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GST蛋白纯化.doc

GST蛋白纯化

Tracy瑞
2017-09-20 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《GST蛋白纯化doc》,可适用于综合领域

GSTbestaroseFF说明书默认分类::阅读评论字号:大中小GSTbestaroseFF是专门用于纯化pGEX系列载体表达的GST标签蛋白其它谷胱甘肽转移酶以及与谷胱甘肽有亲和作用蛋白的分离介质操作简单快速。GSTbestaroseFF可直接从预处理的细胞裂解物中纯化GSTtagged蛋白纯化条件温和可以保证蛋白的生物活性。GSTbestaroseFF具有高流动性易于放大GSTbestaroseFF有快速方便的预装柱EzFastbestaroseFFml和ml。介质性能谷胱甘肽是通过碳原子的连接臂偶联到高度交联的琼脂糖上。最优的偶联作用使介质具有高GSTtagged蛋白及与谷胱甘肽相互作用蛋白的结合能力。总的蛋白结合能力约为每毫升填料结合mg标签蛋白动态结合能力随着外界因素改变如不同的目标蛋白流速等等。如果需要去除GST部分(天然蛋白分子量为KD)当蛋白吸附在柱上或在洗脱后用位点专一的蛋白酶消化选用前种方法可减少额外分离目的蛋白与GST步骤消化后目的蛋白直接用结合液洗脱即可。 表GSTbestaroseFF性能配体                             谷胱甘肽与碳原子连接臂配体浓度                         μmol谷胱甘肽ml填料蛋白结合能力                     ≈mg重组GSTtagged蛋白ml填料GSTMr动态结合能力                     ≈mgGSTtagged蛋白ml填料Mr平均颗粒大小                      μm组成                              高度交联的琼脂糖最大流速*                         cmh(mlmin)XK层析柱柱高cm,水溶性缓冲液室温纯化建议的流速**                     上样:<cmh(<mlminXK层析柱)                                 洗涤与洗脱:cmh(mlminXK层析柱)化学稳定性                       所有常用的水溶性缓冲液中稳定如:M醋酸盐pHM盐酸胍室温hpH稳定性                        pH贮存温度                         ℃贮存液                           乙醇*水是室温的。**结合力与流速有关低流速增加结合量这在上样和洗脱过程中非常重要。蛋白性质pH温度也影响结合量。 试剂配制缓冲液的配制:用来配缓冲液的水及化学试剂纯度要求很高建议试剂配好后用μm滤膜过滤。结合液:PBSpH(mMNaClmMKClmMNaHPOmMKHPOpH)洗脱液:mMTrisHClmM还原性谷胱甘肽pH)注意:结合液和洗脱液中可以含有mMDTT。样品的准备:上样前样品需离心或用滤膜过滤。如果样品太稠用结合液稀释以防堵塞柱子如果是batch纯化则可以不过滤样品。 Batch纯化GSTbestaroseFF的准备确定你所需的介质体积。注意:介质是贮存在乙醇中的洗净后配成。轻轻摇匀瓶中的介质。用移液枪或量筒取适量的介质到一个干净的管子中。沉淀×gmin。小心倾去上清液。加每毫升介质加毫升PBS洗涤颠倒混合。沉淀×gmin。小心倾去上清液。重复步骤和次。 Batch纯化步骤将细胞裂解液加入准备好的胶中旋转仪轻轻转动混合室温至少min,用移液枪或量筒取适量的介质到一个干净的管子中。沉淀×gmin。小心倾去上清液(相当于流穿液)保留一些用SDSPAGE电泳检测介质结合能力。每毫升步骤沉淀加毫升PBS洗涤。沉淀×gmin。小心倾去上清液(相当于洗涤液)保留一些跑电泳。重复步骤和两次。每毫升步骤沉淀加mlmMTrisHClmM还原型谷胱甘肽pH旋转仪于室温轻轻转动混合min。沉淀×gmin。小心倾去上清液(相当于洗脱液)。重复步骤和两次。分别检测这三次的洗脱液。注意:          GST融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢为获得最大结合量需要保证足够的作用时间。不同的GST融合蛋白结合效率差异显著。          不同的GST融合蛋白取得最佳纯化效果所需还原型谷胱甘肽浓度洗脱体积和洗脱时间可能有所不同。必要是需对流穿液洗脱液进行SDSPAGE以及Western杂交分析以确定最佳纯化条件。          GST检测试剂盒可辅助优化洗脱条件分析纯化过程的每个步骤该试剂盒主要用生化或免疫分析检测GSTtagged蛋白。          A处的吸收值可用来估算GSTtagged蛋白浓度约A~对应浓度为mgml。          GSTtagged蛋白浓度也可用标准的显色方法测定(如LowryBCA和Bradford法)。如果用Lowry法和BCA法样品首先要脱盐或在PBS中透析去除谷胱甘肽因为谷胱甘肽会干扰蛋白的吸收而Bradford法不受谷胱甘肽影响。          介质的再次使用主要取决于样品的性质必须是同一个样品防止交叉污染。 层析柱层析建议使用的层析柱:Tricorn:柱体积ml柱高cm。XK:柱体积ml柱高cm。或者GSTEzFastFFml和ml的预装柱也可使用。装柱所有的材料都处于纯化时所需的温度。用pHPBS冲洗柱底部的垫片避免垫片下面滞留气泡在液面低至cm高度时关闭层析柱下端出口。摇匀瓶中的介质。估算所需介质的(匀浆的浓度约为)。吸取介质用玻璃棒紧靠柱子内壁引流将介质加入到层析柱中这可以减少气泡的产生。立即用PBS灌满柱子放上上层垫片将柱子连接到泵上。打开下端出口设置流速。至少流过三倍柱体积的PBS直到界面不变在界面处做上记号。注意:纯化时的流速不要超过的装柱流速。关闭泵并关闭柱子下端出口去除层析柱上层垫片小心的用PBS封满柱子在顶部形成一个凸面。从一角插入转接头确保网下没有空气残留。将转接头缓慢向下移动(转接器上接口是打开的)到记号处停止并锁住转接头把把柱子连接到泵上或色谱分析系统上开始平衡。如果需要可重新移动转接头的位置。 层析柱纯化步骤倍体积的结合液平衡柱子。加入以处理好的样品。倍柱体积的结合液洗涤柱子直至在流穿液中检测不到东西。保留一些用SDSPAGE电泳检测介质结合能力。倍体积的洗脱液洗脱蛋白。注意:          影响GSTtagged蛋白及与谷胱甘肽作用的蛋白结合的最重要因素是介质的流速GST融合蛋白与还原型谷胱甘肽的结合比较缓慢为获得最大结合量需要保证足够的作用时间。蛋白性质pH温度也影响蛋白的结合。          不同的GST融合蛋白取得最佳纯化效果所需还原型谷胱甘肽浓度洗脱体积和洗脱时间可能有所不同。必要是需对流穿液洗脱液进行SDSPAGE以及Western杂交分析以确定最佳纯化条件。          GST检测试剂盒可辅助优化洗脱条件分析纯化过程的每个步骤该试剂盒主要用生化或免疫分析检测GSTtagged蛋白。          A处的吸收值可用来估算GSTtagged蛋白浓度约A~对应浓度为mgml。          GSTtagged蛋白浓度也可用标准的显色方法测定(如LowryBCA和Bradford法)。如果用Lowry法和BCA法样品首先要脱盐或PBS中透析去除谷胱甘肽因为谷胱甘肽会干扰蛋白的吸收而Bradford法不受谷胱甘肽影响。          介质的再次使用主要取决于样品的性质必须是同一个样品防止交叉污染。  介质的清洁当沉淀物变性的及非特异性吸附的蛋白累积时介质的结合能力会下降。          去除沉淀物及变性蛋白:倍体积的M盐酸胍洗涤然后快速用倍体积pHPBS洗涤。          去除疏水性结合的蛋白:用倍体积的乙醇或倍体积的TritonX洗涤然后快速用倍体积pHPBS洗涤。 贮存贮存于乙醇中℃。 GST标签的切除在大多数情况下融合部分保留它的功能活性可用完整的GST融合蛋白检测其活性。如果需要切除GST标签当蛋白吸附在柱上或在洗脱后用位点专一的蛋白酶如PreScission蛋白酶凝血酶或Xa因子切除。   如果酶切条件需要优化时建议洗脱后酶切。易于随时取样通过SDSPAGE电泳分析产量纯度及酶切情况。完全酶切的蛋白酶的用量温度及酶切时间随不同的融合蛋白改变。在中试研究中确定融合蛋白的最适条件如加大酶量酶切时间可以减小。PreScission蛋白酶PreScission蛋白酶Mr。PreScission酶切缓冲液:mMTrisHClmMNaClmMEDTAmMDTTpH。 PreScission蛋白酶酶切结合在层析柱上的GSTtagged蛋白假设:mgGSTtagged蛋白ml填料接着“Batch纯化”步骤或“柱纯化”步骤。用倍柱体积的PreScission蛋白酶缓冲液平衡结合带有融合蛋白的柱子。准备PreScission蛋白酶切体系:每毫升结合融合蛋白的柱体积℃条件下准备μl(个单位)PreScission蛋白酶和μlPreScission蛋白酶切缓冲液的混合物。将准备好的酶切体系加到层析柱上封住层析柱。如果是batch纯化PreScission蛋白酶切体系与介质混合即可轻轻摇动或旋转悬浮液。℃酶切h。之后用倍体积的酶切缓冲液洗涤柱子用不同的管子收集洗脱液以防收集的蛋白稀释分析鉴定。如果是batch纯化离心×gmin小心的将洗脱液转移到干净的管子里洗脱液中含有目的蛋白而GST标签部分及PreScission蛋白酶则继续留在介质上。 PreScission蛋白酶酶切洗脱的GSTtagged蛋白。假设:mgGSTtagged蛋白ml填料首先用脱盐柱去除还原型谷胱甘肽或用PreScission蛋白酶酶切缓冲液透析。洗脱液中μg融合蛋白中加入μl的PreScission蛋白酶。如果洗脱液中的融合蛋白的浓度还没测定则每毫升介质对应加μl的PreScission蛋白酶。℃酶切h。用酶切后的样品平衡柱子去除GST标签及PreScission蛋白酶。室温孵育min。沉淀×gmin。目的蛋白在上清液中。 凝血酶凝血酶Mr。凝血酶酶切缓冲液:PBSpH。缓冲液的配制:将U凝血酶溶解在冷的μlPBSpH(Uμl)。轻和的涡旋溶解。分装μl一管保存在-℃。 凝血酶酶切结合在层析柱上的GSTtagged蛋白假设:mgGSTtagged蛋白ml填料接着“Batch纯化”步骤或“柱纯化”步骤。准备凝血酶酶切体系:每毫升的柱体积℃条件下准备μl(个单位)凝血酶和μlpHPBS的混合物。将准备好的酶切体系加到层析柱上封住层析柱。如果的batch纯化reScission蛋白酶切体系与介质混合即可轻轻摇动或旋转悬浮液。室温(℃)酶切h。之后用倍体积的酶切缓冲液洗涤柱子用不同的管子收集洗脱液以防收集的蛋白稀释分析鉴定。如果是batch纯化离心×gmin小心的将洗脱液转移到干净的管子里洗脱液中含有目的蛋白而GST标签及凝血酶则继续留在介质上。 凝血酶酶切洗脱的GSTtagged蛋白。假设:mgGSTtagged蛋白ml填料洗脱液中mg融合蛋白中加入μl的凝血酶。如果洗脱液中的融合蛋白的浓度还没测定则每毫升介质对应加μl的凝血酶。室温(℃)酶切h。酶切后用脱盐柱去除还原型谷胱甘肽或用凝血酶酶切缓冲液透析。然后再用样品平衡柱子。室温孵育min。沉淀×gmin。目的蛋白在上清液中而GST标签及凝血酶则继续留在介质上。 Xa因子Xa因子Mr。注意:Xa因子是由二硫键连接的两个亚基组成。因为还原型谷胱甘肽能破坏二硫键因此在酶切反应前必须将它去除。Xa因子酶切缓冲液:mMTrisHClmMNaClmMCaClpH。缓冲液配制:将UXa因子溶解在冷水中(Uμl)。轻和的涡旋溶解。分装μl一管保存在-℃。 Xa因子酶切结合在层析柱上的GSTtagged蛋白假设:mgGSTtagged蛋白ml填料接着“Batch纯化”步骤或“柱纯化”步骤。用倍柱体积的Xa因子缓冲液平衡结合带有融合蛋白的柱子。准备Xa因子酶切体系:每毫升结合融合蛋白的柱体积准备μl(个单位)Xa因子和μlXa因子酶切缓冲液的混合物。将准备好的酶切体系加到层析柱上封住层析柱。如果的batch纯化Xa因子切体系与介质混合即可轻轻摇动或旋转悬浮液。室温(℃)酶切h。之后用倍体积的酶切缓冲液洗涤柱子用不同的管子收集洗脱液以防收集的蛋白稀释分析鉴定。如果是batch纯化离心×gmin小心的将洗脱液转移到干净的管子里洗脱液中含有目的蛋白和Xa因子而GST标签则继续留在介质上。 Xa因子酶切洗脱的GSTtagged蛋白。假设:mgGSTtagged蛋白ml填料首先用脱盐柱去除还原型谷胱甘肽或用Xa因子酶切缓冲液透析。洗脱液中mg融合蛋白中加入μl的Xa因子。如果洗脱液中的融合蛋白的浓度还没测定则每毫升介质对应加μl的Xa因子。室温(℃)酶切h。用酶切后的样品平衡柱子去除GST标签。室温孵育min。沉淀×gmin。目的蛋白和Xa因子在上清液中。 疑难解答GSTtagged蛋白不结合到介质上          裂解时融合蛋白变性:过度的裂解会引起蛋白变性并阻碍它结合到介质上建议采用温和的裂解方法这些条件需经验摸索。          在细胞裂解液及缓冲液中加入DTT:DTT终浓度为mM可显著增加蛋白结合量。          检测pGEX空载体表达的GST活性:制备转化了pGEX质粒的细胞裂解液检测GST的结合情况。如果由空质粒表达的GST具有高亲和性融合蛋白可能改变了GST的构象导致它的亲和性降低。大量的研究表明温度降为℃且减少洗涤时有利于增加结合量。          使用前平衡柱子:pH低于或高于时融合蛋白的结合效率很差上样前请确保介质已用pH的缓冲液平衡。          使用结合能力高的介质:如果介质已经用了很多次则有必要更换新的介质。          上样时降低流速。 GSTtagged蛋白不能完全从介质上洗脱下来          增加洗脱时间:洗脱时降低流速。          增加洗脱液体积:尤其在层析柱上切除标签时需要大量的洗脱液洗脱目的蛋白。          增加洗脱液中谷胱甘肽浓度:大多数情况下用mM谷胱甘肽足够了。特殊情况下用mMTrisHClmM还原型谷胱甘肽pH作为洗脱液。          增加洗脱液的pH:低pH会降低洗脱效果在不需要增加谷胱甘肽浓度的情况下可将pH调为。          增加洗脱液的离子强度:加入MNaCl。          更换新的介质。          在洗脱液中添加非离子型去污剂:非特异性疏水作用会阻碍融合蛋白的溶解和洗脱加入非离子型去污剂如TrionX或Noctylglucoside可明显改变洗脱的效果。 纯化后出现杂带的原因          与融合蛋白一起纯化到的蛋白Mr:分子量为的蛋白可能是Ecoli基因dnaK的编码产物它参与蛋白的折叠。据报道上样前样品在mMTrisHClmMATPmMMgSO缓冲液中℃放置min可避免这种现象发生。或用ATP琼脂糖凝胶或离子交换剂将DnaK蛋白去除。          增加蛋白酶抑制剂:蛋白酶可将目的蛋白降解成多个片段需在裂解液中加入mMPMSF。注意:在用凝血酶或Xa因子酶切前必须先将丝氨酸蛋白酶抑制剂除去。而PreScission蛋白酶不受大多数蛋白酶抑制剂影响。          用蛋白酶突变的宿主菌:杂带可能是宿主蛋白酶水解的结果如果这是主要原因我们可以采用蛋白酶突变的宿主菌如lon或ompT。          缓和裂解方法:可用显微镜或裂解液的半透明现象来观察细胞的裂解情况裂解前先加些溶菌酶(倍柱体积的含mgml溶菌酶的TrisHCl溶液)。避免泡沫生成它会引起蛋白变性过度的裂解也会使宿主蛋白和融合蛋白一起洗脱下来。          可以添加的纯化步骤:杂带是由所谓的伴侣分子蛋白产生该蛋白在Ecoli中参与蛋白的正确折叠这包括DnaK(Mr~)DnaJ(Mr~)GrpE(Mr~)GroEL(Mr~)和GroES(Mr~)及其它蛋白。许多从这些杂蛋白中纯化融合蛋白的方法已经报道。          交叉吸附Ecoli中抗体蛋白:Ecoli中可能会存在许多抗GST标签的抗体它们会与融合蛋白相互吸附。 GST标签不完整切除          PreScission蛋白酶、凝血酶及Xa因子与融合蛋白的比例不正确:检查酶切反应中融合蛋白的量。参照每毫升GSTbestaroseFF介质能吸附毫克融合蛋白大多数情况下介质不能被融合蛋白饱和。比例:PreScission蛋白酶至少Umg融合蛋白。凝血酶至少Umg融合蛋白。Xa因子不少于(WW)融合蛋白一些融合蛋白需用Xa因子最佳的量需要经验摸索。在一般情况下融合蛋白的浓度为mgml时酶切效果最好。反应液中加入≤SDS(WV)可以有效增加Xa因子切除标签的效果。用不同浓度的SDS实验以得到最适浓度。          增加酶切时间和酶量:融合蛋白不会降解的情况下可将PreScission蛋白酶、凝血酶及Xa因子的酶切时间延长为h。酶的用量也可以提高。          核查特异性酶切位点:核对DNA序列与已知序列比对核查基因克隆的序列特异性酶切位点是否改变。 确保加入蛋白酶抑制剂:          PreScission蛋白酶:酶切前在mMTrisHClmMNaClmMEDTAmMDTTpH的缓冲液中透析或更换缓冲液。          Xa因子:mMTrisHClmMNaClmMCaClpH的缓冲液中透析或更换缓冲液。          Xa因子需要激活:功能性的Xa因子需要用Russell’vipervenom激活激活反应条件为Russell’vipervenom与Xa因子的比例为在mMTrisHClmMNaClmMCaClpH的缓冲液中℃孵育min。          Xa因子识别位点后的第一个氨基酸是Arg或Pro:核查融合蛋白的核苷酸序列确保Xa因子识别后的三个核苷酸编码Arg或Pro。 酶切后的多条带分析:          检测条带出现的时间:确定杂带不是出现在酶切前这些条带可能是蛋白酶水解的结果。          融合蛋白可能含有PreScission蛋白酶、凝血酶及Xa因子识别的序列:核查序列。

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