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双光子显微镜.doc

双光子显微镜

Bonnie兵兵
2019-02-27 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《双光子显微镜doc》,可适用于工程科技领域

双光子显微镜双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。双光子激发的基本原理是:在高光子密度的情况下荧光分子可以同时吸收个长波长的光子在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后发射出一个波长较短的光子其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度为了不损伤细胞双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量其脉冲宽度只有飞秒而其周期可以达到至兆赫。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时物镜的焦点处的光子密度是最高的双光子激发只发生在物镜的焦点上所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔提高了荧光检测效率。双光子荧光显微镜有很多优点:)长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本)焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面使激发光可以穿透更深的标本)长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小)使用双光子显微镜观察标本的时候只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。激光共聚焦显微镜在进行生物样品研究工作中还存在很多局限和问题:一是标记染料的光漂白现象。因为共焦孔径光阑必须足够小以获得高分辨率的图像而孔径小又会挡掉很大部分从样品发出的荧光包括从焦平面发出的荧光相应的激发光必须足够强以获得足够的信噪比而高强度的激光会使荧光染料在连续扫描过程中迅速褪色荧光信号会随着扫描进程度进行变得越来越弱。光毒作用是另外一个问题在激光照射下许多荧光染料分子会产生诸如单态氧或自由基等细胞毒素所以实验中要限制扫描时间和激发光的光功率密度以保持样品的活性。在针对活性样品的研究中尤其是活性样品生长、发育过程的各个阶段光漂白和光毒现象使这些研究受到很大的限制。在传统荧光显微镜中一个荧光团吸收一个光子该光子能量对应于荧光团基态和激发态能量之差。通过一个较短寿命的虚态也可以通过同时吸收两个较低能量(即更高的波长)的光子激发荧光。例如吸收两个红色波长的光子可以激发一个吸收紫外的分子。双光子激发是一个非线性过程对激发光强度有平方依赖关系。使用单激发光源双光子具有相同的波长该技术被称为双光子激发荧光显微术。如果两个光子具有不同的波长就称作双色激发荧光显微术。双光子吸收几率依赖于两个入射光子在空间和时间上的重合程度(两个光子必须在-秒内到达)。双光子吸收截面很小对若丹明B一般为-cmsphoton-molecule-这样只有在具有很大光子流量的区域的荧光团才会被激发。钛宝石激光器等锁模的高峰值功率激光可以为双光子激发提供足够的强度。由于激发强度随到焦平面的距离的平方变化在z轴方向双光子激发几率随离焦距离的四次方衰减荧光团激发只发生在焦点内。用数值孔径为的物镜激发波长为纳米全部激发荧光的被局限在焦平面微米范围内激发体积大约为飞升与传统荧光显微镜相比该体积降低了倍。在激光扫描荧光显微术中双光子激发具有三维层析能力该三维层析效果可与共焦显微镜相比拟它还比具有另外两个优势:因为照明光在时间空间上汇聚没有离焦光漂白激发光不会被离焦吸收衰减因而有较大的穿透深度。双色激发比双光子激发的优势并不在于较高的分辨率而是在于小目标物经过较大散射媒质后更容易观察。事实上与双光子激发比较双色激发在焦点内荧光散射增加而干扰背景荧光只有很小增加。结合多光子荧光技术多光子共聚焦显微镜(MultiphotonExcitation-MPE)的发展成功的解决了传统共聚焦显微镜(单光子共聚焦显微镜)所存在的问题MPE的激光源是超快激光器(多为钛宝石激光器可以达到皮秒或者飞秒级的扫描速度)具有非常高的峰值功率和较低的平均功率从而可以减小或者消除光漂白和光毒作用。多光子的吸收现象是非线性效应只发生在聚焦焦点处不需要共聚焦孔径光阑滤光从而大大提高成像亮度和信噪比。在传统激光共聚焦显微镜中光通过出的所有样品都被激发所以必须用孔径光阑来选取焦点处样品发出的荧光。孔径光阑不仅遮挡了焦点以外样品发出的荧光而且也遮挡了焦点处散射和漫反射的荧光。在MPE中焦点处发出的所有荧光包括散射和漫反射的荧光都可以被收集并探测到。并且由于多光子实验所用的激发光的波长较长激发光的散射损失很小轴向分辨率更高样品的穿透能力更强。生物分子光子学转自香山科学会议网香山科学会议第次学术讨论会综述光子学技术在研究基因表达、蛋白质蛋白质相互作用、疾病早期诊断、新药研究、药效评价等方面正在或将会发生重要作用。随着激光技术、光谱技术、显微技术、计算机技术以及荧光标记技术的飞速发展结合多个学科探索光子学技术在生物分子研究及医学诊断与治疗中的应用已成为国际上迅速发展的领域。以“生物分子光子学”为主题的香山科学会议第次学术讨论会于年月~日在武汉华中科技大学举行。华中科技大学骆清铭教授和武汉大学庞代文教授担任执行主席。会议中心议题为:生物分子光学标记技术、生物分子间相互作用的光学成像、生物分子光学成像新技术与三维可视化、在体光学成像等。来自全国家单位的位专家学者参加了此次学术讨论会。骆清铭作了“生物分子光子学”的主题评述报告。指出由于光子具有极高的信息容量和效率、极快的响应能力、极强的互连能力与并行能力、极大的存储能力以及对检测样品的无损伤等优点光子技术在生命学科中的应用已成为国际上迅速发展的领域。蛋白质蛋白质相互作用是现代生命科学研究的重大科学问题之一因为这些相互作用不仅控制着基因转录、细胞分裂和细胞增殖同时还介导细胞坏死过程中的信号转导、致癌转化和调整等。传统研究方法虽然取得了非常重要的研究成果但还不足以解释生命活动的基本规律因此非常有必要发展一种能对蛋白质蛋白质相互作用进行在体无损成像的研究方法。他还介绍了目前国际同行对动物活体内基因表达与蛋白质蛋白质相互作用的在体光学成像领域的研究。他认为此项研究工作在国际上刚刚开始起步其主要涉及报告基因标记技术和微型正电子发射断层成像与光学成像检测技术。最新的研究表明采用报告基因的互补与重组策略可很好地实现动物活体内基因表达与蛋白质蛋白质相互作用的无损在体光学成像监测。他还对活细胞内基因表达与分子间相互作用动力学过程的实时在体光学成像的各项技术进行了评述并对各项技术的可能应用进行了展望。一、生物分子光学标记技术王柯敏教授作了“基于生物纳米颗粒和分子信标的荧光识别方法”的中心议题报告。他指出人们对生命现象的观察和研究已深入到单细胞、单分子和核酸的单个碱基这样的层次。为了更加准确地研究生物分子间的相互作用以及重大疾病的早期诊断迫切需要在更加微观的尺度(纳米尺度和单分子水平)上原位、活体、实时地获取各种生物化学信息。这对现有许多传统的、常规的分子生物学方法与手段是极大的挑战。光学标记技术与光学成像技术在研究基因表达以及蛋白质蛋白质相互作用的过程中为获取及利用各种生物化学信息提供了革命性的手段。他还指出合成各种尺寸的荧光纳米颗粒和荧光量子点纳米颗粒通过表面修饰的方法使其表面具有生物活性与生物靶向性利用纳米颗粒显著放大信号的优势将其用于活体细胞和动物器官的基因表达和蛋白质实时在体光学成像研究建立核酸切割过程、核酸磷酸化过程以及核酸连接过程的荧光监测方法实现核酸蛋白质相互作用的实时监测等可望在生命活动的基本规律研究方面发挥重要作用。庞代文教授在“纳米标记”专题发言中介绍了一种简便、安全、高效、廉价的核壳型量子点的合成新方法可大量制备性能优良的CdSeCdS和CdSeZnS等IIVI核壳型量子点。该方法操作安全、简便、重复性好、价格低廉为大规模工业化生产核壳型量子点奠定了基础。他们研制出具有生物分子(或特异细胞)识别(靶向)功能、荧光示踪功能、可操纵功能的多功能生物医用新材料并初步实现了癌细胞的靶向可视化富集抓取研制出基于纳米金标记放大技术的电化学DNA传感器提出“多级三维双放大”概念研制出基于纳米标记放大技术的目视化基因诊断芯片实现基因检测的直接目视化等。赵元弟教授在“纳米生物光子学”的专题发言中介绍了国际上一门新兴的交叉学科即结合纳米技术用于生物体系的光子学研究的纳米生物光子学。认为它应包括两个层次的研究一是在纳米尺度上研究生物问题的光子学包括纳米分辨光学显微成像技术、及光学纳米操纵与检测技术、以及光学纳米操纵与检测二是纳米光学技术在生物学中的应用如荧光共振能量转移(FRET)、分子信标和纳米荧光探针等。针对纳米荧光探针他以量子点为例按分子、细胞、组织和在体等层次介绍了其在生物分子光子学中的应用并指出以量子点的生物功能光学成像研究为代表的纳米生物光子学研究将是其实验室下阶段的主要研究方向。黄振立博士在“高通量药物筛选中的光子学技术”专题发言中介绍了国内外高通量药物筛选的研究现状、高通量药物筛选在创新药物发展中的作用、高通量药物筛选中的各种光子学编码技术以及高通量药物筛选中用于评价药效的光子学方法等。他指出发展研制具有我国自主知识产权的、用于高通量药物筛选的光学系统是现阶段我国创新药物开发研究的迫切要求这一点应受到国内同行的格外重视。姚祝军教授在“蛋白质标记和细胞生物学研究”的发言中指出传统影像学与生物分子影像学的区别在于一个是“群体和平均行为”一个是“单个分子和几个分子”水平一个是“结果”一个是“过程”一个是“推测可能的机理”一个是“清楚认识机理”。他指出:生物分子影像学的研究领域包括信号传导、基因转录、代谢运输、细胞生长、蛋白质构象变化与功能调节等小分子有机物标记具有许多优点如分子量小透膜性质好“可药性”强结构可以优化性质稳定、对研究对象干扰小等小分子标签对蛋白质的体内标记可通过基于自剪接多肽(instein)的对蛋白质的小分子标签、第三者的蛋白质专一性小分子标签、可逆且专一的蛋白质标签和共价键专一且不可逆的小分子标签等四种方式实现。讨论中大家一致认为光学标记技术是生物分子光子学的重要基础它在研究基因表达、蛋白质蛋白质相互作用、疾病早期诊断、新药研究、药效评价等方面正在发生重要作用。二、生物分子间相互作用的光学成像新加坡国立大学余严军教授在题为“光学成像技术在组织工程中的应用”的特邀报告中介绍了光学成像技术在肝组织工程中的实际应用。指出由于组织工程体外研究要求监测手段具有实时特异性***高分辨定量等特性因此光学成像技术很适宜此研究。余严军教授还介绍了肝组织工程中细胞培养过程中光学成像技术的具体应用如细胞功能的提升与定量细胞微环境的调控与定量细胞种植在棚架中成像问题等。邢达教授作了“FRET技术及其在蛋白质蛋白质相互作用研究中的应用”的中心议题报告。他指出荧光共振能量转移(FRET)具有在体无损伤的特点能动态地反映活细胞生理事件的时空变化以及细胞信号转导通路的时空传递特性因此可以在活细胞正常生理条件下无损伤地研究蛋白质蛋白质间相互作用。如检测各种酶活性的变化观测蛋白-蛋白相互作用追踪蛋白质在细胞内定位运动降解决定蛋白复合物中两蛋白分子间的构像等方面。他还对FRET在生命科学中的应用进行了评述认为可利用FRET原理进行细胞内蛋白激酶活性的检测细胞凋亡机理的研究Rasfamily蛋白激活的时空观测及机制研究利用FRET进行细胞膜受体研究以及在体成像中的应用。刘笔锋教授在“生物分子间相互作用研究中的光子学技术”的专题发言中重点评述了表面等离子共振、荧光共振能量转移、荧光漂白恢复和荧光相关光谱等光子学技术研究细胞内分子(包括核酸、蛋白质、代谢物和信号分子)相互作用的最新进展。他指出与其它检测方法(如电、磁、热和力学等)相比较光子学方法在原位、实时动态和高灵敏度监测生物分子相互作用方面具有不可替代的优势。他还指出发展多光子成像和新型分子标记技术以及在单分子水平上研究生物分子间相互作用将日益受到重视。何光源教授在题为“GFP在转基因植物研究中的应用”的专题发言中介绍了中英HUSTIACR作物基因工程和基因组学联合实验室采用的绿色荧光蛋白GFP标记光学成像方法在转基因植物研究中的应用。他指出GFP可作为报告基因在转基因研究中将发挥重要作用。讨论中与会专家认为由于FRET对距离非常敏感可研究同一蛋白的构象变化FRET今后的可能发展方向一个是亚细胞水平如单分子成像一个是在体的光学成像需探索FRET在热力学和动力学研究中的应用可能性。三、生物分子光学成像新技术与三维可视化美国纽约州立大学水牛城分校的郑炳今教授在题为“新型显微光学成像技术及应用”的特邀报告中介绍了多光子荧光显微镜的优势指出其在生物功能成像领域具有较为广泛的应用。同时郑炳今教授也详细介绍了他们在多光子荧光成像、二次谐波成像、三次谐波成像和荧光寿命成像方面做的一些工作如对植物光合作用的光学研究等。马辉教授在题为“多模式光学显微成像”的中心议题报告中介绍了当前扫描荧光成像荧光各向异性成像和二次谐波成像等光学成像技术的研究进展。还介绍了细胞水平的三维荧光显微成像比较了共聚焦和双光子显微镜的优缺点在讨论细胞水平的荧光各向异性成像和二次谐波成像中比较了它们与双光子显微成像的优缺点认为荧光的偏振包含着许多有用的信息应加以利用。对于生物学研究应加强不同方法之间的整合从不同角度去研究生物问题才有可能取得较好的结果。针对我国实验科学条件较薄弱的情况马辉教授指出应综合现有条件开展较为细致的工作。王桂英研究员在题为“生物分子光学成像新技术”的专题发言中介绍了四种非线性光学成像技术。她指出只有考虑光偏振才有可能获得分子级的信息。二次谐波成像SHG可以有效地研究分子的功能特别是对非中心对称的环境如双折射晶体有序界面和突变处(细胞膜结构蛋白序列等)的研究。但SHG共振增强会引起荧光光漂白和光毒性。三次谐波不需要中心非对称的环境它所探测的区域在膜的周围但困难是信号光在紫外普通光学系统无法解决。CARS和SERS两种喇曼显微镜有可能在单分子检测与成像方面得到较好的应用。李银妹教授在“光镊在生物大分子方面的应用”专题发言中介绍了纳米光镊技术在生物大分子研究中的应用进展。她指出要对生物大分子在生命过程中的行为和功能进行实验研究必须要有合适的实验手段。这种手段首先要能按照我们的愿望操纵和排布分子又不造成损伤和对它周围环境的干扰从而可以跟踪观察它们在真实生命活动中的基本过程。光镊技术恰恰在这一点上具有不可比拟的优势。纳米光镊技术的主要特点在于其操控对象的尺度延伸到了纳米量级光镊阱位或微粒的操控定位及位移测量均达到纳米精度可对fNpN量级的微小力实时测量因此可以很好地应用于对生物大分子进行精细操作和作用力的探测。田捷教授在“三维可视化技术研究进展”的专题发言中指出分子影像学应是多种信息的融合及其可视化其发展趋势是时间空间分辨率越来越高。海量数据给三维可视化带来了新的挑战对计算机技术提出了更高的要求。他提出可利用点绘制技术实现在普通PC上处理海量数据。点绘制技术由于其简单无需记录拓扑信息因此内存消耗低可快速地进行数据处理。讨论中与会专家认为光学成像新技术由于具有高时间、空间分辨率比现有其他手段更为直接因而可望成为后基因组时代新药靶发现和高通量药物筛选的新方法随着荧光基因标记技术的发展光学成像技术可以实时在体监测肿瘤病理生理动力学过程二次谐波对于空间的变化较为敏感因此在生物体系中可得到广泛的应用如细胞膜表面单分子的研究等。四、在体光学成像丁志华教授在“光学弱相干层析成像”的专题发言中介绍了当前光学弱相干层析成像技术的研究进展。丁志华教授指出利用光学相干层析成像技术可以对组织结构、功能和双折射特性进行高分辨的在体三维成像是临床医学诊断和分子影像学研究中的重要手段。***程博士在“内源信号光学成像”的专题发言中认为由于信号来源的多样性内源光信号成像有可能用于反映从神经元的电活动到脑皮层局部血液动力学响应的较宽范围的生理变化尤其是可对脑皮层功能活动引起的一系列代谢活动所导致的生色团状态改变时发生的吸收、荧光等光学特性的变化或组织本身光散射特性的变化进行研究。由于内源信号光学成像是到目前为止具有最高的空间分辨率和较高时间分辨率的在体脑功能成像技术且原理和实现相对较简单因此为研究脑皮层大范围内的功能构筑和信息处理机制提供了有力的工具有助于阐明脑功能成像信号和神经电活动之间的关系以及神经血管耦合的精确过程。讨论中与会专家认为全视场光学相干层析成像方法有高速成像的特点但信噪比差和动态范围小的缺点制约了该技术在实际生物问题中的应用内源信号光学成像可望在药物作用效果的在体监测方面发挥重要作用尤其是对心脑血管类药物的药效评价段树民教授特别指出利用内源信号光学成像进行神经科学的研究时应该考虑神经胶质细胞对内源性光信号变化的作用因为在脑皮层组织中神经胶质细胞占很大的比重结合外源性标记技术和化学方法可进一步阐明内源光信号变化的内在生理生化机制。五、会议总结骆清铭教授在总结性发言中指出生物分子光子学从多层次、多角度研究生命问题是当今科学发展的前沿问题但各种成像技术表征的生命本质规律还有待进一步研究在活体动物体内如何实现基因表达及蛋白质蛋白质相互作用的实时在体成像监测是当前迫切需要解决的重大核心科学技术问题这也是分子细胞生物学、信息科学(光学)、生物物理学和基础临床医学等学科共同感兴趣的重大基础问题对这一科学问题的研究不仅有助于阐明生命活动的基本规律、认识疾病的发生发展规律而且对创新药物研究、药物疗效评价以及发展疾病早期诊断技术(光子医学诊断技术)等产生重大影响以基因表达及蛋白质蛋白质相互作用研究为主要内容的生物分子光子学对生命科学及相关学科的发展至关重要对相关产业也会产生重要影响。与会专家就生物分子光子学的发展与应用提出了有关选准“切入点”促进多学科交叉研究扩展生物分子光子学的应用领域加大对光学检测设备研制投入的力度等建议。李增惠参会人员名单:骆清铭教授华中科技大学庞代文教授武汉大学赵元弟教授华中科技大学刘笔锋教授华中科技大学何光源教授华中科技大学黄振立博士华中科技大学***程教授华中科技大学田捷教授中科院自动化所许丹科研究员军事医学科学院余严军教授国立新加坡大学杨祥良教授华中科技大学郑炳今教授美国纽约州立大学李和教授华中科技大学黄国亮教授清华大学朱付平博士中科院自动化所马辉教授清华大学姚祝军研究员中科院上海有机化学所龚辉副教授华中科技大学丁志华教授浙江大学王柯敏教授湖南大学邢达教授华南师范大学王桂英研究员中科院上海光机所刘承宜教授华南师范大学杜冠华教授中国医学科学院徐可欣教授天津大学吕 华教授东南大学屈军乐助研深圳大学光电子学所李伟东副研中牧医药研究所李勤副教授北京理工大学李银妹教授中国科技大学张苏明教授华中科技大学段树民教授中科院上海神经科学所曹河圻副教授国家自然科学基金委赵爱民处长科技部生物工程开发中心杨炳忻教授香山科学会议李增惠研究员香山科学会议

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