首页 携带抗血管生成基因的肿瘤靶向性溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用的研究

携带抗血管生成基因的肿瘤靶向性溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用的研究

举报
开通vip

携带抗血管生成基因的肿瘤靶向性溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用的研究携带抗血管生成基因的肿瘤靶向性溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用的研究 携带抗血管生成基因的肿瘤靶向性溶瘤腺病毒的抗肿 瘤作用的研究 学位论文独创性声明 本人郑重声明: 、坚持以“求实、创新的科学精神从事研究工作; 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果。 、本论文中除引文外,所有实验、数据和有关材料均是真实的。 、本论文中除引文和致谢的内容外,不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果。 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示 了谢意。 研究生签名: 主幽盘 日...

携带抗血管生成基因的肿瘤靶向性溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用的研究
携带抗血管生成基因的肿瘤靶向性溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用的研究 携带抗血管生成基因的肿瘤靶向性溶瘤腺病毒的抗肿 瘤作用的研究 学位论文独创性声明 本人郑重声明: 、坚持以“求实、创新的科学精神从事研究工作; 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果。 、本论文中除引文外,所有实验、数据和有关材料均是真实的。 、本论文中除引文和致谢的 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 外,不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果。 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示 了谢意。 研究生签名: 主幽盘 日 期:趁也。 ?毋 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定,学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版;有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅;有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索;有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 ’、 研究生签名:夏蟹垂亟 日三、实验结果 四、讨论第章溶瘤腺病毒治疗肿瘤的体外研究和体内实验.. 一、实验材料和试剂 二、实验方法 三、实验结果 四、讨论第章突变型基因的功能研究。 一、实验材料和试剂 二、实验方法 三、实验结果??。 四、讨论?.。 全文小结. 附录主要仪器设备?。?。?...? 参考文献在读期间发表的学术论文及研究成果??......??...? 致 谢??..?..?...?..?.?.??.......?......?....?..........??..?摘要 摘要 基因治疗是将正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞 或组织中以治疗疾病,例如遗传疾病中用有功能的基因替代缺失突变的等位 基 因。尽管该技术刚起步不久,已经取得了一些成功。科学技术的突破将继续推动 基因治疗成为主要的医学技术。现今,大部分的基因治疗研究集中于有遗传缺陷 的疾病和癌症。基因治疗有种类型:生殖细胞的基因治疗和体细胞的基因治疗。 目前更多地是采用体细胞基因治疗。基因治疗的关键是基于外源基因在目的细胞 中高效稳定的表达,这在很大程度上取决于基因治疗采用的载体系统。 在基因治疗技术中,腺病毒载体与其他载体系统相比较而言,有宿主范围广、 感染率高、理化性质稳定等特点,而且由于腺病毒的非整合性使之不会整合到宿 主基因组中,保证了较高的生物安全性,故现在常用于基因治疗。端粒酶与肿瘤 无限增殖的特性有关,在%以上的肿瘤细胞中端粒酶为阳性。端粒酶的激活 是癌症发生的关键步骤。它的激活和端粒酶逆转录酶表达密切相关,表 达端粒酶活性的肿瘤细胞能够激活端粒酶逆转录酶启动子。人表皮生长因子受体 /是乳腺癌及其他癌症的潜在癌蛋白,在很多的肿瘤细胞中过表达, 因此基因已经成为癌症基因治疗的靶点。越来越多的证据表明,实体瘤和 它们的转移是血管生成依赖性的。抗血管生成治疗可以阻止肿瘤周围新生血 管的 形成,从而破坏滋养肿瘤块的不正常的毛细血管网络系统。人内皮抑素 ,,一种分子量为的蛋白,它是由细胞对基质?硫酸肝素 蛋白胶原?羧基末端片段水解而来。内皮抑素是特异性的血管内皮细胞生长 抑制因子,能显著抑制肿瘤血管增生并诱导肿瘤细胞凋亡。内皮抑素的抗血管生 成治疗和血管靶向基因治疗,为治疗实体瘤提供了广阔前景。 本研究针对肿瘤细胞高表达、高表达、新生血管生成三大肿瘤特 征,构建了肿瘤特异性溶瘤腺病毒,对其体外及体内的抗肿瘤作用进行了研究, 同时研究了腺病毒关键基因的功能,主要取得以下结果: .采用荧光素酶 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 基因检测系统,证明人端粒酶逆转录酶启动子 和人表皮生长因子/基因增强子构成的嵌合型重组子在端粒酶表达 阳性的肿瘤细胞中有很高的转录活性。 .构建了由人端粒酶逆转录酶启动子和人表皮生长因子受体增 强子/构成的嵌合型启动子调控修饰的腺病毒的表达,同 时由巨细胞病毒,启动子驱动人内皮抑素基因表 达的肿瘤特异性溶瘤腺病毒;通过方法鉴定了和基因的表达,摘要 方法检测了病毒的感染能力。 .通过体内及体外实验,探究溶瘤腺病毒的抗肿瘤效果。报告基因 的表达显示了腺病毒在肿瘤细胞中的高效感染率:病毒增殖和细胞活力检测实验 证实溶瘤腺病毒的体外抗肿瘤作用,免疫印迹显示了关键蛋白和 的有效表达,内皮细胞增殖抑制实验结果间接反应了的抑制肿瘤血管生 成的能力。动物体内实验进一步证明了溶瘤腺病毒的抑制肿瘤生长的潜能。 .对野生型基因进行修饰,产生新的截短型的小基因?, 研究显示该基因下调基因的表达,同时保护的功能。体内实验证实 了的抗肿瘤作用。 本研究结果显示,由人端粒酶逆转录酶启动子和人表皮生长因子 受体增强子/构成的嵌合型启动子能够调控腺病毒基因, 使其特异性地在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达。同时由巨细胞病毒 ,启动子驱动人内皮抑素基因表达量可用于抗血 管生成研究。修饰型的用于基因治疗更安全。因此,这种携带抗血管生成基 因的肿瘤靶向性溶瘤腺病毒可用于基因治疗。 关键词: 嵌合型启动子,抗血管生成,溶瘤腺病毒,基因治疗,基因, . ? 纽 仃趾打黟 觚 ,嬲瓶吒 . 印? 缸疵、血觞 ,渤印. 眦: , .嘶.嬲% ? .嘶印 够 、? 缸卸 廿 嬲 嘶 . 碍 锣 . 印/ .撕嬲 , : 玛 印.嬲 晖 铲 百 .加酉舶仕屺 舐? 咖 嬲.王, ?肋台 ,廿 百 .?.仃 曲 ,“ 舵 谢也锄 , 印.徊 缸锄 觚琳咖八 舛 妇耐 , 也, . 妇 眦趾 印 、 . : . 硒. 嬲曲够 . 江? .色饥廿耐 趾 妒 试, .. 目. 印/缸 也 仃耐弱 印、?弱 . 嬲 .. 埘 枷啪 肫 仃. . 瑚也 疵 .? 埘锄。撇 距? 疏埘 如 仃. .正 嬲 ? 砌蛳 砒 龇啪. 砌.皿 .色廿晰 . ?胁 劬嘶.?日 丘爸 棚:血 觞孓 砌龇?嘶 仃 ’ , . 嘶 击 、,嬲伍砌曲 .丁 锄 廿.舀 】玛 如 .?. 】 向. : ’,如 ;此印’ ..第章腺病毒载体及其在基因治疗中的应用研究综述 第章腺病毒载体及其在基因治疗中的应用研究综述 “如今癌症的死亡率同年前相比几乎没有什么变化,与此同时,心脏病、 脑 血管疾病和传染病等疾病的死亡率却降低了大约/”。曾经获得诺贝尔生理学和医学 奖的美国斯隆?凯特灵癌症研究中心主任哈罗德?瓦莫斯,在《科学》杂志上撰文说,“尽 管政府和医学界投入巨资从事癌症研究,而且在癌细胞的基因、生物化学和功能改变 等方面取得了很多重要的发现,但是,癌症至今仍是常见的、致命的疾病,甚至有可 能从目前美国人第二位的死亡原因,上升为第一位”。然而,瓦莫斯传递的也并非都 是坏消息,他在文章中指出:“仍有许多理由让我们保持乐观的看法??其中,近年来 最为引人注目的进步就是,几种分子靶向抗癌药物被开发出来,并且已经成功地用于 对多种癌症的临床治疗”。《科学》杂志在以《癌症治疗走向个体化》为题推出的封面 报道中说:靶向治疗,以及肿瘤生物标记、基因组医学等新名词,正在从天花乱坠的 宣传变成临床上的现实。随着对肿瘤基因基础更多的了解,已经出现了有希 望的新疗 法,也构成了未来以患者为中心的癌症治疗的新模式。 一、基因治疗 岁末,《科学》杂志评出十大科学突破,其中位列第的是“基因疗法 卷土重来”。 年美国正式批准第一个基因治疗临床试验,美国国立卫生研究院心肺和 血液研究所等进行了世界上首次人体基因治疗的临床试验。一名年仅岁患 有腺苷脱氨酶缺陷症的小女孩,经过基因治疗,患儿的免疫能力得以提高,获 得了明显的治疗效果,。它是当今生物医学发展最重要的篇章。此后,世界各国 都掀起了基因治疗的研究热潮。那一段时间,许多人认为这预示着基因治疗时代的到 来。在华盛顿美国国家历史博物馆内,有一张研究的历史记载,记载了自 年等证明是生命的遗传物质以来所有的发展里程碑,清楚地显示,基因治 疗是当今基因生物技术最新的重要里程碑。 然而,基因治疗的诞生与发展,从来就不是一帆风顺的。由于最初基因治疗技术 达不到预期持久稳定的治疗效果,在不断遭到质疑的同时,人们便逐渐对其丧失兴趣。 年,美国一位患有先天性鸟氨酸转甲酰酶缺陷症的岁少年 , 在宾西法尼亚大学人体基因研究所施行基因疗法天后死去,致使基因疗法遭受重 创,人们对基因治疗的热情骤然间降至冰点。在人们怀疑基因治疗的安全性的同 时,美国终止了该大学的项正在进行中的基因治疗临床试验。但随后得调查结第章腺病毒载体及其在基因治疗中的应用研究综述 论证明,问题不在基因治疗本身。死者在治疗前正在发烧,其用药量也明显超过 批准的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 且未上报。临床尸检和实验室检查结果表明,门静脉大剂量注射重组病毒 激发了机体致命的免疫反应,导致病人多器官衰竭而死亡。这显然是责任医生为 了尽快将基因治疗推向临床而违规操作的结果,与进行的基因治疗的制品本身无直接 关系。由此可见,医生不恰当的违规操作放大了公众业已存在的对该项试验安全性的 怀疑。在随后的年底至年,法国巴黎儿童医院因接受逆转录 病毒基因治疗的患者中,有例出现了类白血病样症状。这例患儿发生类白血 病的原因可能与采用的鼠白血病病毒载体的整合位点有关,插入造血干 细胞染色体细胞生长启动基因的启动子附近,从而导致某些细胞的失控性生长 。这次的法国事件,经过媒体的广泛报道和渲染,又一次引发了基因治疗安全性 危机的大讨论。从此,人们对基因治疗的期望跌到了低谷,基因治疗临床试验 受到了 更严格的监管,安全示范标准比其他治疗方法设置的都要高。 如果冷静、公正地去审视这近二十年来在基因治疗研究领域所取得的成绩,我们 不得不承认其中还存在有效性和安全性的障碍。在这种大背景下,生物技术和制药行 业逐渐丧失了对基因治疗方法的兴趣,这在一定程度上减缓了临床的进展:学术中心 没有条件也没有能力制造临床级别和规模的载体,而且研究经费通常不足以支持临床 试验。更糟糕的是,在大家普遍认为这一领域缺乏前景的情况下,许多研究人员甚至 认为,基因治疗是一个死胡同。但更多的学者则认为,任何新的治疗方法都不可能没 有风险,新技术、新药物等在给病人带来利益的同时,也会带来包括危及生命的风险。 因此,在不断完善基因治疗临床试验法则、加大监管力度的同时,人们并没有放弃基 因治疗试验的努力,并一次又一次地点燃了公众对基因治疗的希望。但科学家也不应 忽视通过各种渠道让公众全面了解基因治疗的利弊,法国基因治疗事件最终未引起公 众的过度反应,就是因为公众事先了解了基因治疗的潜在危险,对事后调查分析结果 的披露及时而且充分。经过全面沟通,公众会明白逆转录病毒载体己在临床试验中应 用了多例患者,总体上仍相当安全,但必须要进行改进。目前已有很多研究采 取了一系列技术对这类载体进行改造,使载体的安全性大大提高。相对于数千例正在 接受基因治疗的患者来说,发生不良反应的可能性是很低的,甚至低于许多目前正在 进行临床试验的药物。法国例患儿接受基因治疗后现有例患儿生存下来, 并能离开无菌病房,回到家中正常生活。如果没有做基因治疗,很难想象他们会是什 么结果。由此看来,基因疗法给目前无法治愈的疾病带来的希望,利远远大于弊。? 时至年,一系列基因疗法试验的成功表明,该领域已逐步摆脱过去失败的 阴影,重新燃起新的希望。其最主要的成就体现在个方面。 首先是先天性黑蒙症’ ,的基因治疗。这 是一种罕见眼遗传疾病,由于一种名叫基因为视网膜细胞产生一种特第章腺病毒载体及其在基因治疗中的应用研究综述 殊的维生素的基因出现变异而导致病人的视力随着年龄的增长而衰退,一些人成 年后会因此失明,针对这种疾病目前尚无有效疗法。在美国,约人饱受利伯氏 先天性黑噱症的苦痛,约万人患视网膜色素变性。美国和英国的研究人员对黑蒙 症失明的志愿者施行了基因疗法,将功能正常的基因通过腺相关病毒 注入病人的眼部细胞。在第一批临床试验中,名部分失明患者的感光能力都有改 善。其中个孩子重获视力,能进行体育运动,在学校也不再需要学习辅助器材。甚 至,其中一名女患者在治疗过程中产生了“第二视力”,她的大脑已经学会从接受基 因疗法后重新恢复活力的视网膜的某个区域探取信息,使她能够阅读仪表盘上的数 字。治疗年后,病人的眼部和体内没有出现任何免疫反应,。另一个研究小组 用类似的方法使先天红绿色盲的松鼠猴恢复了全色视觉。松鼠猴控制识别红色和绿色 的基因分别位于两条染色体上,雄性松鼠猴因为只有一条染色体,所以就成了天 生的红绿色盲。研究人员利用病毒载体将合成红色视蛋白的基因注入到两只雄性松鼠 猴的视网膜。之后进行的色盲测试结果显示,它们辨别颜色的能力大大提高,可以分 辨红色和绿色。目前两只松鼠猴已经保持这种能力超过年,并且没出现明显的副作 用。 其次是连锁肾上腺脑白质营养不良,的基因治 疗。是一种大脑疾病,常导致男性儿童在青春期前死亡,由编码制造维持神经髓 鞘的蛋白质的基因缺陷造成的。一个法国研究小组对例岁男童患者施行基 因治疗,他们首先从病人的血液中分离骨髓干细胞,转染携带基因的慢 病毒载体。在患者骨髓灭活后将细胞回输患者体内,使细胞恢复制造缺失蛋白的功能。 两年后,典型的渐进性脑损伤停止,神经学症状得到了改善,甚至健康的蛋 白仍然可以在这两位病人的血细胞中被探查到。这是第一次用慢病毒做载体的临床试 验,该病毒导致癌症的可能性比过去用的载体小。这种以慢病毒为载体改造基因 纠正干细胞的治疗方式尽管取得了小范围的成功,却仍需要在更大群组的患者中进行 研究,未来慢病毒载体可能会成为基因疗法的主要工具。 其三是有效治疗帕金森氏症的基因治疗方法问世。年月,法国科研人员 在新一期美国《 》杂志土报告说,他们在实验室中 利用基因疗法治疗罹患帕金森氏症的短尾猴,改善了短尾猴的运动能力,且未出现常 见疗法所引起的副作用。法国巴黎卜医院的科研人员给罹患帕金森氏症 的短尾猴植入个基因,促使其大脑中特定细胞分泌化学物质多巴胺。接受基 因治疗 后,病猴的运动能力得到极大改善,且治疗效果维持了个月。初步结果显示,这 种基因疗法在动物身上是安全的。期临床试验已经开始,在帕金森氏症患者接 受腺相关病毒携带人从基因的基因疗法后,其运动能力得到改善,效果“令人非 常鼓舞”,。不过,由于目前还有~些技术问题需要解决,这种基因疗法离临第章腺病毒载体及其在基因治疗中的应用研究综述 床应用仍有一段距离。最近,《》发表了一份有关基因治疗帕金森病的临床报 道,由美国大学的 和教授领导的实验小组完成。 研究者主要探索了编码谷氨酸脱羧酶基因导入名帕金森病患者大脑中的安 全性。结果表明,所有帕金森病患者的运动功能均明显改善,。这份报道使人 们对未来帕金森病的基因治疗充满了希望。 有关基因治疗的研究,在年还有一系列重要成果。例如:发表了美国波 士顿大学医学院的研究人员用基因疗法治疗一抗胰蛋白酶缺乏症 ? 引起的的肺气肿;:首次利用基因疗法修复损伤的 捐赠肺: :基因疗法可治疗肌肉萎缩症::抑制一个基因表达可 治疗肥胖: :移植基因方法可有效抑制艾滋病病毒::肌肉萎缩 症基因疗法动物实验成功等。 这一系列成功的案例,大大促进基因治疗的发展,特别是在眼科疾病、巴金 森氏病的应用。毫无疑问,受此鼓舞,更多的疑难病患者将成为基因疗法的受益者, 预示基因治疗前景出现新的光明。 在热衷于基因疗法同时,人们最大的期望并不是只想治愈几个单基因缺陷症的病 人,而真正的目的是要攻克人类健康的头号“杀手??肿瘤。相对于单基因缺陷症 来说,肿瘤的发生是一个极为复杂的过程,有许多基因的突变会导致肿瘤的发生。因 此,肿瘤基因疗法受到的最大挑战就是有效基因的筛选:所选择的目的基因是否只针 对癌细胞而不损害体内的正常细胞该基因的治疗是否可被精确调控而不会引起其 他遗传性改变癌细胞是否能被全部清除随着基因导入系统、表达调控元件以及新 的治疗基因的发现,恶性肿瘤等疾病的基因治疗将会成为目前众多疑难病治疗的重要 组成部分,并在防止肿瘤的转移、复发等方面发挥重要的作用。 当前的基因治疗研究中的急需解决的问题是: .提供更多可供利用的基因:目前有治疗价值的基因太少。基因治疗是导入外 源基因以达到治疗目的的新型医疗方法。以恶性肿瘤为例,能抑制肿瘤生长的基因为 数不多;遗传病中多基因疾病的基因尚不清楚,因此难以达到治疗目的。.设计定 向整合的载体:目前导入基因的手段不理想。基因治疗的基因导入手段要求是高效导 入,而且能定向地导入体内某种细胞。已有手段均属低效和无导向性。因此,即使导 入的基因有治病效果,但由于不能有效地导入,效果也会大受影响。.如何高效持 续表达导入基因:导入基因现有的表达量还太低,如血友病的基因治疗,凝血因子 的表达量只有正常人的%,若能达到%,则治疗效果会大大提高。.导入的 基因缺乏可控性:如要导入一个胰岛素基因在体内分泌胰岛素目前是可以做到的,但 是若导入的胰岛素基因整天在分泌胰岛素而不受机体内血糖浓度和激素的调控,将会 造成严重后果。因此,急需解决如何对导入基因的表达实现可控调节。.靶细胞类第章腺病毒载体及其在基因治疗中的应用研究综述 型的选择和细胞移植技术。.获得性疾病和遗传性疾病的基因治疗,都需要更有效 的动物模型。.基因转移中的副作用和抗体形成问题。这些问题的解决方案正是研 究的热点。 二、腺病毒载体 基因治疗的关键之一是外源基因在目的细胞中高效稳定的表达,这在很大程度上 取决于基因治疗采用的载体系统。目前使用的载体系统有十余种,大致分为病毒和非 病毒载体?。非病毒载体转移效率较低,无法满足疾病临床治疗要求,因此在 实际方案中,病毒载体约占%。但从另一方面而言,由于产物免疫原性,对宿主细 胞毒性等安全问题,只有少数病毒能够改造成为基因治疗所需要的载体。目前,研究 最多的是逆转录病毒,慢病毒, 腺病毒, 腺病毒相关病毒从, 单纯疱疹病毒等,。其中,腺病毒载体由于致病性低,可将自身的基 因组递送到细胞核中,并且高效率地复制而不整合到染色体中,能感染增殖和非增殖 期细胞等优点而被广泛用于体外基因转导、体内接种疫苗和基因治疗等各个领域 。腺病毒在人和动物中广泛存在,是迄今在形态结构、基因组成和复制机理等生 物学特性方面研究得最为详尽的病毒之一。 、腺病毒的生物学特性: 腺病毒最早被发现是在年将牛结节性皮炎病料接种到鸡胚中时被分离到 的,随后在年等从小儿扁桃体中也分离出了人腺病毒,。腺病毒属 于腺病毒科。根据宿主范围不同,将腺病毒分为哺乳动物腺病毒 和禽类腺病毒两个属。人腺病毒分为个种, 即人腺病毒、、、、、,共有个血清型。目前已鉴定的腺病毒有多个 血清型,其中已知基因序列的约个。腺病毒结构比较简单,在感染过程中可以 产生大量的病毒,是研究真核基因表达调控机制的良好模型。 腺病毒的形态学及理化特性 腺病毒是双链病毒,无包膜,直径~ ,衣壳呈规则的二 十面体对称结构,见图,线状的双股链与核心蛋白形成直径~ 的髓芯, 被包裹于衣壳内。衣壳由个直径~舳的壳粒组成,壳粒排列在三角形的面上, 每边个,其中个为六联体非顶点壳粒,,另个为五联体基底顶点 壳粒,,六联体是形成病毒衣壳个三角形面的主要蛋白。根纤毛 以五联体蛋白为基底由衣壳表面伸出,纤毛顶端形成头节区。病毒粒子在感 染细胞核内常呈晶格状排列。腺病毒耐酸,故能通过胃肠道而继续保持活性, 许多腺病 毒就是从人和动物的粪便中获得的,这为口服腺病毒载体的研制提供了方 便。腺病毒第章腺病毒载体及其在基因治疗中的应用研究综述 在一?时可长期存活,?加热可灭活。适宜为~,值在以下或 以上均不稳定,。 图.腺病毒结构示意图。 腿 . . 锄 腺病毒基因组结构 腺病毒的基因组长约,分子两端具有~ 的末端反向重复序列 ,。对腺病毒不同型、不同株的序列比较研 究发现,位核苷酸高度保守,每个可分为富集区和富集区。基因组 左端有包装信号,和包装信号是腺病毒必不可少的顺式作用元件,与基因组 复制 和病毒包装密切相关,。’端有共价结合的末端蛋白,与腺病毒的感染 有关,对腺病毒的复制起始起着重要的作用,含有的感染性可提高倍。 腺病毒的基因组课分为早期转录基因和晚期转录基因。早期转录基因包括 、、、、、、等和。晚期转录起始于主要 晚期启动子,根据剪切方式和终止位点的不同,可分为组:/、 :五邻体、、、,:、六邻体、:、 、:纤维蛋白。其中、、由反链编码,其他基因则位于 正链。腺病毒的保守序列为从从,其上游一般有的从盒子和 的启动子元件,下游大多有样的元件和 及’的激活元件,一般上游激活元件较保守,而下游调 控元件则不大保守。早期基因、表达的蛋白参与病毒基因和有关细胞 基因的转录,是病毒基因活动的起始因子:、主要功能是调节和参与病 ..第章腺病毒载体及其在基因治疗中的应用研究综述 毒的复制:的基因表达产物与病毒逃避宿主免疫系统有关,为病毒复制的非 必 需区,缺少大部分或全部,病毒仍能在组织培养细胞上繁殖:参与病毒的复 制、晚期基因表达、转录子的拼接和宿主细胞生物合成终止等活动。而晚期基因主要 编码结构蛋白,为装配成熟的毒粒所必需,因此基因结构较稳定。晚期转录区域有一个 共同的三联先导序列,由主要晚期启动子所启动,转录产物为多顺反子, 可长达 ,通过不同的剪切加工,产生不同的,再翻译成不同的病毒蛋白 ?。 病毒的感染和复制 腺病毒通过纤突头节区与敏感细胞膜上的特异受体结合感染宿主细胞,人腺病毒 主要与柯萨奇病毒共用一种受体,故这种受体称为柯萨奇/腺病毒受体即,见 示意图,随后通过细胞表面整合蛋白诱导的胞饮作用,由内吞小泡通路进入细胞,可 以避免被溶酶体降解。随着内吞小泡值降低,纤维蛋白从病毒粒子的外壳脱落,接 着五邻体基底也从外壳解开,整个外壳崩解,病毒从溶解的内吞小泡释放到宿主 细胞核中,。接着开始了病毒基因组的转录。病毒周期由蛋白的表达开始, 复制前为早期,复制后为晚期。蛋白能激活其它早期基因、、、 的启动子,这就是为什么常用的、和缺失型腺病毒载体基本上无其它 早期和后期基因表达的原因;但区缺损的重组腺病毒在细胞中增殖时,可与 细胞基因组内的区发生同源重组,产生具复制能力的腺病毒。感染几小时后进 入病毒周期的后期,主要是腺病毒基因组的复制和后期基因的表达,这期间往往伴随 着对宿主细胞基因转录、表达的抑制,担当这种作用的是、等腺病毒蛋白,作用 途径是阻断宿主细胞的转运和翻译。后期基因编码的主要是病毒子结构蛋白, 基本上由主要后期启动子控制。结构蛋白在宿主细胞核中组装成新的外壳后,将复制 的腺病毒基因组包装进去,构成完整的具有感染力的病毒子,在宿主细胞凋亡之后释 放出来。为了避免遭到宿主免疫系统的攻击,腺病毒从多个环节干扰宿主的防御 和 干扰素的作用;蛋白则可阻断 肿瘤坏死因 系统:蛋白可以拮抗 子介导的被感染细胞的溶解;一蛋白还能阻断将腺病毒蛋白运送至细胞表面的 过程,从而避免细胞淋巴细胞的识别腺病毒蛋白及其功能。第章腺病毒载体及其在基因治疗中的应用研究综述 图.腺病毒感染通路 .’ 致病性 腺病毒流行十分广泛,除了感染人类以外,还存在于猴、马、牛、羊、猪、鼠、犬、 猫、狐狸、蛙、蛇等及几乎各种家禽野鸟。大多数腺病毒有比较严格的宿主范围,一 种动物的腺病毒一般不易感染异种动物,且在细胞培养物中,也以该宿主动物来源的 细胞最为敏感。腺病毒多数呈隐性感染,只有少数致病。人的型和型腺病毒基本 不致病。人的腺病毒主要存在于肠道内,但也与感冒、咽炎、急性呼吸道感染和结膜 炎等一系列疾病有关。哺乳动物腺病毒种类很多,但仅有少数引起临诊症状。多数腺 病毒不致病或致病力较低,这就为腺病毒载体的广泛应用提供了较大的安全保证, 。 、腺病毒载体: 腺病毒具有易感性、致病力低、宿主范围广、稳定性好、易进行重组操作、 病毒滴度高、易于浓缩和贮存以及介导基因转移效率高、能容纳较大基因片段等优点, 而且其生物学背景已研究得相当清楚,因而腺病毒载体在疫苗制备,癌症、传染病和遗 传病的基因治疗等方面被广泛研究和应用,被认为是基因转移中最有前途的载体之 一。 腺病毒载体可作为真核基因的表达载体,将外源基因表达盒插入到、、和 右侧等区域构建腺病毒载体时,重组腺病毒能高水平地表达一些异源蛋白:腺病第章腺病毒载体及其在基因治疗中的应用研究综述 毒的各种灭活或弱毒活疫苗已被广泛使用,并被普遍认为是安全有效的:腺病毒 还可用来构建基因重组型疫苗,例如将的编码序列插入腺病毒构建了肝炎疫苗: 另外,它还可用来开发 疫苗、麻疹病毒疫苗、单纯疱疹糖蛋白疫苗等:腺病毒 载体可运载肿瘤抑制基因,作为前药物的生物治疗:还可利用特殊肿瘤复制子的治疗 作用?。最先用腺病毒载体进行基因治疗的遗传疾病是白种人多发的遗传病一 ??囊胞性纤维病。随着人们对腺病毒生物学特性的认识不断加深,并对腺病毒 载体在转染效率、装载容量、免疫原性、靶向性等方面进行有效地改进,高效、特异、 低免疫反应、安全的新型腺病毒载体,将会得到广泛的发展和应用。 到目前为止,根据重组腺病毒载体中病毒基因的置换程度可将腺病毒载体分 为第 一代、第二代、第三代。 第一代重组腺病毒载体是由去除腺病毒基因组的和/或两区而获得,同时保 留了和包装信号,其复制必须在由型腺病毒转化的可组成性表达蛋白的 细胞中完成。这是一类复制缺陷、非辅助病毒依赖型载体。具有稳定、滴度高、 高效率转导目的基因、低致病性、不但可以转染分裂期细胞而且可以转染静止期细胞 等优点。这使得第一代腺病毒载体成为基因治疗中重要的载体之一。有很多研究报道 了腺病毒载体在许多疾病基因治疗上的应用。由于的缺失,造成病毒复制缺陷,并 避免了基因对细胞的转化作用,因此较为安全。区为病毒复制非必须,与表达病 毒逃避宿主免疫系统的产物有关,其容量为.,加上区容量.和腺病 毒本身的.附加容量,这一代腺病毒载体最大容量在.左右。但由于病毒载 体与表达蛋白的细胞之间存在同源序列,在细胞中繁殖时,通过重组,可重 新获得区,出现复制型腺病毒,这使得这一代腺病毒载体的应用受到限制。此外, 由于发现在多种转化及原代的细胞内存在具有样活性的物质,因而区缺失的腺 病毒载体在这些细胞内,仍能进行非依赖性的腺病毒复制,并从头合成病毒 的 早期和晚期蛋白,激发宿主针对腺病毒的细胞和体液免疫,使载体在体内的持续时间 以及再次应用均受到极大影响。 由于区的缺失不能完全阻断其它腺病毒基因的启动,在体内可能引起明显的免 疫反应,并且在高滴度下可表现出一定的细胞毒性,所以对第一代腺病毒载体的改建 十分必要。 第二代腺病毒载体是在第一代腺病毒载体的基础上进一步完善和发展起来的。降 低重组病毒载体诱导产生的免疫反应是新型腺病毒载体构建的着眼点。第二代的腺病 毒在、缺失的基础上进一步去除了区。人们在区编码结合蛋 白的基因上进行了温度敏感型突变,从而使在非允许温度下不表达晚期基因产物,降 低了炎症反应,使外源基因表达时间延长。通过建立、区互补的细胞系,人们 发展了、缺失的腺病毒载体,较缺陷的腺病毒在外源基因的表达和安全性第章腺病毒载体及其在基因治疗中的应用研究综述 方面都有提高。但与第代腺病毒载体相比,第代腺病毒仍然不能避免残余病毒基 因表达物在体内的免疫反应和细胞毒性,并且它从头合成蛋白的能力也会受 到抑制。 空壳载体 ,删除了病毒基因组,只保留了及包装信号, 也称为裸腺病毒载体,是第代腺病毒载体。它去除了所有病毒编码基因,仅保留了 ’和’末端反向重复序列与野生型腺病毒的包装信号,需要辅助病毒提供编码序列 。这种病毒可有效的形成小的病毒基因组并包装成病毒颗粒,同时小基因组除含 有包装信号和外源基因表达盒外,完全不含有病毒毒性基因,毒性降低到最小的范围, 且容量扩大到,正成为目前基因治疗研究的热点。 至今为止已发展了两种构建重组腺病毒载体的方法:体外直接连接 或体内同源重组 ,。 体外直接连接法:分离基因组小片段,然后进行修饰,最后与基因组大片段进行连 接。连接产物可用于转染相应的细胞以制备重组腺病毒。体内同源重组:包括细胞内 病毒同源重组和细胞内质粒同源重组。细胞内病毒同源重组:将载有 外源的腺病毒基因组左端与大片段同时转染到细胞内,通过同源重组制备腺病 毒载体。细胞内质粒同源重组:主要利用质粒的形式,将腺病毒基因组 的倒置末端相连形成环状,由于插入有细菌质粒的复制原片段,该环状腺病 毒 可以在细菌内复制,环状腺病毒由于细菌质粒插入其总基因组长度超过包装限度, 在细胞内不会被包装成病毒体,但可以为载有腺病毒基因组左端和外源的穿梭 质粒提供同源性病毒重组的材料。因此被称为腺病毒基因组质粒。这种方法因 便于操作,产生野生型病毒回变子的几率相对小,是现在制备腺病毒载体的常用方 法。 、腺病毒载体的发展趋势: 为了更好的使用腺病毒载体,对腺病毒载体使用的改造正朝着下面个方向发展。 降低免疫原性 腺病毒载体中病毒抗原和外源基因刺激细胞反应,不仅降低重组病毒的有效性, 对宿主肝细胞也有毒性。另外辅助细胞和针对病毒衣壳蛋白的细胞的激活导致中 和抗体生成,降低载体重复疗效。为此可对机体免疫反应进行调节修饰或改进重组载 体病毒骨架,减少病毒体蛋白表达,。改建病毒骨架 尽量用最少的病毒骨架携带适宜目的基因,不仅可降低宿主免疫反应、延长 外源 基因表达时间,还可扩大装载容量,提高载体效能,。 提高转导效率 腺病毒载体对上皮细胞和内皮细胞中分化细胞基因转导效率很低,因为该细 胞第章腺病毒载体及其在基因治疗中的应用研究综述 缺乏结合病毒衣壳蛋白受体活性卜。 增强靶向性 在基因治疗中,如能将外源基因特定导入靶器官,将最大限度杀伤病变细胞, 而不损伤正常组织。可以通过以下几种方式:.利用组织特异性调节子增加靶 向性, ;.人工设计可调控表达系统:.利用腺病毒与宿主之间的相互作用改变结 合特异性?。第章嵌合型启动子在肿瘤细胞和正常细胞中的活性 第章嵌合型启动子在肿瘤细胞和正常细胞中的活性 近年研究发现,端粒酶在%.%的肿瘤细胞中呈高表达,而在大部分正 常的体细胞中不表达或低表达。人端粒酶逆转录酶. 仃,是端粒酶重要的组成成分,只在肿瘤细胞中特异表达,并且 端粒酶活性与琅表达密切相关【.】。玎基因是一个单拷贝基因,’ 端为调控区,其启动子即位于该调控区内,该区的一个最显著特点是含量多, 高达.%。启动子区无典型的盒和丸叮盒,但在主要转录起始点附近 或上游存在许多潜在的转录区结合位点【.】。卫盯活性调控主要发生在其 转录水平。启动子在端粒酶阳性的细胞中被激活,而在端粒酶阴性的正 常细胞中受抑制】。人表皮生长因子受体印眦 矗 ,/属于家族成员,该基因被认为是在肿瘤中过度表 达,而在正常组织中表达水平非常低【.】。在本论文中我们构建了包含 启动子的核心序列和也/基因增强子的嵌合型重组子,采用荧光素酶报告 基因检测系统,检测它们在肿瘤细胞、正常细胞和原代正常细胞中的活性, 并与 阳性对照.中的病毒启动子比较,同时设立阴性对照 .,以期能在肿瘤的基因靶向治疗研究中提供一定的依据。同时我们还 检测了肿瘤细胞和正常细胞中人端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体的 表 达情况,作为嵌合型启动子活性的参考数据。 一、实验材料和试剂 、菌株和克隆载体: 大肠杆菌 为本室保存。 质粒一、一,,,购自 公司,前者为无启动子的含有虫荧光素酶基因的质粒,后者为含 、 并含有虫荧光素酶基因的质 有 粒。 、合成由人端粒酶逆转录酶启动子和人表皮生长因子受体增强子 /构成的嵌合型启动子及用引物:上海生工生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 有 限公司合成 最终构建成的质粒?含有的人表皮生长因子受体的增强子 和启动子的核心序列,一到。 人端粒酶逆转录酶启动子引物:第章嵌合型启动子在肿瘤细胞和正常细胞中 的活性 上游:’一从一’ 游:’一一’ 扩增大小为片段; 磷酸甘油醛脱氢酶 ,引 物序列: 一 从一’ 上游: 一 下游:’一 , 扩增大小为 的片段。 、细胞: 所用到的人细胞系包括肝癌细胞,,一,,胃癌 细胞一,结肠癌细胞一,一,肺癌,宫颈癌,乳腺 癌一,一,?一,正常成纤维细胞,一,正常肝细胞 一,,人胚肾细胞均培养于含有%胎牛血清的培养液 中。原代培养的肺成纤维细胞命名为和原代培养的人脐静脉内皮细胞 删均培养于含有%胎牛血清的一培养液中。 、主要试剂: 转染试剂锄 购自公司。提取试剂 购买于公司。 购于公司,购于公司。 抗体购于公司,即用型试剂盒,显色试剂盒均购于 博士德公司。 二、实验方法 、含有报告基因的真核表达载体的构建及鉴定: 嵌合性启动子和人端粒酶逆转录酶启动子分别插入质粒 一图的位点构建成质粒一和一。质粒 一分别用和 酶切以鉴定 连接的正反向。质粒一用双酶切鉴定,理论上结果为: 。 ..第章嵌合型启动子在肿瘤细胞和正常细胞中的活性 图.一载体图谱。说明:,编码修饰的荧光素酶:,氨苄抗性基因; ,源于丝状噬菌体的复制起始点;,大肠杆菌的复制起始点。在和,基 因中的箭头指示转录的方向:在 中的箭头指示单链合成的方向。 .一 . :,. ;, : ,:, ... 、细胞转染和荧光素酶报告基因检测: .将细胞按 个/孔种于孔板中,后用脂质体 ,转染。以一为阴性对照,以一为阳性 对照,将一,一,一,一各分另与 ?表达质粒 ??,共转染,一,, 删,,,一,和细胞。转染后换液,继续培养。 .启动子的转录活性用腿 , 仪器检测。后按试剂盒方法, 收细胞, 并测荧光粒子数和值,值反应每孔细胞的转染效率。各启动子的相 对活性以荧光粒子数/值的比值来计算比较,以一的荧光素 酶活性为%计算,每种细胞转染实验重复次。 、提取及?和免疫细胞化学实验: 按试剂盒说明书提取各种细胞的总,,,六 孔板中的细胞长至%汇合度时,用洗次,利用试剂抽提细胞总 .第章嵌合型启动子在肿瘤细胞和正常细胞中的活性 的?的水中,稀释 。取 上述提取的溶解于 波长的光吸收值 倍,紫外线分光光度仪测定浓度,并读取在和 的比值,/比值应在.?.之间。 于? 后进行下一步的逆转录及扩增实验,主要步骤为:取 的反应体系 孵育,快速离心后置于冰上,于小管中准备 × ,: ,:,.: ,: ,: ,.: ,:力口 ? 至。?反应后,?加热,?放置。 将此第一链存放于一?备用。 然后进行扩增实验。 用于。 将上述逆转录稀释成 混合物, .山 . ×妇衙 .山 酶 上游引物 斗 下游引物 斗 斟..的水 总体积 斗 反应条件为: ? 预变性血 ? ? 卜 ?? 产物在%的琼脂糖凝胶中电泳。 免疫细胞化学实验: 细胞铺于孔板中,每种细胞各铺两个孔,实验时一孔不加一抗作为对照, 一抗?冰箱中杂过夜.具体步骤:第章嵌合型启动子在肿瘤细胞和正常细胞 中的活性 .固定细胞用×洗三次,每次,然后空气中干燥, 冷丙酮或多聚甲醛%固定一。 .封闭细胞内源性过氧化物酶吸去多聚甲醛,用洗三次,每次 ,后于%一甲醛处理。 .孵一抗洗三次,每次,滴加%一%羊血清室温放 置湿盒内封闭,不要洗,直接滴加适量的一抗,放在湿盒内?, 或?湿盒过夜。 .孵二抗洗三次,每次,加二抗/孔,室温或者 ?,。 .显色洗四次,每次。滴加即用型,一?,, 洗四次,每次。滴加,显色,镜下控制反应时间。蒸馏水洗 三次,每次。加苏木素轻度复染,蒸馏水洗涤,滴加一滴封片剂%甘 油。 .显微镜下观察,拍照。 三、实验结果 、含有报告基因的真核表达载体的构建及鉴定 嵌合性启动子和人端粒酶逆转录酶启动子分别成功插入质粒 一的位点。实验时质粒一挑取个阳性克隆,分别用 和 酶切,酶切鉴定结果显示连接正 确,如图所示。实验时质粒质粒一挑取个阳性克隆,用 双酶切鉴定: ,结果显示连接正确,释放的片段大小与预期的结 果一致,如图所示。 图.载体酶切鉴定图谱分别用和单酶切鉴定。、、是 阳性克隆经酶切,、、分别是三个阳性克隆,、、是阳性克隆经 酶切,、、分别对应于、、泳道的阳性克隆,泳道是,泳道是 。: , ,,,, : , ; ,,,,,.第章嵌合型启动子在肿瘤细胞和正常细胞中的活性. ?图.一载体酶 切鉴定图谱用和酶切鉴定、是两个阳性克隆经 和双酶切,是,是。. 一、荧光素酶报告基因检测嵌合型启动子活性 荧光素酶报告基因检测方法用于检测启动子在肿瘤细胞和正常细胞中的转 录活性。在肿瘤细胞中,与质粒一相比人端粒酶逆转录酶启动子 和嵌合型启动子的活性超过倍以上,有显著性差异;而在正常 细胞和中,人端粒酶逆转录酶启动子和嵌合型启动子的活 性都很低,而且两者没有显著的差别,在细胞和细胞中两者的值分别 是.和.。除此之外,在人胎肝细胞一中,人端粒酶逆转录酶 启动子和嵌合型启动子也有较高的转录活性,这可能是因为一 胎肝细胞本身的端粒酶逆转录酶就有一定水平的表达,我们后面的实验结果 也印 证了这一点。在/表达阳性的肿瘤细胞中,如,,, 一,删,细胞,含有嵌合型启动子的质粒的启动子转录活 性比仅有人端粒酶逆转录酶启动子的质粒的转录活性要高图。这些 结果显示含有人端粒酶逆转录酶启动子和人表皮生长因子受体增强 子/构成的嵌合型启动子在我们检测的大部分肿瘤细胞中要比 野生型的人端粒酶逆转录酶启动子有更强的转录活性。第章嵌合型启动子在 肿瘤细胞和正常细胞中的活性 委 蚕 × 受 翼 薹 蓁 薹 妻 霎 萎 委 ? 釜 譬 . 蓍 委 ? 薹 箍 萋 ? ?甍 嚣 毛 妻 霉?? , 。:? 萋 匡 蓁 萼 , ?一 . 霉 萋 善 萎 韫 薹 、 面 ; 葭 》 蓁 》 萋 蓁 一一 蓁 藿 薹 匡 ? 鏖霪; 重 ; 拿鏖 藿 蒌 蜃藿 ? 蘑 霞墨 霎 藿 筐壤 鋈篓 . ?矿????‖ 图.荧光素酶活性检测。质粒?,一,和. 转染细胞。后检测荧光素酶活性。质粒用作阳性对照。质粒?? 用于标准化转染效率。实验重复三次。数据以平均数标准差表示,术表示与 组 相比.,料表示与一组相比.。 .. ?,?,一, 一 . .一 . ?? . . .木. . 术木. . . 一 , 一 、肿瘤细胞和正常细胞中人端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体 /的表达 从培养的细胞中提取总如图,逆转录成后,用特异性的人端第章嵌合型启动 子在肿瘤细胞和正常细胞中的活性 ,,?,,卜,,和一中 阳性表达,同时在胎肝细胞系一中也有一定的表达图。人表 皮生长因子受体/在不同细胞中的表达是通过免疫细胞化学方法检 测的。结果是在正常细胞中,,一和是阴性表达的,但 是在肿瘤细胞一,一,,一,删,,,一 和中是阳性表达的图。口 图.不同细胞的提取。卜泳道分别为:,一,一,,姗, ,卜,一,,,,一和细胞。 . ? 】 第章嵌合型启动子在肿瘤细胞和正常细胞中的活性 卜.主 譬二正 工 岔,、, ..? 虽 出一 ???”啊铲,。霸 . 融。麓。糍 。.。,?鲞 ‰ 一?霹可 ? 岛意 ?孵器罄羚??? 埝?.。“ /。。。? 图.人端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体在肿瘤细胞和正常细胞中 的表达特征。从细胞中提取总,?方法检测的表达。基因作为内 参照。免疫细胞化学用于检测不同细胞中的/基因的表达。细胞孵育的抗体 是 小鼠抗单克隆抗体,二氨基联苯显色。。 瑚 明珊. , ?.一一 . / 衄鲫霄 ? .. ..第章嵌合型启动子在肿瘤细胞和正常细胞中的活性 四、讨论 人端粒酶逆转录酶催化亚单位的转录上调发生在很多的肿瘤细胞 中,在肿瘤中的广泛表达使得成为不同类型的治疗策略的有效靶点, 。我们的实验结果显示人端粒酶逆转录酶和人表皮生长因子受体 /在肿瘤细胞和正常细胞中有不同的表达。所用到的肿瘤细胞有肝 癌细胞,,一,?,胃癌细胞一,结肠癌细胞 一,肺癌,宫颈癌,乳腺癌一,正常细胞有正常成纤维细胞 ,正常肝细胞一,,原代培养的肺成纤维细胞命名为和原 代培养的人脐静脉内皮细胞。细胞类型较多,能在一定程度上说明端粒 酶在肿瘤细胞中呈高表达,而在大部分正常的体细胞中不表达或低表达。人表皮 珈 生长因子受体 ,/在肿瘤中过度表达,而在正常组织中表达水平非常低。与文献报道一致。 包含启动子的核心序列和基因增强子的嵌合型重组子,采用荧 光素酶报告基因检测系统,检测了它们在肿瘤细胞、正常细胞和原代正常细胞中 的活性,结果显示了嵌合型启动子在肿瘤细胞中的转录特异性,能够用于后续的 肿瘤基因靶向性治疗研究。第章携带抗血管生成基因的腺病毒载体的构建 第章携带抗血管生成基因的腺病毒载体的构建 肿瘤靶向性基因治疗是近年来肿瘤研究的热点,也是最有希望取得突破的 领域之一【,】。其原理是将抗肿瘤基因置于肿瘤特异性基因调控序列的调控 下,使其选择性地在肿瘤细胞中表达,从而避免对正常细胞的损伤】。理想的 肿瘤基因治疗策略是,目的基因的表达能力区别正常组织和肿瘤组织,且对肿瘤 组织的类型无选择性,能在多种肿瘤组织中表达。利用特异性的基因启动子使目 的基因在在特定的组织、细胞或器官中表达,实现对肿瘤靶向性治疗的目的,是 一种非常有意义的基因治疗途径【.】。近年越来越多的数据显示,实体瘤以及 它们的转移是血管生成依赖性的。抗血管生成治疗的目的就是阻止肿瘤周围的新 生血管的形成并破坏滋养肿瘤块的不正常毛细血管网络系统。人内皮抑素 眦,,一种分子量为的蛋白,它是由细胞对基质?硫 酸肝素蛋白胶原?羧基末端片段水解而来。内皮抑素是特异性的血管内皮细 胞生长抑制因子,能显著抑制肿瘤血管增生并诱导肿瘤细胞凋亡。内皮抑素的抗 血管生成治疗和血管靶向基因治疗,为治疗癌症提供了广阔前景【?。 病毒载体是目前基因治疗中应用最广泛的载体。与其他病毒载体相比,腺 病毒载体因其具有感染效率高、弱免疫原性、不整合到染色体中、外源基因装载 容量大、表达水平高等特点而被广泛应用,】。 本实验通过细胞内重组的方法,构建了由人端粒酶逆转录酶启动子 和人表皮生长因子受体增强子/构成的嵌合型启动子调控 修饰的腺病毒关键基因 的表达,同时由巨细胞病毒 ,启动子驱动人内皮抑素基因表达的肿瘤特异性 溶瘤腺病毒;作为对照的亦携带人内皮抑素基因的增殖缺陷型腺病毒也 同时构建。通过检测和基因的表达来监测病毒感染及增殖效率。在 细胞中重组得到病毒后扩增纯化,并用、 等方法验证和 也的表达,为进一步研究这种重组病毒的功能奠定基础。同时构建携带增强 型 绿色荧光蛋白妇 ,报告基因的增殖缺陷 型和增殖型腺病毒作为对照。 一、实验材料和试剂 、菌株、细胞及质粒: 大肠杆菌 、质粒、、、、、携带增强型 绿色荧光蛋白 ,报告基因的腺 第章携带抗血管生成基因的腺病毒载体的构建 ’基因的腺病 病毒载体质粒?、携带人内皮抑素 毒载体质粒、携带野生型基因质粒一、含有型腺病毒右臂 并缺失/区的腺病毒骨架质粒、携带人端粒酶逆转录 酶启动子和人表皮生长因子受体增强子/构成的嵌合型 启动子的质粒?、人胚胎肾细胞,均为本室保存。 、主要试剂及引物: 主要试剂: ?扩增试剂盒、限制性内切酶、连接酶、 、 、蛋白酶 公司 ?液体培养基: 配方 学校职工宿舍分配方案某公司股权分配方案中药治疗痤疮学校教师宿舍分配方案医生绩效二次分配方案 蛋白胨,酵母提取物, ,调为.,高压蒸汽?灭菌 。 ?固体培养基: 配方 蛋白胨,酵母提取物, ,琼脂粉 ,调为.,高压 蒸汽?灭菌,待冷却至?,在超净台内倒平板,于?保存。 ?溶液: . ,?】 ?.,玎 .?溶菌酶/:称取的溶菌酶,溶于的 .。 ?溶液: 葡萄糖, ?., .高压蒸汽? 灭菌,?保存。 ?溶液: . ,%现配现用,盖紧瓶盖,缓慢颠倒数次,以充分混匀内容 物。 ?溶液: ’ 乙酸钾,冰乙酸.,水. 配方 ?×电泳缓冲液: . ,冰乙酸., . ?×电泳缓冲液: 配方 . . ,硼酸, ?工作液: ,雌 ,% 蔗和营,/ ?., ,/溶菌酶,配成体积,分装后,一?保存。 .第章携带抗血管生成基因的腺病毒载体的构建 :? ,?】 ,%,%宸蓑帮善,.% ?.,.】 溴酚蓝,配成体积,分装后,一?保存。 ?青/链霉素双抗: 青霉
本文档为【携带抗血管生成基因的肿瘤靶向性溶瘤腺病毒的抗肿瘤作用的研究】,请使用软件OFFICE或WPS软件打开。作品中的文字与图均可以修改和编辑, 图片更改请在作品中右键图片并更换,文字修改请直接点击文字进行修改,也可以新增和删除文档中的内容。
该文档来自用户分享,如有侵权行为请发邮件ishare@vip.sina.com联系网站客服,我们会及时删除。
[版权声明] 本站所有资料为用户分享产生,若发现您的权利被侵害,请联系客服邮件isharekefu@iask.cn,我们尽快处理。
本作品所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用。
网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽..)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
下载需要: 免费 已有0 人下载
最新资料
资料动态
专题动态
is_105949
暂无简介~
格式:doc
大小:69KB
软件:Word
页数:0
分类:工学
上传时间:2017-11-29
浏览量:17