【doc】大肠杆菌O157志贺毒素1胶乳凝集试剂的研制

【doc】大肠杆菌O157志贺毒素1胶乳凝集试剂的研制 大肠杆菌O157志贺毒素1胶乳凝集试剂的 研制 ※基础研究量品斟学2DD6'f.27,No.129 大肠杆菌O157志贺毒素1胶乳凝集试剂的研制 刘建青1,周志江.---,韩 (1.天津大学农业与生物工程学院,天津300072: 烨,郑峰,薄清如2 2.珠海出入境检验检疫局,广东珠海519015) 摘要:根据大肠杆菌933W志贺毒素1(sTx1)摹的序列, 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 合成寡核苷酸引物,以 国内分离的大肠杆菌O157 ,扩增的基因克隆到菌株94H的DNA为摸板,经PCR扩增志贺毒素1A亚基基因 原核表达载体pET-28a,在E.coli BL21中进行表达.用表达的STX1A产物免疫兔子,制各STX1A抗血清,从中提取 IgG.合成胶乳,用提取 的IgG与胶乳交连反应,研制出了敏感和简便的检测大肠杆菌O157STX1产生的 胶乳检测试剂. 关键词:大肠杆菌O157;志贺毒素1A亚基;原核表达;胶乳试剂 LatexParticleReagentPreparedforofEscherichiacoliO157Shiga-Toxin1 LIUJian—qing,ZHOUZhi-jiang.---,HANYe,ZHENGFeng,BOQing—ru. (1.SchoolofAgricultureandBioengineering,TianjinUniversity,Tianjin300072,China: 2.ZhuhaiEntry—exitInspectionandQuarantineBureau,Zhuhai519015,China) Abstract:ThesequenceencodingofthematureproteinofSTX1AofE.coliO157strain94H.isolatedfromsomepatientin China.WaSamplifiedbyPCR.TheprimersweredesignedfromSTX1toxingenesequenceofEcolistrain933W.Theamplified genewasclonedintoprokaryoticexpressionvectorpET-28a.ThentherecombinantpET28a-stxlAwastransformedintohost strainEcoliBL21fDE3).ExpressedrecombinantSTX1AWaSusedtOimmunizerabbitstopr epareanti-serum.TheIgGfraction oftheantiserumwascr0ss-linkedwiththelatexparticlesuspensiontoyieldafinalimmunoglo bulin.Thedescribedmethods enabledasensitiveandsimpleassayofSTX1Aproduction. Keywords.EcoliO157;STX1Asubunit:prokaryoticexpression:latexparticlereagent 中图分类号:$939.9文献标识码:A文章编号:1002.6630(2006)01.0029.05 大肠杆菌O157感染性腹泻是近年来新发现的危害严 重的肠道传染病,该菌可引起腹泻,出血性肠炎,继 发溶血性尿毒综合症(HUS),血栓性血小板减少性紫癜 (TTP)等.自1982年美国首次发现该病以来【l1,在世界 上许多国家相继发生了暴发和流行,其流行已成为全球 性的公共卫生问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 之一.近几年,我国已陆续有十多 个省份在食品,家禽,家畜,昆虫,腹泻病患者中 检出该致病菌,存在着疫情暴发,流行的潜在威胁. 大肠杆菌O157产生的志贺毒素(Shiga.toxin,STX)被 认为是该菌的主要致病网子,sTX分为两个亚类: STX1和sTX2.毒素蛋白由A和B两个亚单位组成, A亚基是毒力活性部分,B亚基则为结合亚基.鉴于vT 是大肠杆菌O157的主要致病性因子,因而毒素的检测 在疾病的诊断,流行病学调查及公共卫生检测,检疫 等方面具有重要作用.在国内,已有检测stx基因的方 法引,然而,尚未见有检测STX毒素的免疫学 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 的 报道.因此,本实验建立的胶乳试剂对食品,医学诊 断和流行病学调查中大肠杆菌O157STX毒素的的检测提 供了一个新的手段,进而对阐明该菌的致病机理,对 控制疾病的流行打下基础. 1材料与方法 1.1材料, l_1.1菌株 在2O株试验菌中,大肠杆菌O157(9684)从日本患者 分离,大肠杆菌O157(94H)从山东患者分离,大肠杆菌 O157(96001)从长春地区牛肉中分离,大肠杆菌O157 (96009)从长春地区猪肉中分离,大肠杆菌O157(97063, 97094)从长春地区牛粪中分离.大肠杆菌菌株BL21, JM109,DH5?等其余菌株为天津大学农业与生物工 收稿日期:2005.03.16}通讯作者 基金项目;国家自然基金资助项目(39670563) 作者简介:刘建青(1977.),女,讲师.硕士.研究方向为食品卫生与营养. 302DD6'场f.2No.1目品科学※基础研究 学院保存菌种(表1). 1.1.2载体 克隆载体pMD18.T日本TaKaRa公司;原核表达 载体pET28a天津大学农业与生物工程学院提供. lI1.3酶与主要试剂 T4DNA连接酶,TaqDNA聚合酶(5U/ix1),ExTaq DNA聚合酶(5U/ix1),各种限制性内切酶(NcoI,BamH I),溶菌酶,蛋白酶KTaKaRa公司;DNAMarker DL.2000日本TaKaRa公司;SDS.聚丙烯酰胺电泳低 分子量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 蛋白质上海丽珠东风生物技术有限公司;氨 苄青霉素(Amp,50mg~mi),卡那霉素(Km,5Om#wa)Sigma 公司:DNA片段凝胶回收试剂盒(AgaroseGelDNAEx- tractionKit),多粘菌素B北京鼎国生物技术发展中 心;实验动物兔子(成年雌兔,体重1,2kg,经观察健 康)吉林大学实验动物中心;辣根过氧化酶(HRP)标记 羊抗兔IgG北京中山生物技术公司.提取质粒用试剂 和SDS.PAGE用试剂均按《分子克隆 指南 验证指南下载验证指南下载验证指南下载星度指南下载审查指南PDF 》进行配制. 1.1.4主要仪器 PCR扩增仪(GeneAmpPCRSystem9600)PERKIN— ELMER公司:高速冷冻离心机日本KUBOTAi恒温 振荡器(TH2.82型)上海跃进医疗器械厂:垂直板电泳 槽Biome~a公司;稳压稳流电泳仪(DYYIII.2型)北 京六一仪器制造厂. 1.2方法 1.2.1PCR引物的设计与合成 根据Genebank中bacteriophage933W志贺毒素1 (stx1)基因序列,设计扩增引物.上游引物序列为5一 CCATI跚AAGa兀TACCTTAGACTrCTC(3(含Nco I酶切位点),下游引物为5一GGATCCTGAGTCAACG AAAAATAACTTCG.3(含BamHI酶切位点).预期 扩增DNA片段大小约882bp.引物由TaKaRa公司合成. 1.2.2PCR扩增stxl基因片段 提取大肠杆菌O157染色体DNA作为模板,用PCR 方法扩增stxl基因片段.PCR反应条件为:25ixl体系: 10×buffer2.5lll,2.5mmol/LdNTP2ixl,Tap酶(5U/Ix1) O.3lll,上游引物及下游引物各O.5lll,重蒸水18.2lll, DNA模板1lll.94?预变性5min,然后94?变性1min, 55?退火1min,72?延伸1rain,30个循环后,于72? 延伸10rain.产物用1.O%琼脂糖凝胶进行电泳检测,用 DNA片段回收试剂盒对PCR产物进行回收. 1-2.3目的基因片段与载体的连接 按照pMD18T使用说明将回收的PCR产物连接到该 载体上. 1.2.4感受态菌的制各,重组质粒的转化及鉴定 转化方法如下:在灭菌的1.5ml离心管中加入50ul 新鲜制备的JM109株感受态菌及2.5ul的连接产物,混 匀后冰浴1h.将离心管移入42?水浴中,恰好停留120s (切忌振荡).立即将离心管置于冰浴中,120s后再移入 37?水浴中孵育5min.向离心管中加入400ixlLB液体培 养基,在37?恒温振荡器上以110r/min培养lh.碱裂 解法提取质粒,同时用NcoI和BamHI双酶切鉴定重 组质粒.然后利用PCR反应对经酶切鉴定的可疑阳性质 粒做进一步的鉴定.对以上两种鉴定法鉴定后均认为符 合要求的阳性菌落进行过夜培养,制备成甘油菌,由 TaKaRa公司测定序列.用DNAsis软件分析测序结果. 1.2.5stxlA原核表达载体的构建及其在原核细胞中的 表达 将测序正确的克隆质粒与pET.28a载体用NcoI和 BamHI双酶切,分别回收插入片段和酶切载体,将二 者用T4DNA连接酶16?连接过夜,连接产物转入用氯 化钙致敏的BL21感受态细胞内.提取转化质粒,进行 酶切,PCR及测序鉴定.鉴定正确后进行诱导表达. 诱导时,接lml菌液于100ml加卡那霉素的LB液体培养液 中,37?振荡3,4h,按终浓度lmmol/L加IPTG,18? 过夜振荡诱导.收集菌体,用TE缓冲液清洗沉淀,将 菌体冻融数次用TE重悬后进行超声及尿素处理后进行 SDSPAGE蛋白电泳.考马司亮蓝染色和脱色后,做蛋 白薄层扫描.以确定重组质粒诱导的表达量占菌体总蛋 白的量. 1.2.6兔抗重组STX1A抗体的制备 制各目的蛋白包涵体,将包涵体进行纯化后配置成 1mg/ml的溶液作为抗原四次免疫家兔.进行心脏采血并 分离血清,用Westernblotting方法对抗体进行检测. 用常规饱和硫酸铵盐析提取IgG. 1.2.7天然STX1毒素的制备 天然STX1毒素的提取按文献【5】进行.基本方法是 将大肠杆菌O157菌株(94H)接种于PenassayBroth培养 基,37?振荡培养18h,每0.5ml菌液中加入25lO.1mg/ ml多粘菌素B溶液,37?振荡培养30min,然后500r/ mi11,2min离心菌液;上清即为天然STX1毒素. 1.2.8重组STX1A羧化胶乳检测试剂的制备 羧化聚苯乙烯的合成方法如下:应用三口圆底瓶, 加入去离子水180ml,预热至85?,加1%SDSlml, 过硫酸钾O.5g,苯乙烯20g,高速搅拌.30rain后加入 丙烯酸1ml,85?保持反应6h.冷却,离心,置冰箱 保存.产品为约1O%乳白色羧化胶乳.在1O%的羧化 胶乳lml中加入0.2mol/L,pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS) lml,0.02mol/L6.氨基己酸2ml和水溶性碳化二亚胺 4mg.室温中搅动2h后离心,倾去上清液,用0.1mol/L, ※基2oO6.Vo1.27,No.131 pH7.6PBS恢复至原体积.加入抗O157STX1AIgG2mg 和水溶性碳化二亚胺6mg,在4?搅动6h以上,用 0.1mol/L,pH8.0甘氨酸溶液0.4ml终止反应.离心,倾 去上清液,用0.13mol/L,pH8.2,含0.85%氯化钠的 硼酸盐缓冲液洗涤一次后,用同样的缓冲液恢复至原体 积,以0.1%叠氮钠防腐. 1.2.9玻片法免疫胶乳特异性凝集试验 将20株待测菌株,37?恒温过夜培养于LB琼脂平 板,在无菌室用灭菌的接种环收集菌体于生理盐水中, 高压杀菌后制成待测抗原.在黑色玻璃板上滴加一滴胶 乳抗体和少量待测抗原,混匀,5min后观察结果.胶 乳颗粒出现凝集,四周形成一白色边框者为阳性,不 凝集,呈白色均匀浑浊的为阴性.以天然STX1抗原的 凝集试验作为阳性对照. 2结果与分析 2.1此1A基片段的PCR扩增 以大肠杆菌O157菌株94H的全细胞DNA为摸板, 利用TaKaRaExtaq高保真DNA聚合酶扩增,PCR产物 于1.0%琼脂糖凝胶进行电泳,结果见图1.在约0.8kb 处出现预期的目的DNA片段. M:DL.2000Marker;1,3,4:空白对照:2;stx1A基因PCR扩 增产物. 图1大肠杆菌O157stxlA基因PCR扩增的琼脂糖电泳结果 Fig.1TheresultofstxlAgenePCRamplified 2.2重组质粒的酶切及PCR鉴定 将扩增的stxlDNA片段与T载体连接后转化受体菌 JM109,提取重组质粒并命名为pMD18T—stxlA,进行 酶切及PCR扩增检测,再进行琼脂糖凝胶电泳,约在 O.8kb处可见酶切片段及PCR片段.表明我们已经克隆 出stx1毒素A亚基基因. 2-3stxlA基因原核表达质粒的酶切及PCR鉴定 将1ADNA片段从pMD18T—1A质粒酶切后, 进一步克隆到原核表达质粒PET28a,得到重组质粒 pET28a一?c1A,为了鉴定所得到的重组原核表达质粒是 否含有目的基因片段,对其进行了酶切和PCR扩增产物 鉴定.经BamHI和NcoT酶切电泳后,出现了0.8kb 的DNA带,PCR扩增产物电泳后也出现约0.8kb的电泳 带(图2),与预期的基因片段大小相符. MDL.2000Marker:1,3,4:BamHI和NcoI双酶切产物;2: PCR扩增产物 图2重组质粒pET28a-stxlA的酶切及PCR产物琼脂糖 凝胶电泳的结果 Fig.2IdentificationofrecombinantplasmidpET28a—stxlAby restrictionenzymesandPCR 2.4SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE) 用经鉴定的含有重组质粒pET28a—肛1A的大肠杆菌 BL21做表达试验,如图3所示,经lmmol/L的IPTG诱 导后表达菌的裂解产物与对照菌相比出现了一条新的蛋 白质条带,其大小约为32000D,出现了预期的结果. 97400 66200 43O00 31O00 201oo l44o0 M:低分子量标准蛋白 质(Da):1,2:含 pEI28a-stx1A~BL21菌 株表达产物;3:大肠 杆菌BL21裂解物 图3重组质粒pET28a-stxlA的表达产物的SDS—PAGE电泳结果 Fig.3SDS-PAGEofexpressionproductofpET-28a'stxlA 2.5重组质粒pET28a—"1A表达蛋白的含量测定 将图4所示的SDS—PAGE凝胶电泳,经CS.9000型 322006,VoL27,No.※基 薄层蛋白扫描仪(日本岛津)进行蛋白薄层扫描,测定其 560nm波长下的吸收值.薄层扫描结果表明:pET28a- 舡1A重组质粒经lmmol/L的IPTG诱导后表达蛋白带密 度积分占总蛋白量的47.55%,44.11%,37.21%(图4). 图中最高峰带所包含的区域为目的蛋白含量. A B C A,B,C分别表达蛋白带密度积分占总蛋白量的47.55%,44.11%, 37.21% 图4pET28a-stxlA表达蛋白IPTG诱导的薄层扫描结果 Fig.4ThescanningresultsofexpressionofpET28a-stxlA 2.6重组STX1A表达产物的Western.blotting检测结果 将纯化的重组STXIA,提取的天然STX1和空白对 照经SDS—PAGE电泳分离后,转移至PVDF膜,用兔抗 重组STX1A血清作为一抗,用辣根过氧化酶标记的羊 抗兔为二抗进行Western—blotting检测,结果纯化的重 组STXlA,提取的天然STX1均出现预期的阳性反应, 而空白对照则为阴性反应. 2.7免疫胶乳凝集试验 胶乳抗体与2O株细菌STX抗原做了凝集反应试验, 胶乳颗粒出现凝集,四周形成,白色边框者为阳性,不 凝集,呈白色均匀浑浊的为阴性.胶乳抗体与6株stxl 基因阳性的大肠杆菌0157菌株均呈阳性反应,而与其 它14株非O157大肠杆菌,沙门氏菌,志贺氏菌,耶 尔森氏菌和李氏杆菌均不发生凝集(见表1). 表1免疫胶乳特异性凝集试验 TabletThestrainsandresultoflatexagglutinationtest 菌株血清型STXIA抗血清胶乳玻片凝集试验 Ecoli96【x】10157:H7 Ecolf96oo9O157:NM Ecoli97O63O157:I47 Ecoli97O94O157:H7 Ecolf9684O157:H7 E.colf94I-1O157:1-17 Ecoli97O42O8 EcolfH1O4O70l78:Hl1 EcolfE6008O6:H16 EcoliE35990 EcoliE2348/690127:H6 E.coliE58593O92:H32 EcoliE59149O92:H33 /aenterocolitica Ye,Japseudotuberculosis isellaflexneri l~'steriamonocytogenes Salmonellatyphi 注:+:凝集反应阳性;.:凝集反应阴性. 3讨论 大肠杆菌是寄居肠道的优势菌群之一,大多数对人 体无害,但是如果大肠杆菌侵入其它组织和血液,就 可引起化脓性炎症或败血症.1977年Kanowalchuk等首 次提出,某些大肠杆菌能引起人类出血性腹泻.1982年 美国俄勒冈和密执安州分别发生了一起出血性肠炎的爆 发流行,并从一名患者粪便中分离出大肠杆菌O157: H7.1985年Kamali认为溶血性尿毒综合症(hemolytic uremiasyndrome,HUS)的发生与该菌株有关.1983年 Riley等指出出血性结肠炎(hemorrhagiccolitis,HC)是 由此种新发现的致病性大肠杆菌O157:H7引起,并将该 菌命名为肠道出血性大肠杆菌(enterohemorrhagicE.coli. EHEC).Kanowalchuk等发现EHEC可产生一种细胞毒 素,对Vero细胞有毒性,称之为Vero毒素,Vero毒 素又称为志贺毒素(STX).STX毒素作为大肠杆菌O157 的主要毒性因子,对该菌的致病作用发挥重要的作用, 凶此,对STX的检测是确认大肠杆菌O157菌株是否产 生毒索及是否具有致病作用的重要指标,国外已有商业 化出售的检测STX的试剂盒f61,并在研究和检验中得到 了使用『71.本研究首先克隆了国内分离株stxl毒素A亚 基基冈,经测序发现其核苷酸序与大肠杆菌O157933W stxlA核昔酸序列的同源性达98%以上,说明该基因在 菌群中比较保守. 在本次实验中,通过构建重组质粒和进行表达研 究,发现重组质粒pET28a.stx1A经IPTG诱导后,经 一 A, ,, \一 -1一一 v, ※20D6.f.27,No.133 流变法在食用高分子复配增效鉴别中的 适用性研究 周家华 (广东工业大学轻化工学院,广东广州510090) 摘要:本文研究了表观粘度法作为食用高分子复配增效作用鉴别判据的适用性.常 用的判据有简单的浓度加和 法和粘度加和法.当二元体系的浓度指数都大于1时,粘度加和法得到的结果小于 浓度加和法.当二元体系的浓 度指数都小于1时,粘度加和法得到的结果大于浓度加和法.当二元体系的浓度指 数一个大于1,一个小于1时, 粘度加和法的结果在一定浓度范围大于浓度加和法,在其他浓度范围内小于浓度 加和法.当二元体系的浓度指数都 等于1时,浓度加和法和粘度加和法的结果一致. 关键词:表观粘度:复酉己;增效 TheApplicabilityofApparentViscosityintheInvestigationofSynergisticInteractionbetwe enBiopolymers ZHoUJiahua (FacultyofChemicalEngineeringandLightIndustry,GuangdongUniversityofTechnology , Guangzhou510090,China) Abstract:Theapplicabilityofapparentviscosityintheinvestigationofsynergisticinteractio nbetweentwodifferentpolymers 收稿日期:2005.03.15 基金项}j:国家自然科学基金资助项目(20106004);国家留学基金委资助项目 作者简介:周家华(1968.),男,教授,博士,主要从事食用高分子和可降解材料研究. SDS.PAGE电泳证明,STX1A蛋白是以包涵体的形式表 达的,大小约为32000D,与理论分子量大小相符 另外,我们合成了表面带有活性基团的羧化聚苯乙 烯胶乳,采用多肽偶联技术,使羧化聚苯乙烯胶乳表 面的羧基与抗血清中蛋白质的氨基共价交联,制成免疫 微球.这种免疫微球由于蛋白质和胶乳是共价结合,克 服了物理吸附法制各免疫微球的缺点,因此,提高了 实验的重复性和免疫微球的稳定性.此外,胶乳同血 清结合之前,通过加入e.氨基己酸,增加了胶乳颗粒 的有效表面积,减少了交联时蛋白质的空间位阻,从 而提高了实验的敏感性. 本试验建立的用胶乳凝集试验检测STX产生的免疫学 方法具有操作简单,特异,敏感的特点,可望用于临床, 食品中大肠杆菌O157的检测.STX1A基因的克隆和表达 也为今后预防大肠杆菌O157感染菌苗的开发提供依据. 参考文献: [2】 【3】 [4】 【5】 RileyLW,RemisRS,HelgersonSD.Hemorragiccolitisassoci- atedwitharareEscherichiacolisetotype[J].NEnglJMed,1983, 308:681. 周志江.黄上嫒.郑明光.从长春地区牛肉和猪肉中检出产Vero毒 素大肠杆菌O157:H7[J].中国兽医.2000,2O(2):152—155. .中 周志江.郑明光,郑昊.应用PCR检测产Veto毒素大肠杆菌[J】 国兽医.1998,18(4):342—345. 周志江.黄上嫒.郑明光.用PCR鉴定大肠杆菌O157:H7[J].中国兽 医.1999.l9(3):248-250. CernyG.TeuberM.Differentialreleaseofperiplamicversuscytoplasmic enzymesfromEscherichiacolibypolymyxinB【JJ.ArchMiembiol, 1971,78:166-179. 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