生化实验的基本操作注意事项　

　生化实验的基本操作注意事项　 生化实验的基本操作注意事项 (一)搅拌和振荡 1.配制溶液时，必须随时搅拌或振荡混合。配制完了时，必须充分搅拌或振荡混合。 2.搅拌使用的玻璃搅棒，必须两头都烧圆滑。 3.搅棒的粗细长短，必须与容器的大小和所配制的溶液的多少呈适当比例关系。不能用长而粗的搅棒去搅拌小离心管中的少量溶液。 4.搅拌时，尽量使搅棒沿着器壁运动，不搅入空气，不使溶液飞溅。 5.倾入液体时，必须沿器壁慢慢倾人以免有大量空气混入。倾倒表面张力低的液体(如蛋白质溶液)时，更需缓慢仔细。 6.振荡溶液时，应沿着圆圈转动容器，不应上下振荡。 7.振荡混合小离心管中液体时，可将离心管握在手中，以手腕、肘或肩作轴来旋转离心管; 也可由一手持离心管上端用另一手弹动离心管;也可用一手大拇指和食指持管的上端，用其余三个手指弹动离心管。手指持管的松紧要随着振动的幅度变化。还可以把双手掌心相对合拢，住离心管，来回挫动。 8.在容量瓶中，混合液体时，应倒持容量瓶摇动，用食指或手心顶住瓶塞，并不时翻转容量瓶。 9.在分液漏斗中振荡液体时，应用一手在适当斜度下倒持漏斗，用食指或手心顶住瓶塞，并用另一手控制漏斗的活塞。一边振荡，一边开动活塞，使气体可以随时由漏斗泄出。 10.研磨配制肢体溶液时，要使杵棒沿着研钵的单方向进行，不要来回研磨。 (二)沉淀的过滤和洗涤 1.过滤沉淀一般使用滤纸。 2.应根据沉淀的性质选择不同的滤纸.胶状沉淀,应使用质松孔大的滤纸.一般大小颗粒的结晶形成沉淀,应使用致密孔小的滤纸。而极细的沉淀，则应使用致密孔最小的滤纸。滤纸越致密，过滤就越慢。 3.滤纸的大小要由沉淀量来决定，并不是由溶液的体积来决定。沉淀量应装到滤纸高度的1,3左右。最多不应超过1,2，通常使用直径为7-9厘米的圆形滤纸。 4.折叠滤纸应先整齐的对折，错开一点再对折，打开后形成一边一层，一边三层的圆锥体。折叠尖端时不可过于用力，以免容易出洞。放入漏斗中时，滤纸边缘应完全吻合。撕去三层一边的外面两层部分的尖端，使滤纸上缘能更好的贴在漏斗的壁上，不留缝隙。而下面部分则有空隙以利于提高过滤速度。 5.滤纸上缘一般应低于漏斗口上周0.5至1厘米。润湿滤纸时应用指尖轻压滤纸赶净滤纸和漏斗间的气泡，使滤纸紧贴漏斗壁。同时漏斗颈内必须充满液体，这样，才可籍液体的重量而对于待液体产生吸滤作用。 第 1 页 共 7 页 6.过渡时，为了防止沉淀堵塞滤纸的孔洞，通常采用倾泄法，即先小心的把溶液倾入漏斗而不使沉淀流入，只在过滤的最后一步才把沉淀转移到漏斗上。 7.过滤时，将玻璃棒直立在三层滤纸的中间部分，其下端接近但不能触及滤纸，并使盛器紧贴玻棒，使液体顺玻棒缓缓流入漏斗。液体最多加到距滤纸上缘3-4毫米处，过多则沉淀会因滤纸的毛细管作用而爬到漏斗壁上去。 8.在容器中洗涤沉淀一般采用倾注法。洗涤时，采取少量多次的方法最为有效。通常，容易洗涤的粗粒晶形沉淀洗 2—3次，难洗涤的粘稠无定形沉淀则需洗 5—6次。注意，每次都应尽量倾以增加洗涤效率，并防止沉淀流失。 9.转移沉淀时，先向沉淀中加入滤纸一次所能容纳量的洗涤液，搅拌成为混悬液，不要等待沉淀下沉，立即按倾注清液的同样方式倾入漏斗。容器内剩余的沉淀可以用少量洗涤液按上述方法重复数次，直到全部转移到漏斗内。 10.在漏斗内洗涤沉淀时，先将沉淀轻轻摊开在漏斗下部，再用滴管(或洗瓶)将洗涤液加入到漏斗上缘稍下的地方，同时转动漏斗，并使洗涤液沿着漏斗不断向下移动，直到洗涤液充满滤纸一半时立即停止。待漏斗中洗涤液完全漏出后，再进行第二次洗涤。通常，完全洗去沉淀所吸附的不择发物质，约需8—10次左右。确知沉淀已经洗净，需要进行必要的检验。必须注意，沉淀的过滤和洗涤工作一定要一次完成，不可间断。 (三)烘箱和恒温箱的使用 烘箱又叫干燥箱，常用的是电热鼓风干燥箱。干燥箱用于物品之干燥和干热灭菌，工作温度为50—250?。恒温箱又叫培养箱，用于细菌、生物培养等，工作温度自室温以上至60?。这两种仪器工作原理、结构及使用方法相似。 1.使用方法: (1)检查温度计是否插入座内，应插在放气调节器中部的小孔内。 (2)把电源插头插好，合上电闸。 (3)将电热丝分组开关的旋钮拨到(l)或(2)(视需要的温度而定)，再将自动恒温控制旋扭沿顺时针方向旋转，指示灯红灯亮表示电热丝开始加热。此时也可开鼓风机帮助箱内热空气对流。 (4)在恒温过程中，应注意观察温度计。待温度将要达到需要温度值(差2—3?)时，使指示灯绿灯正好发亮，此时表示电热丝停止加热，箱内温度即能自动控制在所需要的温度(?0.5?)。 (5)恒温过程中，如不需要多组电热丝同时加热时，应将电热丝分组开关的旋钮拨到(1)档。 (6)工作一定时间后需要将潮气排出，可打开放气调节器，也可打开鼓风机。 (7)使用完后，关闭鼓风机马达开关，将电热丝分组开关旋钮和自动恒温控制旋扭沿反时针方向施回至零 第 2 页 共 7 页 位。 (8)断开电闸，将电源插头拨出插座。 2.注意事项: (1)使用前应检查电源(电压、电流)是否符合规定，地线是否接妥。 (2)挥发性物品，如盛有有机溶剂的器皿，不能放入，以防火灾和爆炸。 (3)安放物品时，应小心，不要触及自动恒温控制器的窗筒和温度计，以免损坏部件。安放物品后应立即关好箱门，以便保持温度恒定。 (4)烘烤洗刷完的仪器时，应尽量将水珠甩去再放人烘箱内。干燥后，待温度降至60?以下方可取出物品。注意，若温度超过 180?，箱内棉花或纸张则烤焦，玻璃器皿则易破损。 (5)电热鼓风干燥箱的电动机轴承，每年至少加润滑油一次。 (6)仪器必须有良好地线( (7)仪器附近不能放置易燃物品。’ (8)检修时不能带电操作。 (四)电动离心机 在实验过程中，欲使沉淀与母液分开，有过滤和离心两种方法。在下述情况下，使用离心方法较为合适。 (1)沉淀有粘性。 (2)沉淀颗粒小，容易透过滤纸。 (3)沉淀量过多而疏松。 (4)沉淀量很少，需要定量测定。 (5)母液粘调。 (6)母液量很少，分离时应减少损失。。 (7)沉淀和母液必须迅速分离开。 (8)一般肢体溶液。 离心机是利用离心力对混合溶液进行分离和沉淀的一种专用仪器。电动离心机通常分为大、中、小三种类型。在此只介绍生物化学实验室使用的小型台式或落地式电动离心机。 1.操作: (1) 使用前应先检查变速旋钮是否在“0”处。外套管应完整不漏，外套管底部需放有橡皮垫。 (2) 离心时先将待离心的物质转移到大小合适的离心管内，盛量不宜过多(占管的2,3体积)，以免溢出。将此离心管放入外套管，再在离心管与外套管间加入缓冲用水。 第 3 页 共 7 页 (3) 一对外套管(连同离心管)放在台称上平衡，如不平衡，可调整离心管内容物的量或缓冲用水的量。每次离心操作，都必须严格遵守平衡的要求，否则将会损坏离心机部件，甚至造成严重事故，应该十分警惕。 (4) 将以上两个平衡好的套管，按对称方向放到离心机中，盖严离心机盖，并把不用的离心套管取出。 (5)开动时，先开电门，然后慢慢拨动旋钮，使速度逐渐增加。停止时，先将旋钮拨动到“0”，不继续使用时拔下插头，待离心机自动停止后，才能打开离心机盖并取出样品，绝对不能用手阻止离心机转动。 (6)用完后，将套管中的橡皮垫洗净，保管好。冲洗外套管，倒立放置使其干燥。 2.注意事项: (1)离心过程中，若听到特殊响声，表明离心管可能破碎，应立即停止离心。如果管已破碎，将玻璃渣冲洗干净(玻璃渣不能倒入下水道)，然后换新管按上述操作重新离心。若管来破碎，也需要重新平衡后再离心。 (2)有机溶剂和酚等会腐蚀塑料套管，盐溶液会腐蚀金属套管。若有渗漏现象，必须及时擦洗干净漏出的溶液，并更换套管。 (3)避免连续使用时间过长。一般大离心机用40分钟休息20或30分钟，台式小离心机用40分钟休息10分钟。 (4)电源电压应与离心机所需要的电压一致。接地线后，才能通电使用。 (5)一年应检查一次离心机内电动机的电刷与整流子磨损情况，严重时更换电刷或轴承。 (五)分光光度计 根据物质的吸收光谱进行定性或定量分析的方法称为吸收光谱法，或分光光度法。该法所用的仪器称为分光光度计，或吸收光谱仪。如:用于可见光及紫外光区域的吸收光谱仪，通常叫做分光光度计;用于红外光区域的吸收光谱仪，简称为红外光谱仪。 分光光度计的工作原理与光电比色计相似，两者的主要区别在于:首先，分光光度计的单色光器(通过棱镜或光栅)比滤光片所选择的波长范围要小的多。前者为3—5毫微米，是较纯的单色光，而后者为30—50毫微米。其次，分光光度计不仅能在可见光区域内测定有色物质的吸收光谱，而且也能在紫外及红外光区域测定无色物质的吸收光谱。多数情况下，样品不需要显色就能进行定性和定量分析。另外，微电流检流计也比较精 -8-9密。如:581,G型的灵敏度为0.5×10安培,格， 72型分光光度计为 1.4—2.0×10安培/格。分光光度计还增加了稳压装置。因此，分光光度法优越于光电比色法。在此着重介绍国产72型分光光度计和751型分光光度计的使用。 1、72型分光光度:72型分光光度计是可见光分光光度计，其波长范围为420—720毫微米。 (1)操作方法: ? 按照接线要求，将稳压器和检流计连接在单色器上。注意，将检流计与单色器相接时，应按三股接线的 第 4 页 共 7 页 颜色准确连接。而稳压器的输出接线柱与单色器相接。 ? 在电源电压与仪器要求的电压相符时，分别插上稳压器和检流计的电源插头。 ? 将单色器的光路闸门找到黑点(关闭光路的指示)位置后，再将检流计上的电源开关旋到“开”处。此时，指示光点即出现在标尺上，用零点调节器将光点中线准确地调至透光率标尺的。“0”位上。 ? 打开稳压器的电源开关和单色器的光源开关，隔10分钟，再使用仪器。 ? 将比色杯架暗厢盖打开，取出比色杯架，将4支比色杯中的1支装入空白溶液或蒸馏水，其余3支装入待测液。将比色杯置于架上，空白溶液杯应放在第一格内，放回暗厢内，盖好暗厢盖。此时，空白溶液杯应在光路上。 ? 旋转波长调节器，将所需波长对准红线。把光路闸门拨到红点(打开光路的指示)位置上，并以顺时针方向旋动光点调节器，使光点中线移至透光率“100”的刻度处。数分钟后，待光电池趋于稳定，再轻轻转动光点调节器，使光点中线准确地处于透光率“100”的位置。 ? 将单色器的光路闸门拨回黑点处，校正检流计的光点中线于“0”位上。然后，立即开启光路闸门，拨至红点处，校正检流计光点中线对准透光率“100”刻度上。 ? 调节好后，可以进行样品溶液的测定。将比色杯定位装置的拉杆轻轻地拉出一格，使第二个比色杯内的待测液进人光路。此时，检流计标尺上光点中心线所指示的读教，即为该溶液的光密度或透光率。依此测定第二、第三个待测液，并读出数据。重复2—3次后，取其平均值。 ? 在测定过程中，应经常关闭光路闸门，核对检流计的零点位置。如有改变，及时用零点调节器核准。 ? 测定完毕，将每个旋钮、开关和调节器等复原或关闭。拔掉电源插头，切断电源，并盖好仪器罩。 (2)注意事项: ? 仪器连续使用时间不应超过2小时，每次使用后需要间歇半小时以上才能再用。 ? 测定某未知待测液时，先制作该溶液的吸收光谱曲线，再选择最大吸收峰的波长作为测定的波长。每次读教后将空白杯推入光路，检流计光点中线仍位于透光率“100”，则读数有效。 ? 其他注意事项与光电比色计相同。 2、751型分光光度计:751型分光光度计是可见光和紫外光分光光度计，其波长范围为200—1000毫微米。 (1)操作方法: ? 在电源电压与仪器要求的电压相符时，插上电源插头。 ? 仪器装有两个光源灯。钨灯的波长范围为320—1000毫微米，氢灯为320毫微米以下。拨动光源灯座的把手，将选用的光源灯置于光路中。根据需要可以在光路中插入滤光片，以减少杂散光，一般情况下无此必要。 ? 检查仪器各种开关和旋钮，处于关闭位置时，打开电源开关，预热20分钟。 第 5 页 共 7 页 ? 选择适当的比色杯，测定波长在350毫微米以上时，用玻璃比色杯;若在350毫微米以下，必须使用石英比色杯。比色杯盛入溶液后，放在比色杯架上，然后再放人暗厢内，盖好盖板。此时，空白溶液或蒸馏水的比色杯恰好处于光路中。 ? 选择适当的光电管。测定的波长范围在200—626毫微米内，用蓝敏光电管，应将手柄推入:若在625—1000毫微米范围以内，用红敏光电管，应将手柄拉出。 ? 将选择开关扳至“校正”位置后，转动选择波长的旋钮，使波长刻度对准所需要的波长。 ? 调节暗电流旋钮，使电表指针对准“0”位置。为了得到较高的准确度(每测量一次都应校正暗电流一次。 ? 调节灵敏度旋钮，在正常情况下，从关闭的位置起沿顺时针方向转动3—5圈。 ? 转动读数电位器旋钮，使刻度盘处于透光率100%位置。然后，把选择开关扳至“ ×1”位置。再拉开暗电流闸门，使单色光进人光电管。 ? 调节狭缝旋钮，使电表指针处于“0”位置附近，再用灵敏度旋钮仔细调节，使电表指针准确地位于“0”’处。 ? 完成上述操作后将比色杯定位装置的手柄轻轻地拉出一格，使第二个比色杯的待测液处于光路中。注意，应使滑动板准确地位于定位槽内。这时电表指针偏离“0”位。再转动读数电位器旋钮，重新使电表指针对准“0”位，刻度盘上的读数即为该待测液的光密度或透光率。依此测定第二、第三个待测液，并读出数据。 ? 完成一次测量后，立即关上暗电流闸门，以保护光电管。 ? 在读数时，若选择开关处于“×1”位置，光密度(即消光)范围为0—?，透光率是O,100%。当透光率小于10%时，则可把选择开关扳至“× 0.1”位置。这时，读出的透光率数值，应除以“10”;而读出的光密度值，则应加上“1(0”。 ? 测定完毕，将每个开关、旋钮、操作手柄等复原或关闭。拔掉电源插头，以切断电源，并盖好仪器罩。 (2)注意事项; ? 该仪器为贵重的精密仪器，应由专人负责管理和维护。 ? 若外电路电压波动较大，可使用稳压器，以增加仪器的稳定性。 ? 其它注意事项与72型分光光度计相同 第 6 页 共 7 页 第 7 页 共 7 页