分子实验报告

质粒DNA和λDNA的酶切、连接、转化及重组子的筛选、鉴定 韩阳  生技一班  20071401039 一、 实验原理 通过切割相邻的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶叫做核酸酶。核酸酶按照水解断裂核酸分子不同方式分为两类：一类是从核酸分子的末端开始，一个一个核苷酸地消化降解多核苷酸链，叫做核酸外切酶；另一类是从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂成小片段，叫做核酸内切酶。 限制性核酸内切酶：一类可以识别并切割特定DNA序列的核酸内切酶。其中以II型内切酶最为常用，大多数II型内切酶可以识别4—8个核苷酸构成的某一核苷酸序列，这一序列通常呈回文结构。一般来说，特异性识别序列越短，在DNA中出现的频率越大。限制酶的切割方式有三种，分别产生突出3’的粘性末端、突出5’的粘性末端和平末端，通常粘性末端更容易被DNA连接酶所连接。本实验使用的HindIII酶特异性识别DNA序列AAGCTT，并在AA之间处切割产生5’的粘性末端。 DNA连接酶：最初是在大肠杆菌细胞中发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。常用的DNA连接酶有E.Coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，其中前者只能催化双链DNA片段互补粘性末端之间的连接，而后者既可以用于双链DNA片段互补粘性末端之间的连接，还可以催化平末端的连接，但平末端连接效率低。本实验采用的是T4DNA连接酶。 HindiIII：从流感嗜血杆菌d株中发现并分离的第三种限制酶。 酶切方法： 1、双酶切法：如果只在要克隆的目的DNA两端具有不同的限制性核酸内切酶的识别位点而目的基因内部没有相应的识别序列，可用两种限制性内切酶切割，则目的DNA可产生两种不同的黏性末端。选择同样具有这两种限制性核酸内切酶识别位点的合适载体，酶切后，同样产生两个不同的黏性末端，当构建重组分子时，目的DNA片段可以一定的方向插入载体中，这样重组效率高，也有利于重组子的筛选。 2、单切酶法：如果目的DNA只能用一种限制性内切酶切割，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端。选择具有同样限制性核酸内切酶识别位点的合适载体在构建重组分子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象，因此重组效率较低。如果没有很好的方法区分转化子中的重组子，筛选重组子的工作量会很大。 pUC19载体在试验中能较简单地区分重组子，因而本实验采用pUC19+单切酶法的组合。 CaCl2制备感受态细胞： 经过CaCl2处理的细胞细胞膜通透性增加，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。在低温下，将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合，经过热击或电穿孔技术，使载体分子进入受体细胞。进入受体细胞的外源DNA分子通过复制、表达，使受体细胞出现新的性状。将这些转化后的细胞在选择培养基上培养，即可筛选出重组子。 本实验以E.coliDH5菌株为受体细胞，用CaCl2处理，使其处于感受态，然后将pUC19质粒在42摄氏度下热击90s，实现转化。质粒pUC19携带有氨苄青霉素抗性基因，在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子。没有导入质粒pUC19的受体细胞，在含有氨苄青霉素的培养基上不生长。质粒pUC19进入E.coliDH5后，通过-互补作用，形成完整的-半乳糖苷酶。在麦康凯培养基平板上，转化子利用-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸pH降低，培养基中的指示剂变红，转化子的菌落变成红色。不含质粒的E.coliDH5，没有-半乳糖苷酶活性，不能利用培养基中的乳糖产生有机酸，而是利用培养基中的有机碳源，不使培养基中的pH降低，在不含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。挑取在氨苄青霉素培养基上生长的红色菌落，通过扩增培养，可将转化的质粒提取出来，然后后续的酶切，连接等操作。 互补红白筛选法： pUC19质粒含有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中含有-半乳糖苷酸基因(lacZ)的调控序列和其N端146个氨基酸编码区。这个编码区中插入一个多克隆位点。受体菌则含编码-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。二者分别独立时，均没有表现出-半乳糖苷酶的活性，当外源基因插入后，将质粒转化入受体菌中，即可有-半乳糖苷酶表达，这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的-半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补的现象叫—互补。在麦康凯培养基上，—互补产生的Lac+细菌由于含-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去—互补能力，因而不产生-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色，可将重组质粒和自身环化的载体DNA分开，即红白筛选。 酶切鉴定： 限制性内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内切断DNA的双链，形成一定长度和顺序DNA片段。限制性内切酶对环状质粒DNA有多少切口，就能产生多少酶切片段，因此鉴定酶切后的片段在电泳凝胶的区带数，就可推断酶切口的数目，从片段的迁移率可以大致判断酶切片段大小的差别。用已知相对分子质量的线状DNA对照，通过电泳迁移率的比较，就可以粗略推测分子形状相同的未知DNA的相对分子质量。 二、 实验试剂和器材 试剂： 去离子水、loading buffer、TAE、agarose粉状、EB溶液、限制性核酸内切酶（HindIII）及相应缓冲液、T4连接酶及相应缓冲液、pUC19商品质粒、实验一提取的pUC19质粒、λ噬菌体DNA、100mmol/L CaCl2溶液、LB培养基、麦康凯培养基、氨苄青霉素母液、Omega E.Z.N.A质粒提取试剂盒 器材： 微量移液器、制冰机、灭菌锅、恒温水浴锅、高速离心机、电泳仪和电泳槽、凝胶成像仪、Eppendorf管（灭菌）、枪头及枪头盒（灭菌）、离心管（灭菌）、恒温震荡培养箱、计时器、培养皿（灭菌）、500ml锥形瓶及棉塞（灭菌）、大试管及棉塞（灭菌）、试管架、牙签（灭菌）、 三、 实验步骤  （1）感受态细胞的制备： 1、将E.coli DH5α受体菌接入到LB平板，在37摄氏度的条件下过夜培养，挑取1%单菌落转接至20mlLB培养基中，在37摄氏度下保温2.5-3h。 2、将处理后的菌液加入到两只离心管中，每支离心管中为1.5ml。然后将两只离心管放入离心机中，在5000rpm转速下10min。 3、重复收集菌体一次，去掉上清液，向管中加入1ml 0.1M CaCl2并混匀。然后将两只管冰浴15min。 4、再一次离心，尽可能地弃掉上清液（可以吸干上清液），然后再加入100μl 0.1 M CaCl2，混匀，然后冰浴4h以上。 注意事项： 感受态细胞必须从纯菌种。要从划线纯化的单菌落开始，进行活化培养，不要使用多次转接或储存在4摄氏度的培养菌液，其目的是保持菌株的纯度和活力。 1、 转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，当加入外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率反而会降低。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。 2、 转化过程要防止杂菌和其他DNA的污染，整个操作过程均应在无菌条件下进行。所用器皿如离心管、吸头等均为一次性使用的，并经过高温灭菌处理，所用试剂也需高温灭菌或过滤除菌，以防被微生物DNA污染。 （2）转化实验： 1、 取三份感受态细胞分量分别为50l ，50l，100l。第一份50l什么也不加，第二份50l加入2lpUC19质粒，第三份100l加入10l连接液，分别混匀。 2、将三支管都冰浴30min，然后放入到42摄氏度中2min，然后冰浴5min。然后分别加入LB溶液各500l。摇匀，在37摄氏度条件下复苏培养1h。 3、将培养液分别涂布于含有氨苄青霉素和不含氨苄青霉素的麦康凯培养基平板。 4、当菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，于37摄氏度条件下恒温培养24h。 5、根据生长状况挑选重组子。 注意事项： 1、 转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，当加入外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率反而会降低。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。 2、 转化过程要防止杂菌和其他DNA的污染，整个操作过程均应在无菌条件下进行。所用器皿如离心管、吸头等均为一次性使用的，并经过高温灭菌处理，所用试剂也需高温灭菌或过滤除菌，以防被微生物DNA污染。 （3）重组子鉴定： 将白色的转化子划线培养到到含氨苄青霉素的麦康凯培养基上，37摄氏度条件下恒温过夜。 （4）重组质粒DNA的提取： 1、用接种环取一环白色菌落接种到20ml LB溶液中，在37摄氏度条件下过夜培养，取3ml菌液用试剂盒装载质粒。 2、取1.5ml菌液加入到新Eppendorf管，然后在10000rpm条件下离心一分钟，然后重复此操作一次，弃掉上清液。 3、向弃上清液后的管中加入250l溶液I，充分悬浮细胞。 4、再向管中加入250l溶液II，轻轻翻转倒置数次获得透明裂解液。 5、再加入350l溶液III，立即翻转倒置数次直至絮状沉淀生成。 6、将离心管放入到离心机中10000rpm 10min。 7、小心吸取上清液至柱中（置于收集管中），然后10000rpm离心1min，然后弃掉管中液体。 8、加入500l  buffer HB于柱中，在离心机中离心10000rpm 1min。弃掉管中液体，加入700l wash buffer，然后再次10000rpm 离心1min。重复洗一次。 9、空柱干燥后放入离心机中10000rpm 2min。 10、将空柱置于新管中，加入50l Elution buffer于柱中心，然后在室温条件下搁置1-2min，然后在12000rpm条件下离心1min。 （5）重组质粒DNA的电泳检测 四、实验结果及结果 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 1、pUC19质粒酶切结果： 1  2  3  4  5  6  7  8  9  10 11  12  13 14  15 16  17  18 现在对这张电泳图做一些解释： 1：起对照作用的pUC19 和pUC19 （HindIII作用） 2：起对照作用的DNA Marker：λ（ HindIII作用） 3—14组是我们十二个组的pUC19 （HindIII作用）。我们组的是在5号电泳道上。 15-18组是选出的四个小组多做的4个λ（ HindIII作用）。