细胞转染与筛选

细胞转染与筛选方法总结 细胞转染:对数期生长的U251细胞经含EDTA的0.25%胰酶消化后,细胞计数,接种于六孔板,每孔种植2×105个细胞,加2ml/孔完全培养基培养过夜,弃去培养基,PBS 洗3次,加入2ml/孔OPTI-MEM培养基。将3μl FUGENE HD加入94μl空白OPTI-MEM培养基中,混匀,室温放置5min,加入PEGFP-N1或PEGFP-LRIG1质粒体2μg,混匀,室温放置10min,加入六孔板中。六小时后,将细胞培养基换成DMEM完全培养基。 细胞筛选:转染后36h, 荧光显微镜下观察细胞转染情况,48h后加入G418,其终浓度为1000μg/ml。放入细胞培养箱继续培养,每两天换液,重新加入G418。待正常组细胞全部死亡(约15d)将G418浓度调整至500μg/ml,继续培养2周后,长出抗性克隆,挑取单个克隆,在96孔板中扩增,培养2周后,单个克隆已经长满整个孔,将细胞消化后转入6孔板,使用完全培养基继续培养,继而进行其他指标的检测。 细胞转染操作方法 转染,是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入,转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的 范例 企业形象设计范例幼儿园招生计划范例交接检查记录填写范例软件开发需求文档范例公路资料填写范例 ;化学介导方法很多,如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术;生物介导方法,有较为原始的原生质体转染,和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。 理想细胞转染方法,应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术,是目前转染效率最高的方法,同时具有细胞毒性很低的优势。但是,病毒转染方法的准备程序复杂,常常对细胞类型有很强的选择性,在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法,则各有其特点。 需要指出的一点,无论采用哪种转染技术,要获得最优的转染结果,可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多,从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态,到转染方法的操作细节,都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备:200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌),酒精棉球,废液缸,试管架,微量移液器,记号笔,培养皿,离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基,用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液,消化1分钟(37℃,5%CO2 )。用手轻拍培养瓶壁,观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸,使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中,1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞,细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。 8. 将合适体积完全培养液加入离心管中,混匀细胞后轻轻加入培养皿中,使其均匀分布。 9. 将培养皿转入CO2培养箱中培养,第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中,震荡10秒钟,溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在-20摄氏度保存,使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例(1:1-1:2/脂质体体积:DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA,震荡后在加入合适体积的转染试剂,再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基,用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液,将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后,根据细胞种类决定是否移除混合液,之后加入完全培养基继续培养24 -48小时。 三、第二次细胞传代 1. 在转染后24小时,观察实验结果并 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 绿色荧光蛋白 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达情况。 2. 再次进行细胞传代,按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。 脂质体介导DNA转染法 脂质体(lipofectin regeant,LR)试剂是阳离子脂质体N-[1-2,3-Dioleyoxy, Propyl]-n, n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物[1:1(w/w)]。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中,是目前条件下最方便的转染方法之一。转染率高,优于磷酸钙法,比它高5~100倍,能把DNA和RNA转染到各种细胞。 用LR进行转染时,首先需优化转染条件,应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等,对每批LR都要做:第一,先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间,DNA可从1~5μg和孵育时间6小时开始,按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线,再选用LR和DNA两者最佳的剂量,确定出转染时间(2~24小时)。因LR对细胞有一定的毒性,转染时间以不超过24小时为宜。 细胞种类:COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。 一、操作步骤[方法一]: 1. 取6孔培养板(或用35mm培养皿),向每孔中加入2mL含1~2×105个液,37℃CO2 培养至40%~60%汇合时(汇合过分,转染后不利筛选细胞)。 2. 转染液制备:在聚苯乙稀管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量)A 液:用不含血清培养基稀释1-10μg DNA,终量100μL,B液:用不含血清培养基稀释2-50μgLR,终量100μL,轻轻混合A、B液,室温中置10-15分钟,稍后会出现微浊现象,但并不妨碍转染(如出现沉淀可能因LR或DNA浓度过高所致,应酌情减量)。 3. 转染准备:用2mL不含血清培养液漂洗两次,再加入1mL不含血清培养液。 4. 转染:把A/B复合物缓缓加入培养液中,摇匀,37℃温箱置6~24小时,吸除无血清转染液,换入正常培养液继续培养。 5. 其余处理如观察、筛选、检测等与其它转染法相同。 注意:转染时切勿加血清,血清对转染效率有很大影响。 二、快速脂质体转染法操作步骤如下[方法二]: 1. 以5×105细胞/孔接种6孔板(或35mm培养皿)培养24小时,使其达到50~60%板底面积。 2. 在试管中配制DNA/脂质体复合物方法如下: ①在1mL无血清DMEM中稀释PSV2-neo质粒DNA或供体DNA。 ②旋转1秒钟,再加入脂质体悬液,旋转。 ③室温下放置5~10分钟,使DNA结合在脂质体上。 3. 弃去细胞中的旧液,用1mL无血清DMEM洗细胞一次后弃去,向每孔中直接加入1mL DNA/脂质体复合物,37℃培养3~5小时。 4. 再于每孔中加入20%FCS的DMEM,继续培养14~24小时, 5. 吸出DMEM/DNA/脂质体混合物加入新鲜10%FCS的DMEM,2mL/孔,再培养24~ 48小时。 6. 用细胞刮或消化法收集细胞,以备分析鉴定。 四、稳定的脂质体转染方法如下: 1. 接种细胞同前,细胞长至50%板底面积可用于转染。 2. DNA/脂质体复合物制备转染细胞同前2、3步骤。 3. 在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM,37℃培养48小时。 4. 吸出DMEM,用G418选择培养液稀释细胞,使细胞生长一定时间,筛选转染克隆,方法参照细胞筛选法进行。 细胞筛选 每种细胞的G418筛选浓度是不一样的,因此首先要对Hela细胞确定其筛选浓度。方法可如下:应用6孔板培养皿培养细胞,每孔G418的浓度可依次为0、200、400、600、800、1000μg/ml,浓度为0的作为对照,培养10-14天,全部杀死细胞的最低浓度为G418的筛选浓度。我作过GBC-SD细胞转染,应用此方法确定G418的筛选浓度为400μg/ml。