外源性VEGF对鼠脊髓缺血再灌注后内皮抑素和脑源性神经营养因子及其受体的影响

外源性VEGF对鼠脊髓缺血再灌注后内皮抑素和脑源性神经营养因子及其受体的影响 外源性VEGF对鼠脊髓缺血再灌注后内皮抑素和脑源性神经营养因子及其受体的影 响 第46卷 V01.46 第6期 No.6 山东大学学报(医学版) JOURNALOFSHANDONG~RsrrY(nEALTHSCmNCES) 2O08年6月 Jun.2OO8 文章编号:1671—7554{2008)06一86—04 外源性VEGF对鼠脊髓缺血再灌注后内皮抑素和 脑源性神经营养因子及其受体的影响 姜丽,于灵芝,刘旭东,郭兰敏 (山东大学1.附属济南市中心医院麻醉科,济南250013;2.齐鲁医院疼痛科,济南250012; 3.附属省立医院心外科,济南250021) 摘要:目的探讨重组鼠血管内皮生长因子(rrVEGF1)对大鼠脊髓缺血再灌注损伤后血清中内皮抑素(ES),脑源 性神经营养因子(BDNF)~脊髓组织中相应受体酪氨酸激酶B(TrkB)表达的影响.方法将Wistar大鼠镐只随机 分为假手术组(S组,n=8),模型组(M组,n:24)和治疗组(V组,n=16).腹主动脉阻断90min后再开放建立脊 髓缺血再灌注模型.HE染色观察脊髓组织病理学变化,F_LISA法检测血清Es和BDNF水平,RT-PCR法检测组织 中TrkB受体mRNA表达水平.结果与模型组相比,再灌注后治疗组的病理状况得到明显改善.血清学检查以 假手术组为对照值.ES水平:M组再灌注后6h开始升高(P<0.05)并持续至7d达高峰(P<0.01);V组虽再灌 注6h也有升高(P<0.05),但7d时基本维持该水平,没有进一步升高.BDNF水平:M组再灌注6h降低(P< 0,01),2d回升至对照水平;随后再度下降,7d时降至最低,仅为对照水平的59.1%(P<0.01),且明显低于再灌注 6h(P<0.01);V组再灌注6h明显升高(P<0.01),7d时恢复至对照水平.TrkB受体mRNA表达:M组再灌注6h 有所上调但2d时回调至对照水平,并于随后继续下调,至7d时表达最低;V组则 于6h,7d均保持高表达(P< 0.01),并显着高于模型组(P<0.01).结论外源性rrVEGFI能显着降低大鼠脊髓 缺血再灌注后血清ES的升高, 减轻BDNF的降低,促进BDNF受体TrkBmRNA的高表达,改善缺血再灌注后的 脊髓病理损伤. 关键词:脊髓缺血再灌注;血管内皮生长因子;内皮抑素;脑源性神经营养因 子;TrlcB受体;大鼠,Wistar 中图分类号:R744.1文献标志码:A EffectofrrVEGFonserumendostatin,BDNFanditsTrKBreceptor afterspinalcordischemia—reperfusioninjury JIANGLi,YULing-zhi,L1UXu—dong2,GUOLan—mid (1.DepartmentofAnesthesiology,JinanCentralHospitalAffiliatedtoShandongUniversity,Jinan250013,China; 2.DepartmentofAnalgesia,Qil.HospitalofShandongUniversity,Jinan250012,China;3.DepartmentofCardiacSurgery, ProvincialHospitalAffaHatedtoShandongUniversity,Jinan250021,China) Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectofrecombinantratvascularendothelialgrowthfactor165(rrVEGF1)OilserulTl cndostatinvariafionsandbrainderivedncurotrophicfactor(BDNF)withitstyrosin-kinaseB(TrkB)receptormRNAe](p】ssionin spjhalcordtissues.MethodsForty-eightratswererandomlydividedintothreegroups:thesham-operationgroup(S),tllerood? elgroup(M)andthetreatmentgroupof~VEGF’(V).Thespihalcordischcmia-reperfusionl esionmodelswerecstabhshedby usingNashmdabdominalaortaocclusionanddeelamped90minuteslater.Histopathologiealdlinthespinalcordwereob- servedbyhcmatoxylinandeosion(ttE)staining.SerumcndostafinandBDNFlevelsweredeterminedbyellzyll~linkedinlrilll— nosorbentassay(EUSA).ExpressionsofTrkBreceptormRNAweredeterminedbyrevcl’x e-transfcrentpolymerasech血reaelion (RT-PCR).ResultsInconvertiblespinalda/llagewasobservedafterspinalischcmiareperfusioninjury.Comparedwiththe 收稿日期:20O7.12.17 基金项目:山东省自然科学基金资助课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 (y2oo2c_~). 作者简介:姜~(1981一),女,硕士研究生,研究方向为麻醉与脑缺血再灌注损伤. 通讯作者:于灵芝(1965一),女,博士,教授,研究方向为麻醉与脑缺血再灌注损 伤.E-mail:yuanny2003@yahoo.tom.ca 姜丽,等.外源性VEGF对鼠脊髓缺血再灌注后内皮抑素和脑源性神经营养因子 及其受体的影响587 modelgroup.histopathologicalchasesinthespinalcordofgroupVwereremarkablyimproved.Forsemmendostatin(ES):in groupM.thelevelofendostatinb~gantoincreaseafter6hpost-reperfusionandremainedtillday7.IngroupV,ESwasin’ cnxlsedat6hafterrepeffusionbutthatwasnotmaintainedinthefollowingdays.SerumBDNFandexpressionofTrkBmRNA:in groupM.serumBDNFwasdecreasedat6h,thenreturnedtothecontrollevelatday2,butwasdecreasedmoreseverelyatday 7whichwasonlyabout59.1%ofthecontrollevelandwassignificantlo~rerthanthatat6h(P<0.05).TheexpressionofmR— NAofspinalcordTrkBreceptorwasup-regulatedat6h,retarnedtothecontrollevelatday2,andthenkeptdown-regulatingto thelowestlevelatday7afterreperfusion.IngroupV,incontrast,serulnBDNFwassignificantlyincreasedat6h,thenreturned backtothecontrolgroupatday7,andtheexpressionofTrkBmRNAmaintainedasustainableup-regulationleve1.Condusion SpinalrrVEGI~65administrationCanalleviatetheincreaseofEsandthedecreaseofserumBDNFinducedbyspinalcordisch- emiereperfusioninjury,andenhancestheup-regulationofmRNAexpressionofTIkBreceptor. Keywords:Spinalcordischemia-reperfusion;Recombinantratvascularendothelialgrowthfactor165;Endostafin;Brainderived neurotrophiefactor;Tyrosin-kinaseBreceptor;Rat,Wistar 胸,腹主动脉瘤(TAAA)是一种常见的心血管疾 病,手术切除是最主要的治疗方法.截瘫是该类手 术严重的并发症.手术导致截瘫的因素很多,但归 根结底是阻断主动脉期间脊髓缺血和开放后的再灌 注损伤所导致的一系列病理生理变化.虽然临床上 也在术前,术中,术后采取了多种保护 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 ,在一定 程度上对脊髓损伤起到保护作用,但均不能满意地 降低TAAA手术截瘫的发生率,其原因是未能从根 本上解决脊髓缺血所带来的问题.本实验在前期工 作的基础上J,建立脊髓缺血再灌注模型,探讨外 源.1生血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowth factor,VEGF)对内皮抑素(endostatin,ES),脑源性神 经营养因子(brainderivedneurotrophicfactor,BDNF) 及其受体的影响,旨在寻找简便有效的脊髓保护方 法. 1材料与方法 1.1实验动物与分组Wistar大鼠48只,雌雄不 拘,体重270,320g,由山东省医学动物中心提供. 随机分为假手组(S组)8只,模型组(M组)24只和 治疗组(V组)16只.M组又依标本采集时间不同 分为缺血再灌注后6h,2d,7d组,每组8只;V组又 分为缺血后再灌注6h,7d组,每组8只. 1.2建立大鼠脊髓缺血再灌注模型采用Nas. 1und_2]腹主动脉阻断方法建立脊髓缺血再灌注损伤 手术模型.实验在室温25,28?的环境中进行. 苯巴比妥(40mg/kg)腹腔注射麻醉,麻醉后取仰卧 位,按正规手术 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 ,无菌条件下行腹部旁正中切 口,逐层打开腹腔,用湿纱布保护将部分肠胃组织推 向右侧,于左腹膜后间隙钝性分离,暴露腹主动脉, 于左侧肾动脉分权下方放置阻断带阻断腹主动脉, 以阻断下方动脉无搏动为 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 .阻断时间为 90min,然后开放主动脉.仔细将腹腔脏器复位,逐 层缝合刀口,室温下自然苏醒.V组分别于阻断前, 后经蛛网膜下腔注射重组鼠血管内皮生长因子 (EGF)80ng/80;S组麻醉和手术操作同M 组,但开腹只放置阻断带,而不阻断腹主动脉即终止 手术,逐层缝合,室温下自然苏醒. 1.3组织标本制备及血清采集各组分别于手术 后固定时间点经心脏穿刺留取血样,随后处死大鼠, 俯卧位剪开皮肤及皮下组织,迅速分离椎旁肌肉,用 咬骨钳小心咬掉棘突及周边骨组织,暴露硬脊膜(注 意操作中勿对脊髓造成挤压伤害),换以显微器械操 作,小心剪开硬脊膜,取腰段脊髓组织标本,用于病 理切片检查和实验室反转录聚合酶链反应(RT. PCR)半定量检测TrkBmRNA的表达.将所取血样 静置于4?凝固过夜,5000dmin离心10min,取出 血清,分装,一20?保存,集中检测.注意检测前避 免反复冻融. 1.4HE染色将取下的脊髓标本常规固定,脱水, 透明,浸蜡,包理,切片5pan厚,常规脱蜡,乙醇梯度 脱水,苏木素一伊红染色,二甲苯透明,中性树胶封 片,光镜下观察. 1.5血清ES和BDNF的测定采用酶联免疫吸附 测定法(EusA).大鼠Endostatin酶免检测试剂盒购 自ChemiconInternational,Inc.,BDNF酶免定量检测 试剂盒购自美国Promega公司.严格按照试剂盒说 明书进行操作.721分光光度计(波长450砌)测定 OD值,由标准曲线回归方程计算血清Es及BDNF 含量. 1.6组织中TrkBmRNA的测定采用半定量RT- PCR法,引物序列参照文献设计,由北京”奥科”公司 合成.序列为:TrkBSencePi~ner5. 3.AntiSencePIiIl1er5-3,预扩增 片段长度382bp,[3-actinSence蹦mer,5-tggc~- 588山东大学学报(医学版)46卷6期 ctgac一3,AntiSencePri~r5’-cgct~tgat一3,预扩 增片段长度560bp. RT反应体系试剂盒购自日本TaKaRa公司,严 格按照试剂盒说明书进行操作.在ImagerTM2200 上观察结果,同时应用GS.363型分子分析成像仪打 开Analysissystem:ImagerTM2200分析软件系统进行 各个标本的不同基因表达量检测. ,所有计量指 1.7统计学处理SAS6.12统计软件 标均以4-s表示,采用t检验及单因素方差分析并 q检验进行组问差异显着性比较,检验水准为Ot= 0.05 2结果 2.1脊髓切片既染色结果M组中阻断90rain 再灌注6h,运动神经元细胞肿胀,胞浆水肿,多数细 胞尼氏小体减少或消失,部分出现核深染,炎性细胞 浸润少,间质充血水肿.再灌注后7d,主要表现为 神经元坏死,严重者运动神经元数量减少,灰质呈海 绵样改变;部分区域神经元可见固缩,深染的细胞核, 细胞质呈空泡样改变或核溶解,消失或核膜不清. V组应用rrVEGF1治疗,脊髓病理改变较M组 明显减轻,但再灌注6h仍呈水肿改变,部分神经元 周围可见不规则的透亮区,少数细胞中央性尼氏体 染色浅或溶解,细胞边界清晰,核圆,居中,结构完 .隐约可见组织微血管生成,血 减少明显好于M组 管内充血,间质内大量炎性细胞浸润,大多数运动神 经元细胞结构基本清晰,胞核完整,但仍有部分细胞 胞体回缩,边缘不规则,尼氏体模糊,少数核深染,个 别有核溶解的现象,细胞边缘不清. 2.2各组血清KS,BDNF含量和脊髓TrkB受体 A表达结果见表1. 血清ES水平:与S组相比,M组再灌注6h至 2d时内皮抑素水平持续上升(P<0.05),第7d仍继 续上升(P<0.01);V组则于再灌注6h升高(P< 0.05),7d时仍维持在此水平,但显着低于M组同时 问点的表达水平(P<0.05). BDNF水平变化:M组再灌注6h时,血清BDNF 含量较s组明显降低(P<0.01),再灌注2d,血清 BDNF短暂回升,接近S组对照水平;再灌注7d,血 清BDNF水平再度下降,仅为对照水平的59.1% (P<0.01);V组再灌注6h,血清BDNF水平较s组 对照水平和M组同时问点均显着升高(P<0.01), 再灌注7d,大幅回落且接近对照水平,但仍显着高 于M组同时问点的表达水平(P<0.01). TrkB受体mRNA表达:M组再灌注6h,较s组 对照水平略上调,但2,7d又呈下调趋势,7d下调尤 为显着(P<0.05VS同组6h),但与s组和同组2d 时问点比较,差异无统计学意义;V组则于再灌注 6h和7d均保持高表达,显着高于s组对照水平和 好,个别细胞核膜肿胀.再灌注7d,神经元数量的M组同时间点(P均<0.01). 表1各组血清KS,BDNF含量和脊髓TrkB受体mRNA表达的变化 <O.05,-p<O.01vsS组;<O.05,<O.01vsM组相应时问 点;?P<O.05,”P<O.01vs同组6h;?P<O.05,?P<O.01vs同组2d 3讨论 本研究系在前期大鼠脊髓缺血再灌注损伤后血 清内皮抑素和VEGF的相关性研究的基础上,利用 VEGF蛳对脊髓缺血再灌注损伤进行防治,观察防治 效果,探讨可能的作用机制.结果表明,脊髓缺血再 灌注后第2天,无论BDNF,endostatin还是TrkB mRNA的表达都在此点开始有不同幅度的改变,甚 至存在与6h和7d的变化趋势不一致的反跳,以缺 血时间长的一组更为明显.这一现象提示,脊髓缺 血再灌注后2天以内可能是缺血脊髓对抗缺血再灌 注损伤的”挣扎”期,或称作细胞自身对不良环境的 调节期.这一时问之内,无论是机体整体内环境还 是局部小环境的差异都将对缺血脊髓的最终结局起 到决定性的作用,是治疗应该抓住的时期.但是在 本研究中,由于这一时问点的结果并不代表缺血组 织的最终结局,故在治疗组中取消了对这一点的观 察,只对再灌注后6h和7d的结果进行对照观察和 分析. VEGF作为一种强的血管生成肽,能调节血管 生成和血管的通透性,在脊髓缺血损伤的病理生理 过程中起着重要作用.由于基因的剪切方式不同, VEGF主要分为VEGF~,VEGF’,VEGF~岱,VEGF~翱 姜丽,等.外源性VEGF对鼠脊髓缺血再灌注后内皮抑素和脑源性神经营养因子 及其受体的影响589 和VEG5个亚型,在体内分布广泛,表达水平较 高的是VEGFt和vEG.以往研究认为L3J,VEGF 仅能通过改善局部微循环间接地起到神经保护作 用.近年实验研究证明],VEGF也是一种神经保 护因子,可直接促进损伤的神经组织再生修复. VEGF螂是最主要的控制蛋白,也是在神经系统起主 要作用的亚型,VEGV1对神经细胞无作用』.本实验 选择~VEGP用于治疗正是基于这一理论的支持. 目前,关于内皮抑素的研究偏重于其抑制血管 再生的作用,并将此作用用于肿瘤的治疗中,中断肿 瘤血管的新生,使肿瘤组织失去血液供应而停止生 长,由于此种”饥饿”疗法不会象其他抗瘤药物那样 发生耐药性,因而深受研究者的青睐.但探讨内皮 抑素在缺血损伤过程中的作用,以及长时间缺血造 成的间质血管内皮受损和组织不可逆性损伤是否与 之有关的研究却比较少.本实验结果表明,缺血后, 血中内皮抑素水平升高,并且在缺血再灌注后7天, 血清BDNF水平和脊髓TrkB受体的表达也都显着 下调,脊髓病理检查呈现不可逆性坏死改变;应用 VEGF~治疗后的大鼠,缺血90min再灌注后,血清 内皮抑素水平均得到不同程度的控制,同时神经元 结构和功能(BDNF分泌水平)也得到相应改善.表 明内皮抑素在长时间(90min)缺血再灌注造成的脊 髓损伤中发挥着一定的作用.至于外源性,尤其是 通过蛛网膜下腔途径注射VEGF~,如何降低缺血造 成的血清内皮抑素的高表达,尚需进一步探讨. 近年,神经营养因子(neurotrophicfactors,NTVs) 的发现为脊髓损伤的防治带来了新的希望,其受体 采用酪氨酸激酶家族(Trks).BDNF是NTFs的一 种,它的最适配体为TrkB,除了具有NTF所有的效 应外,还具有运动神经元营养活性,能保护脊髓运动 神经元在脊髓损伤后免于死亡.BDNF对神经元的 作用途径有二条]:?提高神经元表面BDNF受体 TrkB的表达水平,以利于BDNF对神经元产生生物 通过活化BDNF受体TrkB,在细胞内阻断 效应;? 损伤因子对蛋白激酶C的失活,以利于防止神经元 发生变性,死亡.在中枢神经缺血后,BDNF及其受 体TrkB表达均明显增加,且两者在时空分布上相一 致,可能与神经细胞通过产生BDNF等NTFs,进而参 与神经元损伤修复有关.有实验证实n引,脑缺血后 机体提高BDNFmRNA表达的水平是机体保护性机 制之一,缺血后产生的大量兴奋性毒性物质激活 NMDA和非NMDA谷氨酸受体系统,最终刺激神经 元提高BDNFmRNA表达的水平.但上述情况仅限 于神经元细胞的代偿能力以内,当缺血时间延长,损 伤过度,血中BDNF浓度极度下降,神经元因此而失 营养,则其表面受体的表达也将随之减少.本实验 长时间缺血(90rain)后,再灌注6h时血清BDNF即 开始降低,明显低于s组对照水平,而此时受体表达 上调,可能是神经元为BDNF的降低而发生的反应 性过表达,借以增加受体与配体的应答,以满足代偿 期神经元功能的维持;缺血再灌注后2d,血清BDNF 水平代偿性回升至接近正常,受体表达也回调至正 常;再灌注7d,血中BDNF再度大幅度下降,受体也 随之呈现低表达状态,其原因可能是长时间 (90rain)缺血造成的神经元的器质性损伤,致使运 动单位的分泌功能及神经元的受体表达功能受到损 害.神经元大量坏死的病理表现结果也证实了这一 点.这一结果与Xiong等u?的认识一致. 近年,VEGF在肢体缺血和心肌缺血的应用研 究中取得了突破性进展,国外已开始将其应用于临 床并取得了良好疗效u.因VEGF的半衰期短,只 有6min,不能持续表达,目前多采用转基因治疗. 应用VEGF质粒治疗周围神经缺血表明,基因转染 不仅在早期可逆转周围神经缺血病变,也可改善已 形成的周围神经缺血病变,为脊髓损伤的基因治疗 提供了借鉴.在VEGF的亚型中仅VEGF能通过 与NRP-1.VEGFR.2受体复合物结合对神经细胞有 特异性保护作用,并参与神经组织再生修复,而且其 特异的促血管生成作用对改善组织缺血也有重要意 义.本研究结果虽显示VEGFt能降低脊髓缺血再 灌注后血清内皮抑素的升高,减轻BDNF的降低,促 进BDNF受体TrkB基因mRNA的高表达,但其应用 途径和手段等尚需进一步探讨.应用VEGF质粒 治疗脊髓缺血损伤有可能成为今后的研究方向,但 如何避免宿主排斥反应,如何有效通过血脑屏障而 发挥作用,以及基因治疗的长期安全性评估,将是今 后研究中亟需解决的问题. 参考文献: [1]刘旭冬,于灵芝,徐长宪,等.大鼠脊髓缺血再灌注损伤 后血清内皮抑素和VEGF的相关性研究[J].中国神经精 神疾病杂志,2007,33(2):110-112. 12]NaslundTC,HolliebLH,MonteySR,eta1.Protectingthe ischemicspinalcordduringaorticinjuryclamping.Theinflu— enceofanestheticsandhypothermia[J].AnnSurg,1992,215 (5):409-415. 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(编辑:刘霞) (上接第589页) [4JS0ndel1M,LundborgG,KanjeM.Vascularendothelialgrowth factorhasneurotrophicactivityandstimulatesaxonaloutgrowth, enhancingcellsurvivalandSchwanncellproliferationinthe peripheralnervoussystem[J].JNeurosci,1999,19(14): 5731.5740. 15JSchratzJ~rgerP,SchratzbergerG,SilverM,eta1.Favorable effectofVEGFgenetransferonischemicperipheralneuropathy 413. [J].NatMed,2000,6(4):405— [6JYoshidaA,Anand-ApteB,ZeterBR.Diferentialendothelial migrationandproliferationtobasicfibroblastgirthfactorand vascularendothelialgrowthfactor[J].GrowthFactors,1996, 13(1-2):57—64. 17JHuangEJ,ReichhardtLF.TRKReceptors:mlesinneuronal sign~transduction[J].AnnuRevbiochem,2003,72:609— 642. [8]FerrerI,BallabrigaJ,MartiE,eta1.BDNFup-regulatesTrk BproteinandpreventsthedeathofCAIneuronsfollowingtran— sientforebrainischemia[J].BrainPathol,1998,8(2):253— 261. 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