用微卫星序列构建羊草遗传指纹图谱

用微卫星序列构建羊草遗传指纹图谱 () 植 物 学 报 2000 , 42 9:985 - 987 Acta B ota nica Si nica 快讯? Short Communication? 用微卫星序列构建羊草遗传指纹图谱 3 刘 杰 刘公社 齐冬梅 李芳芳 ( )中国科学院植物研究所 , 北京 100093 关键词 : 羊草 ; 指纹图谱 ; SSR () 中图分类号 : Q943 文献标识码 : A 文章编号 : 057727496 20000920985203 Construction of Genetic Fingerprints of Ane urolepidi um c hi ne nsis Using Microsatellite Sequences 3 L IU J ie , L IU Gong- She , QI Dong-Mei , L I Fang- Fang ( )Institute of Botany , The Chinese Academy of Sciences , Beijing 100093 , China ( ) ) ( Abstract : The genetic fingerprints of Chinese wildrye A neurolepidium chinensis Trin. Kitagwere con2 structed by Southern blot analysis of Ase ?- , Dra ?- , EcoR ?- , Hind ?- , Nco ?- , Mob ?- , Rsa ?- , Pst ( ) ( ) ( ) ?- , Taq ?- digested genomic DNA probed with synthesized oligonucleotide , CT, GCTA, GGATor 8 4 4 ( ) GACA. The difference between“J isheng 4”and Chinese wildrye was shown by RFLP analysis of Dra ?- or4 ( ) Rsa ?- digested genomic DNAs probed with GCTA. DNA fragments were obtained by PCR performed with 4 ( ) ( ) ( ) ( ) genomic DNA of“J isheng 4”as a template and CT, GCTA, GGATor GACAas primer . Five size 8 4 4 4 ( ) 2325 ,1455 , 876 ,774 and 299 bp fragments were amplified when GGATwas used , indicating satisfied re2 4 sults were obtained. ( )Key words : Chinese wildrye ; fingerprint ; SSR simple sequence repeats DNA 指纹技术 ,特别是以 PCR 为基础的分子标 , 撒 播 在 花 盆 里 , 置 于 温 室 中 , 30 d 后 单 株 取 眠后 1 ,2 记技术已经在诸多领域得到广泛应用。20 世纪100 mg 幼嫩真叶 ,按常规 CTAB 法提取羊草总 DNA 。 7 ( ) 酶切 、90 年代发展起来的 SSR simple seguence repeats又称 Southern 吸印及分子杂交 , 参 照 Reinhold的 微卫星技术 ,是利用在所有真核生物中广泛存在的 方法 。DNA 酶切采用 9 种常用的限制性内切酶 : Ase 3 SSR 多态性位点进行生物遗传多样性 、亲缘关系 ?、Dra ?、EcoR ?、Hind ?、Nco ?、Mob ?、Rsa ?、 4 ( ) ( Pst ?和 Taq ?。寡聚核苷酸重复序列 CT、GC2分析 、图谱构造以及群体结构研究的新方法。孔 8 5 ( ) ( ) ) 秀英等用 RAPD 方法分析了山羊草属的 5 个基因 TA、GGAT、GACA由上海生工生物工程公司 4 4 4 6 组之间的亲缘关系 ; Elizabeth 等用两种方法成功 合成 。 μ 地分离了黑麦草的 SSR 标记 。然而有关羊 草 SSR PCR 反应总体积为 25 L ,其组分为 :10 × buffer μ( ) μ( 2 . 5 L , MgCl25 mmol/ L 2 L , dNTPs 2 . 5 2 技术的应用研究则尚未见报道 。本文采用人工设计 ) μ( ) μmmol/ L1 L ,引物 50 mg/ L0 . 5 L ,基因组 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 ( ) ( ) ( ) ( ) 的 CT、GCTA、GGAT、GACA寡聚核苷酸 8 4 4 4 () μ( DNA 50 . 6 mg/ L2 L , Tagplus ? DNA 聚合酶 5 作为探针和引物 ,对我国野生的和栽培的羊草进行 μ) μ) (U/L购自上海生工生物工程公司0 . 2 L , 超纯 了初步分析 ,旨在为分子标记技术在羊草这一重要 μμ水17 . 2L , 加 15 L 石蜡油后 ,于 Amp Gene PCR 仪 牧草上得到进一步的应用 ,为羊草优良品种的选育 上进行 PCR 扩增 ,反应参数为 : 94 ?变性 4 min ,然 提供新的方法 。 后每个循环 94 ? 50 s ,50 ? 90 s , 72 ? 90 s ,30 个 循环后 ,72 ?延伸 10 min ; 反应结束后 PCR 产物在 1 材料和方法 ( ( ) ) 1 . 2 % 琼脂糖胶 EB 溴化乙淀含量 0 . 5 mg/ L中 ,( 野生羊草 A neurolepidium chinensis ( ) )Trin. Kitag 80 V 电泳 1 . 5 h ;电泳结束后 ,紫外灯检测并照相 。和栽培品种羊草“吉生 4 号”种子经低温处理打破休 收稿日期 : 2000- 05- 26 接受日期 : 2000- 06- 23 基金项目 : 中国科学院“九五”重点项目 。Foundation item : A“95”Key Project of the Chinese Academy of Sciences. 3 通讯作者 。Author for correspondence . 一步用作探测 SSR 位点的有用标记 。我们用 4 种人 2 结果和讨论 ( ) ( ) ( ) ( ) 工合成的引物 CT, GCTA, GGAT, GACA8 4 4 4 作为单 引 物 对“吉 生 4 号 ”羊 草 基 因 组 DNA 进 行 我们用 4 种人工合成的 16 个碱基的短 SSR 序 ( ) PCR 反应 , 均得到了扩增产物 。图 2 为以 GCTA4 列作探针 ,用 9 种不同的限制性内切酶对羊草基因 为引物对“吉生 4 号”10 个单株的基因组 DNA 进行 ( ) 组 DNA 进行 Southern 分析 ,其中探针 GCTA得到 PCR 反应所得到的结果 。在琼脂糖胶上 ,每个单株 4 都在 2325 、1455 、876 、774 、299 bp 处扩增出 5 条较强 的结果如图 1 。 的条带 ,呈现良好的稳定性 ,且重复性良好 。 ( ) 图 2. 以 GCTA为引物对“吉生 4 号”羊草 10 个单株的基 4 因组 DNA 进行 PCR 反应所得到的指纹图谱 。 Fig. 2. Fingerprints of“Jisheng 4”. PCR was performed with the genomic DNA of different single plant () ( ) lanes 1,10of“Jisheng 4”as template and GCTAas primer. 4 ( ) 与 9 种 限 制 性 内 切 酶 组 合 与 羊 草 基 因 组 GCTA图 1. 4 () The molecular marker Lane Mis Hind ?- and EcoR ?- digested DNA Southern 杂交结果 。 λ - DNA.Fig. 1. Southern blot analysis of the genemic DNA of Chinese ( ) wildrye probed with GCTA. 4 Lanes 1’,1 , degisted with Dra ?; Lanes 2’, 2 , degisted with Rsa本文探讨了两种应用合成微卫星序列对羊草进 ?; Lanes 3,9 , degisted with Ase ?, EcoR ?, Hind ?, Mbo行分子标记研究的方法 : 用短微卫星重复序列作为 ?, Nco ?, Pst ? and Taq ?, respectively. “Jisheng 4”and Chinese wildrye can be distinguished by the difference bands in their 探针对羊草基因组 DNA 进行 RFLP 分析 ,并构建了 patterns , some of which are marked by arrow. 羊草的遗传指纹图谱 ; 以这种重复序列为引物进行 单引物的 PCR 反应 ,可以对微卫星位点旁侧的 DNA ( ) GCTA与 9 种不同的限制性内切酶组合对 用 4 序列进行直接扩增 。 野生羊草基因组 DNA 进行 Southern 杂交 ,均可产生 利用有效的寡聚重复序列探针 、酶组合的 RFLP 5,15 条杂交带 ,只有 EcoR ?和 Hind ?由于能切 6 技术可以鉴别羊草不同基因型之间的差异 。用这种 个碱基 ,产生的酶切片断较大 ,杂交片断数目较少 , 方法可以构建羊草的遗传指纹图谱 ,并可筛选出更 位于胶的上部 。而 Dra ?和 Rsa ?均可产生多于 15 多的有效探针 。微卫星这种寡聚重复序列的多位点 条杂交片断 ,是比较理想的探针 、内切酶组合 ,可进 探针与来自于 cDNA 片断 、基因组 DNA 片断和直接 一步用于个体间或群体内的多态分析 。进一步的实 从染色体上克隆的 DNA 片断的单位点探针比较 ,更 ( ) 验是用 Dra ?、Rsa ?与 GCTA组合对羊草栽培品 4 容易研究植物自然群体的遗传结构和无性系的鉴 种“吉生 4 号”基因组 DNA 进行 Southern 分析 ,得到 8 ,因此特别适用于羊草这种以无性繁殖为主的 定的结果与野生羊草进行比较 ,所产生的杂交片断中 , 群落植物 。为羊草进一步的研究 ,如遗传图谱构建 、 ( 除具有公共条带外 ,在 3 处具有明显的差异带 图 1 ) 箭头所示。这一实验结果说明用一种适当探针 、酶 亲缘关系分析 、生物多样性研究 ,提供了一种有效的 组合 , 可区分羊草不同品种之间的差别 , 用 短 SSR 技术手段 。 用微卫星寡聚核苷酸重复序列为引物( ) 序列 GCTA4 为探针对羊草基因组 DNA 进行分析 对夹在相 可产生有意义的遗传指纹 。 同 SSR 位点之间的羊草基因组 DNA 直接进行 PCR 用寡聚核苷酸重复序列为单引物对羊草基因组 扩增 ,可得到某些微卫星座位的最初信息 。由此可 DNA 进行 PCR 扩增 , 可分析某 些 微 卫 星 的 旁 侧 序 列 。这种 PCR 反应可扩增出夹在 2 个相同 SSR 位 以克隆出位于单一 SSR 位点两侧的旁侧序列 ,这对 点中间的短 DNA 片断 。这些 DNA 片断测序后可进 于研究单一微卫星重复数目的变异 ,合成有效 SSR 引物标记具有重要意义 。 987 9 期 刘 杰等 : 用微卫星序列构建羊草遗传指纹图谱 Weising K , Kahl G. DNA fingerprinting in plants- The po2 4 ] 致谢 : 感谢吉林畜牧研究所王克平研究员 、内蒙古 tential of a new method. Biotech Forum Europe , 1990 , 7 : 多伦县草原站提供羊草“吉生 4 号”、野生羊草种子 。 230 - 235. 感谢中国科学院植物研究所宋艳茹研究员对本文文 ( ) ( ) ( 5 ] Kong X- Y孔秀英, Ge C- M 葛 春 民, Jia J- Z 贾 继 ) ( ) 增, Dong Y- K 董 玉 琛 , Richard R- C Wang. RAPD 字的审校 。 analysis of phylogeny for five basic genomes in Aegilops . Ac2 ( ) ( ta B ot Sin 植 物 学 报 , 1999 , 41 : 393 - 397. in Chi2参考文献 : )nese Elizabeth S J , Mark D , John W F. Isolation of simple se2 6 ] 1 ] Caetano- Anolles G. MAAP : a versatile and universal tool ( ) quence repeat SSRmarkers for use as breeding tools in for genome analysis. Plant Mol J Biol , 1994 , 25 : 1011 - L olium perenne. Plant Animal Genome , 1999 ,VII :456. 1026. Reinhold B. RFLP analysis. Karp A , Isaac B G , Intgram D 7 ] Welsh J , McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR 2 ] S. Molecular Tools for Screening Biodiversity. London : with arbitrary primers. 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