解纤维蛋白和激活纤维溶酶原间接溶解纤维蛋白的双重作用,同时具有原料来源丰富、口服有效、安全无毒等优点。大量实验证明,蚯蚓提取物具有极高地直接溶解血栓和人纤维蛋白的活性,具有显著的抗血小板凝集效应和明显的抗栓和增强纤溶的作用【,且提取、分离、纯化活性组分的难易程度随蚯蚓品种的不同会有很大不同。等【】从粉正蚓亿“,,,螂分离得到六种具有纤溶活性的组分,这些组分热较稳定性好,含有丰富的天冬酰胺和天冬氮酸,很少的脯氮酸和赖氮酸。自溶液中分离出三个对血栓或纤维蛋白具有较强溶等拉从粉蚂解活性的组分,其分子量分别为、和。程牛亮掣用、的磷酸盐缓冲液抽提,硫酸胺盐析及组织匀浆中分离得到分子量为等种柱层析方法从双胸蚓和的两种纤溶组分,具有强烈的溶解纤维蛋白的作用,对家兔实验性血凝块也具有明显的溶解作用。等赤:爱胜蚓协咒砌加提物中获得分子量为和的两种丝氮酸肽酶活性高于肽酶,前者浓度为时能使纤凝块溶解时间缩短左右,浓度约为时,对于静脉血的凝固抑制作用效果明显。熊焱等【】以赤子爱胜蚓为材料,分别进行抽提、沉淀、不同层析、电泳等纯化步骤,可得到一种纯度达以上,分子量为的纤溶酶,这种酶溶解纤维蛋白的作用及蛋白酶活性都很很强,测得其比活性为蛋白,法测得其蛋白。何执中等用提取、沉淀、凝胶层析和离子交换等方法从赤子爱胜蚂得到了单组分酶,活力收率为粗酶粉的,具有极强的纤溶活性,其分子量为,比活力达蛋白,在及内稳定。蚯蚓中蚓激酶和复合氨基酸的提取分离纯化及活力研究蚓激酶的性质蚓激酶,也称蚯蚓纤溶酶,是一种有效地溶栓药。已经报道的组分多数为单链,相对分子量在之间,等电点通常在左右【’。对于组分的相关研究已有多篇报道,如基因克隆及外源表达【】,酶的固定化、化学修饰【】和结构研究【】等。邢宝东等【加】的研究证明,蚓激酶是分子量为的多组分丝氨酸蛋白酶。杨嘉树等【】的一系列研究表明,蚯蚓纤溶酶激活酶可一定程度增强蚯蚓纤溶酶的活性,因此又不能单纯的将蚓激酶归为丝氨酸蛋白酶。李月菊等【报道从赤子爱胜蚓中分离的纤溶酶组分一般为组片段,不过同样有组片段的报道。可能是因为分离手续复杂,时间长,易引起丢失,或在纯化过程中被降解的原因。中国医科大学工作者采用快速冷冻提取的方法,使得酵片段丢失和分解的可能性大大减少,获得条纤溶透明谱带。美国学者也曾研究报道过蚓激酶存在个片段,其中,,片段结构性质比较相似。结构未知。、与胰蛋白酶样活性相近。有学者研究报道,蚓激酶氨基酸结构中含有大量门冬酰氨和门冬氨酸,但却几乎不含脯氨酸或精氮酸。同时,蚓激酶为酸性蛋白酶,等电点为,故在中性环境中是带负电荷的。根据武金霞等【】的研究报道,用亲和层析法从赤子爱胜蚓中分离到~个纤溶酶组分,和制备电泳纯化了个组分,依中迁移率从小到大的顺序依次命名为,,,,,,其中号和号为三个亚基组成的寡聚酶,其余个为单体酶,这一组纤溶酶的相对分子量在~之间,在以下,根据免疫学特性将其分为组,、为一组、、、为一组,,为一组,,为一组。可以看出相同组分在组内的端序列同源性非常强,有些甚至相同,这一点与已经报道的外国学者分离的和不同组分的性质在分子量和等电点以外基本一致。号组分的端氨基酸序列,与有高度同源性,但号为糖蛋白,具有直接激活活性和纤溶活性。一为糖蛋白,且该组分只有直接纤溶活性。已经有学者对蚓激酶的特性做过研究,通过研究了解到::蚓激酶可以水解如酪蛋白之类的蛋白质底物、碱性氨基酸的酯如广精氨酸乙酯、苯甲酞,甚至酰胺。:溶解血纤蛋白的效果明显。:热稳定性较好:蚓激酶提取物在条件下加热,其生物活性无显著降低,以上,酶活性出现下降,加热其活性完全丧失。:酸稳定性:大部分蚓激酶的酶活性在~之间无明显变化,小于或大于时,酶活性下降明显,最佳反应的范围较宽,常在~之间。不同蚯蚓种类、不同分离技术,所提取的蚓激酶,其特性也不尽相同。西华大学硕士学位论文圈图蚓激酶溶解血栓原理蚓激酶提取分离纯化盐析盐析原理:一般是指溶液中加入无机盐类而使溶解的物质析出的过程。如:加浓使蛋白质凝聚的过程。蛋白质四周亲水基团所形成的水化膜和其自身带电荷的多少决定了其在溶液中的溶解程度。当蛋白质溶液中加入中性盐后,中性盐和水的聚集力大于蛋白质,然后蛋白质分子四周的水化膜层不断分解直至完全消失。并且,蛋白质溶液中加入中性盐后,随着离子强度的不断改变,蛋白质表面电荷多数被中和,更加促进蛋白溶解度下降,使蛋白质分子之间因聚集而发生沉淀。盐析操作成本低,不需要特别昂贵的仪器设备,操作简单、安全且不会引起蛋白质变性,经透析去盐后,能得到保持生物活性的纯化蛋白质。蛋白质盐析中经常用到的中性盐有硫酸镁、硫酸铵、氯化钠、硫酸钠、磷酸钠等。其中硫酸铵应用最多,因为其溶解度大而且温度系数小度时饱和溶液为克升度时饱和溶解度为克升,在此溶解度范围内,很多酶和蛋白质都可被盐析出来蚯蚓中蚓激酶和复合氨基酸的提取分离纯化及活力研究而且硫酸铵的分段盐析也比其他中性盐效果好,蛋白质变性较少。硫酸铵溶液的常在之间,需用硫酸或氨水调节,才能在其他值条件下进行盐析时‘棚。本实验采用分段盐析。对分离目的蛋白的盐析,最好采用分段盐析。由于不同的蛋白质其溶解度与等电点不同,沉淀时所需的值与离子强度也不相同,改变盐的浓度与溶液的值,可将混合液中的蛋白质分批盐析分开,这种分离蛋白质的方法称为分段盐析法。如半饱和硫酸铵可沉淀血浆球蛋白,饱和硫酸铵则可沉淀包括血浆清蛋白在内的全部蛋白质。分段盐析的条件先需要进行小实验探索,如:先进行的硫酸铵沉淀,再进行一的硫酸铵沉淀,最后进行的硫酸铵沉淀。每一段盐析静置之后都将离心取沉淀,透析并检测活性。通过实验结果可以看出哪一段盐析出来的目的产物最多,相对来说杂质就更少。比如实验中的活性物质主要在这段出来,在以后的实验中,就可以首先进行一的硫酸铵沉淀,这段沉淀物可以抛弃去处大多数杂质然后进行一的硫酸铵沉淀,这段沉淀出来是物质是所需要的目的物质含量比较高的物质,将其收集进行下一步纯化工作。盐析的成败决定于溶液的值与离子强度,溶液值越接近蛋白的等电点,蛋白质越容易沉淀。盐析一般用的硫酸铵,容易吸潮,因而在使用前,一般先磨碎,平铺放入烤箱内烘干后再称量,这样更准确。在加入盐时应该缓慢均匀,搅拌也要缓慢,越到后来速度应该更注意缓慢,如果出现一些未溶解的盐,应该等其完全溶解后再加盐,以免引起局部的盐浓度过高,导致酶失活。盐析后最好搅拌到而且再在冰浴中放置一段时间。为了避免盐对酶的影响,一般脱盐处理后再测酶活性。盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理,以免变性。各因素对盐析的影响蛋白质的浓度中性盐沉淀蛋白质时,溶液中蛋白质的实际浓度对分离的效果存在很大的影响。通常若蛋白质浓度较高时,的用较低的硫酸铵饱和度溶液就可将其沉淀下来,但若蛋白质浓度过高,会导致多种蛋白质共同沉淀,杂蛋白干扰沉淀效果,影响去除杂蛋白的效果。对于蛋白质浓度较低时,需使用较高硫酸铵饱和度的溶液,这样共沉淀影响小,分离纯化的效果会比较好,但回收率也会相应降低。通常认为蛋白质浓度为时沉淀效果相对较好,相当于。离子强度不同蛋白质的沉淀条件所要求的离子强度不同。西华大学硕士学位论文值一般说来,蛋白质所带净电荷越多,它的溶解度就越大。改变值可改变蛋白质的带电性质,因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大,在等电点处溶解度小,因此用中性盐沉淀蛋白质时,值常选在该蛋白质的等电点附近。温度除对温度敏感的蛋白质在低温操作外,一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白在较高的温度。比时溶解度低,更容易盐析。冷冻离心由于提取物为酶,为了防止高温条件下各种蛋白酶对酶的分解所以整个操作过程均在低温下进行。使用冷冻离心机前要注意填写实验记录并确定使用了合适的转子,然后先预冷左右使冷冻离心机运行到到。在将样品离心。离心时必须确保离心管的对称和平衡。透析由于提取酶的时候用到了硫酸铵,所以提取酶后还要将硫酸铵透析掉。透析是目前生物、食品、化学等实验室最常用最简便的分离纯化技术之一。在制备生物大分子的过程中,去除少量有机溶剂、去除盐、去除小分子生物杂质和样品浓缩等都需要用到透析技术。透析操作仅需要用到半透膜,一百年先将半透膜做成口袋状,再向其中倒入生物大分子样品,再将透析袋置于缓冲液或水中,这样由于渗透压原理,样品溶液中的盐和小分子物质不断扩散透析到袋外,而生物大分子则留在袋内,依次循环直到渗透袋内外两侧浓度达到平衡。袋膜外的溶液称为“透析液”或“渗出液”,留在袋内未透析出去样品溶液被称为“保留液”。渗透压是透析的动力,由于膜两边的浓度梯度而形成的渗透压。透析速度与被透析的小分子溶质在膜两边的浓度差以及膜的面积和温度成正比,与膜的厚度成反比,透析温度常选,温度升高会加速透析【】。透析膜常用玻璃纸和动物膜等制成,但最常用到的透析膜还是由纤维素制成的,商品透析袋的宽度一般为之间。商品透析袋常经的甘油处理,可防止干裂。其中存在极微量的重金属、硫化物以及某些杂质,这些杂质对有些蛋白质和一蚯蚓中蚓激酶和复合氨基酸的提取分离纯化及活力研究些生物活性物质有害,必须在使用前将其去除。实际使用过程中,先在酒精中煮沸小时以上,再依次用酒精、溶液清洗,的和最后再以蒸馏水清洗后既可以使用。研究表明,酒精处理后,其去除具有紫外吸收的杂质效果特别明显。使用后的透析袋洗净后可存于蒸馏水中。洗净干的透析袋弯折时易裂口,用时必须仔细检查,不漏时方可重复使用。新透析袋如不作如上的特殊处理,也可用沸水煮五至十分钟,再用蒸馏水洗净,即可使用。使用时,一边用特制的透析袋夹夹紧,也可以使用橡皮筋或线绳扎紧,从另一端装灌满水,用手指挤压,确认不漏后,方可装入待透析液,通常要留三分之一至一半的空间,以防透析过程中,透析的小分子量较大时,袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破。含盐量很高的蛋白质溶液透析过夜时,体积增加是很正常的。为了加快透析速度,除多次更换透析液以外,还可以使用磁子搅拌。透析的容器要大些,可以使用大烧杯、大量筒和塑料桶。小剂量体积溶液的透析,可在袋内放一截两头烧园的玻璃棒或两端封口的玻璃管,以使透析袋沉入液面以下】。真空冷冻干燥冷冻干燥是指通过升华从冻结的生物产品中去除水分或其他溶剂的过程。冷冻干燥的产品除可以长期稳定保存以外,还保留了其固有的生物活性与结构。样品在冷冻干燥前需要在超低温冰箱里进行预冷冻,使其结成冰,预冷冻温度为,本实验冷冻干燥温度为。本实验样品经过冷冻干燥后可以长期保存,样品冷冻干燥后颜色为黄紫色粉末。蚓激酶研究的意义综上所述,蚓激酶是一种重要的治疗血栓性疾病药物,国内外的潜在市场需求相当大,具有重要开发价值,应用前景广阔,可是目前尚未形成产业化,原因之一是未能集中力量进行科技攻关。国内学者虽有研究,但提取分离纯化蚓激酶的工艺普遍较复杂、酶活和比酶活都不高,工艺技术有待提高和完善。本论文以从蚯蚓体内提取蚓激酶与制备氨基酸入手,将蚯蚓体内主要生物活性物质加以提取分离纯化,达到综合利用之目的。以蚓激体内生物酶的产业化生产为目的,对现有传统的蚓激酶分离纯化工艺进行改进,探讨最适提取条件,采用高效温和的生化分离技术,如离心、酶解、分级盐析等技术,得到最佳提取纯化工艺,并深入酶理化性质研究,测定蚓激酶分子量,为工业生产蚓激酶提供了科学依据。目前,生产蚓激酶的方法一般是从蚯蚓体内进行简易的提取,纯度和活力均达不到西华大学硕士学位论文要求,本研究的努力方向是通过对蚯蚓组织提取纯化法生产蚓激酶、蚓激酶酶学特质及稳定性的研究,为蚓激酶的开发和应用提供理论依据,以实现工业化生产蚓激酶。蚯蚓中的复合氨基酸蚯蚓氨基酸研究意义本试验采用蛋白酶解蚯蚓,进行酶解条件的筛选研究,确定最佳酶解条件,并对酶解产物进行分析,为蚯蚓在水产饲料中的应用提供理论依据。同时蚯蚓酶解物中游离的组氨酸、亮氨酸、赖氨酸等相对含量比较高,而赖氨酸在以谷物为主的原料饲料中只有很低的含量,并且在加工、筛选过程中容易因破坏而缺乏,故填加蚯蚓酶解产物可对氨基酸平衡具有一定作用,并可提高饲料中的营养成分含量。蚯蚓酶解物中的甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸和天冬氨酸这几种氨基酸含量也相对较多,他们均可影响食品风味,适当添加可改善动物的食口性,提高迸食量,据此可生产动物饲料中的诱食剂。第二章蚓激酶的提取工艺及其性质研究蚓激酶,又称蚯蚓纤溶酶,大量实验表明,蚯蚓提取物具有强烈的溶解血栓和人纤维蛋白的功能,且提取、分离、纯化活性成分的难以程度随蚯蚓品种不同会有很大不同。本部分实验采用分段盐析。对于目标蛋白质的盐析分离,最好采用分段盐析方法。由于不同的蛋白质其溶解度与等电点不同,沉淀时所需的值与离子强度也不相同,改变盐的浓度与溶液的值,可将混合液中的蛋白质分批盐析出来,这种分离蛋白质的方法称为分段盐析法。如半饱和硫酸铵可沉淀血浆球蛋白,饱和硫酸铵则可沉淀包括血浆清蛋白在内的全部蛋白质。分段盐析的条件需要先进行小实验进行探索,如:先进行的硫酸铵沉淀,再进行的硫酸铵沉淀,最后进行的硫酸铵沉淀。每一段盐析静置之后都将离心取沉淀,透析并检测活性。通过实验结果可以看出哪一段盐析出来的目的蛋白质最多,运用这种方法相对来说杂蛋白就更少。比如实验中的活性物质主要在这段盐析出来,在以后的实验中,就可以首先进行的硫酸铵沉淀,将这段沉淀物抛弃这样可去处大多数杂质然后进行再进行的硫酸铵沉淀,这段沉淀出来的沉淀是所需要的目的蛋白含量比较高的物质,将其收集起来,进行下一步纯化工作。蚯蚓中蚓激酶和复合氨基酸的提取分离纯化及活力研究主要材料、试剂与设备材料蚯蚓赤子爱胜蚓购自成都汇丰生态实业有限公司试验试剂纤维蛋白原公司生产规格为凝血酶公司生产规格为主要仪器与设备型紫外分光光度计公司生产型层析实验冷柜北京博医康实验仪器有限公司冷冻干燥机公司生产台式高速冷冻离心机公司生产实验方法本实验测定提取物蛋白质含量是用紫外分光光度法测定的。首先做标准样品曲线。由于蛋白质在处有吸收峰且与蛋白质含量成正比,故从标准曲线上便可以找出相对应的样品蛋白质含量。本实验的标准样品为牛血清蛋白稀释液为磷酸缓冲液。提取工艺流程:蚯蚓原料水洗数次称重叶加缓冲液匀浆静置离心一上清液加硫酸铵一离心一上清液加硫酸铵一离心一沉淀一透析去盐冷冻干燥提取工艺描述:取一定量的活蚯蚓,水洗数次,刺激其排除体内污物,然后捞出后用滤纸擦试蘸去其多余水分,称重,加倍体积的缓冲液,在匀浆器中匀浆后,放于层析柜里静置后,高速离心,弃去沉淀,向上清液中加入固体硫酸铵,使其达一定饱和度,以冷冻离心分钟,将上清液收集,再在其中加入固体硫酸铵,使其达到较高的饱和度,静置过夜后,高速离心,收集沉淀,然后向沉淀物中加入缓冲液,使其溶解,再用透析袋将盐透析去掉,最后放入冷冻干燥机中冻干保存。至此可以。得到淡棕色粉末状物质,即为为蚓激酶粗制品【本实验使用透析袋型号为,直径,截留分子量为,生产公司为美国联合碳化。使用时需要使用特制的透析袋夹夹紧透析袋一端,加入样品后再用夹西华大学硕士学位论文子夹住另~端,然后放入烧杯中透析。本实验样品经过冷冻干燥后可以长期保存,样品冷冻干燥后颜色为黄紫色粉末。蚓激酶比活力测定方法与原理酶活力也称之为酶活性,是酶催化某类化学反应的能力。在一定条件下,酶活力的强弱可用酶催化一定化学反应的速度快慢加以表示,酶活力越高,酶催化反应速度越大同样,酶活力越低,酶催化反应速度越慢。测定了酶促反应的速度就可以测定酶活力。酶促反应速度可以用单位体积、单位时间内产物的增加量或底物的减少量来表示。在常见的酶促反应中,一般来说底物常常是过量的,测定速度初始阶段,由于底物减少量所占总量的比例极少,很难准确检测,但产物则是经历从无到有的过程,只要测定方法足够准确,就可准确测定。酶的比活力为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数

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