一种新型基因传输载体-磷酸钙纳米颗粒用于肿瘤基因治疗的研究

一种新型基因传输载体-磷酸钙纳米颗粒用于肿瘤基因治疗的研究 一种新型基因传输载体-磷酸钙纳米颗粒用 于肿瘤基因治疗的研究 第l5卷第l8期 2005年9月 中国现代医学杂志 ChinaJournalofModernMedicine Vo1.15No.18 Sep.2005 文章编号:1005—8982(2005)18—2754—06 一 种新型基因传输载体一磷酸钙纳米颗粒 用于肿瘤基因治疗的研究 杨菊云,,刘霆,,陈玉祥z,张俊仪,,赵颜忠,文淑萍,杨宜华 (1.中南大学湘雅医院,湖南长沙410078;2.中南大学生物科学与技术学院, 湖南长沙410013;3.中南大学湘雅医院耳鼻喉科,湖南长沙410078) ? 论着? 摘要:目的研究新型非病毒栽体磷酸钙纳米颗粒的生物学特性,评估其在肿瘤基因治疗中应用的前景. 方法化学方法制备,氯化钙修饰纳米颗粒,用琼脂糖凝胶电泳 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 磷酸钙纳米颗粒与DNA的结合效率及对 DNA的保护作用,用绿色荧光蛋白基因作报告基因,将磷酸钙纳米颗粒为基因栽体转染鼻咽癌(CNE-2)细胞 和在动物体内转染肿瘤细胞;以及将磷酸钙纳米与自杀基因yCDglyTK结合,并在体外对鼻咽癌进行基因治 疗.结果电镜观察证实磷酸钙纳米颗粒进入细胞内,磷酸钙纳米颗粒与DNA结合后,能对DNA起保护作 用;磷酸钙纳米颗粒作为基因转染的栽体,将绿色荧光蛋白基因导入CNE-2细胞, 用荧光显微镜观察到高水 平的绿色荧光蛋白 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达;体内转染结果显示,纳米介导的基因在肿瘤组织中有很好 的表达;以磷酸钙纳米为栽体 介导自杀基因yCDglyrTK在体外治疗鼻咽癌的实验中显示,在加入5-Fc后大量的 CNE-2细胞出现死亡.结 论磷酸钙纳米颗粒具有优良的生物学特性,是有应用前景的基因转染和基因治疗 栽体之一. 关键词:磷酸钙纳米颗粒;自杀基因;基因治疗;非病毒栽体 中图分类号:Q782文献标识码:A Calciumphosphatenanoparticlesasanovel nonviralvectorincancergenetherapy YANGJu—yun,LIUTing,CHENYu—xiang2,ZHANGJun-yi., ZHAOYan-zhong2,WENShu-ping~,YANGYi-hua2 f1.XiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha,Hunan410078,P.R.China;2.Schoolof BiosciencesandTechnologies,CentralSouthUniversity,Changsha,Hunan410013,P.R.China; 3.XiangyaHospital,CentralSouthUnive~ity,Changsha,Hunan410078,P.R.China) Abstract:【Objective】 Tostudythebiologicalcharacteristicsofcalciumphosphatenanoparticlesandevaluate thepromisingincancergenethempy.【Methods】 Calciumchloridemodifiednanoparticlespreparedbymeansof chemistry.AnalysethecombinationofcalciumphosphatenanoparticlesandDNA,theprotectiontoDNAaswellby gelosegelatinelectrophoresis.Whenthegreenfluorescenceproteingenewasregardedasreportgene,genevectorof calciumphosphatenanoparticlestransfectedCNE-2cellinvitroandvivo.Combinethecalciumphosphatenanopar- ticlesandsuicidegeneyCDglyTKforNasopharyngealCarcinoma(NPC)thempyinvitro. 【Results】Calciumphos- phatenanoparticleswentintocellandcouldprotectDNAafteritscombinationwithDNAbyelectro-microscopy. Regardcalciumphosphatenanoparticlesasvectorofgenetransfection,transductgreenfluorescenceproteingenein- toCNE一 2cell,thegreenfluorescenceproteinhighexpressionCanbeseenbyfluorescencemicresopy.Theresultsof transfectloninvivoshowedthatgeneintroducedbynanoparticleshadagoodexpressionintumortissue.Theresults oftransductingsuicidegeneyCD~yTKbycalciumphosphatenanoparticlesforNasopharyngealCarcinoma(NPC) thempyinvitroindicatedthatlargenumbersofCNE一 2cellsweredeadaftertheadditionof5-FC.【Conclusion】 收稿日期:2005-07-03 【通讯作者】陈玉祥教授,中南大学生物科学与技术学院,410013,E— maihcyx58@hotmail.comL:073l__480857lFax:0731—2630230 第18期杨菊云,等:一种新型基因传输载体一磷酸钙纳米颗粒用于肿瘤基因治疗 的研究 Calciumphosphatenanoparticleshasgreatbiologicalcharacteristicsanditisoneofpromisingvectorsofgenetrans— fectionandgenetherapy. Keywords:calciumphosphatenanoparticles;suicidegene;genetherapy;nonviralvector 提高DNA的转化效率是基因治疗的关键.传统F一68(pluronic),氯化钙,磷酸氢二 钠,柠檬酸钠,琼 的DNA传递系统分为病毒载体和非病毒载体介导脂糖,购自Sigma公司;小牛血 清为杭州四季青公司 系统,病毒载体主要包括腺病毒1,逆转录病毒,腺产品;绿色荧光蛋白购自Bio— Rad公司;自杀基因 相关病毒等;逆转录病毒载体能将外源基因稳定的yCDglyTK为本室构建,其它试剂均为市购;CNE一2 插入靶细胞的染色体中,且感染效率较高,但是传统细胞株购自中山医科大学动物中心.水,自制纯水 的逆转录病毒载体没有组织的特异性,只能感染处符合中国药典2000年版注射用水项下的要求. 于分裂期的细胞,且滴度低;腺病毒载体虽然也有着1_2方法 较高的转染效率,能插入较大的约30Kb的基因片1.2.1磷酸钙纳米颗粒的制备将适当比例的0.05 段,但是腺病毒的免疫原性比较强,注射到机体后很摩尔氯化钙,I%SDS,1%F一68混合,室温反应并搅 快会被机体的免疫系统排斥,如当静脉注射高浓度拌(300r/min)24h,形成液体A,同时将适当比例的 的腺病毒载体时会使肝脏发生严重的炎症反应;腺0.025摩尔磷酸氢二钠,柠檬酸钠,I%SDS,1%F一68 相关病毒虽然有较好的安全性,免疫原性低,但是外混合,室温反应并搅拌24h(300r/rain),形成液体B, 原基因容量小,制备复杂,滴度也不高.因此,非病24h后将B液以每小时10mL的速度滴人到A液 毒载体如脂质体,阳离子聚合物,纳米等在目前得到中并以350r/min速度搅拌,温度控制为35cc.72h 广泛的研究,在众多的非病毒载体系统中,纳米颗粒后反应产物15000r/min,离心15rain,用乙醇洗脱, 由于具有小尺寸效应,表面效应等优势在基因治疗真空抽干后,取纳米颗粒,用去离子水溶解,超声分 中最有应用前景[51.研究表明,纳米颗粒在体内的循散2h,高压蒸汽灭菌.对制备的磷酸钙纳米颗粒混 环时问明显长于普通大小的颗粒,在短时间内,不悬液进行颗粒形态,大小,均匀度 考察和对其表面进 会很快被吞噬细胞清除,从而更多的渗出到血管外,行Zeta电位检测,并按中国生物制品规程(2000年 组织间隙,延长与细胞的接触时问,提高转染效率;版)项下进行无菌试验和内毒素检查,全面考察制 通常质粒DNA进入血管后很快被核酸酶消化降解,备工艺. 但纳米基因载体有浓缩,保护DNA功能,与DNA形1.2.2磷酸钙纳米颗粒一DNA复合体的合成分 成一致密的结构,使DNA不被核酸酶消化降解【8.9】.别取15,10和5g的磷酸钙纳米颗粒悬液与1g DANLUO等利用硅颗粒与脂质体混合后与DNA的DNA混合后,加入30L的0.05MCaC1溶液, 一 起转染细胞,发现其转染效率比单纯用脂质体转室温25min,离心(eppendorfCentrifuge5415R离 染要高8倍[1ol,CARSTENKNEUER等用二价阳离心机)10min,将上清琼脂糖凝胶电泳检测. 子修饰硅纳米颗粒表面后,发现能与DNA结合,并1.2.3磷酸钙纳米颗粒对DNA的保护实验将磷 且发现结合在颗粒上的DNA能抵抗DNase的作用酸钙纳米80g用CaC1修饰后与4gDNA结 …1 .我们 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 使用一定浓度的磷酸钙纳米颗粒通过合,室温20min,放血清中37cc,12h后10000rpm 氯化钙修饰后与DNA结合,在保持DNA完整性的for10min,沉淀用洗脱液(20mm.L门LT.clDH 情况下,制成DNA一磷酸钙纳米颗粒复合体,并进7.4,1mm01/LEDTA,100mm0L , 门LNaC1;50%的乙醇 行体内,外转染实验,通过复合体吸附在细胞膜上并保存于室温)洗脱3次后,用 TE(pH10)重悬,45cc 进入细胞内,增加进入细胞内DNA量,提高基因转温育3min,将DNA从磷酸钙纳米颗粒上洗脱下来, 染的效率.并研究了以磷酸钙纳米为载体介导自杀离心后,将上清琼脂糖凝胶电泳检测;同时将寡 基因yCDglyTK在鼻咽癌的体外治疗中的应用,对DNA4g放人10%/b牛血清/DMEM,10%胎牛血 其生物安全性,细胞的毒性反应进行了研究.清/DMEM,37cc12h,产物琼脂糖凝胶电泳. 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法1.2.4磷酸钙纳米颗粒一DNA复合体体外转染细 胞买验将CNE一2细胞,HT1080细胞按2×l0s接 .'.科种于6孔板中,24h后,用1XDMEM洗脱1次,纳 十二烷基硫酸纳(SDS),购自Biomol公司,米颗粒一DNA复合体用CaC1修饰后,按每一孔转 中国现代医学杂志第l5卷 染绿色荧光蛋白基因PEGFP-N1表达质粒DNA 1g,8h更换10%的小牛血清培养,48h后荧光显 微镜下观察结果,同时以脂质体为对照转染细胞. 1.2.5磷酸钙纳米颗粒一DNA复合体体内转染实 验BALB/C裸鼠(年龄4—6周,20g,雌性),购 自上海试验动物中心.将CNE一2细胞消化,收集,记 数,用PBS稀释并以1×106细胞/200LPBS的数 量注射到裸鼠的右侧腋下.肿瘤体积的测定采用公 式:肿瘤体积=长径×短径2/2.当肿瘤体积达到约 350450mm3时,将肿瘤的裸鼠随机分为3组,每组 5只;实验组用磷酸钙纳米与报告基因GFP结合 (150l-rg:15Ia,g)的复合体直接瘤内注射,对照组用 GFP(15,磷酸钙纳米分别直接瘤内注射,隔3d 一 次,共两次.在最后1次注射的48h后,断颈处死 各组裸鼠,剥离肿瘤并行RT—PCR检测.RT—PCR过 程包括:总RNA用Trizol试剂(GIBCO)抽提,逆转 录采用AMV逆转录试剂盒(promega),用引物rt— GFP1(CgA,ATT,CTg,CAg,TCg,ACg,gTA);tGFP2(CAT, Yl'g,CCg,gTg,TTC,AAg,TC)扩增GFP的cDNA序列, 用引物B-actin1gg,gTC,AgA,Agg,ACT,CCT,ATg), B-actin2(CAg,gCA,gCT,CAT,AgC,TCT,TC扩增人的 B—actin基因做内对照. 1.2.6磷酸钙纳米颗粒的细胞毒性实验(MTT) 用0.25%胰蛋白酶分别消化单层培养的CNE一2细 胞,COS一7细胞,用含10%胎牛血清的DMEM培养 基制备成单细胞悬液,以每孔5×103个细胞接种于 96孔培养板中,每孔体积200L,37oC,5%及饱和 湿度条件下培养.24h后,在细胞板孔内分别加人 磷酸钙纳米悬液(25g/mE),纳米一yCDglyTK复 合物(25g/mL:10咖L),0.05摩尔的氯化钙 (30L),以脂质体(25咖L)为阳性对照,质粒 yCDglyTK(10咖L)为阴性对照,继续培养;72h 后,每孔加人M1丫r溶液(20m咖L)20L,37?继 续孵育4h,终止培养,吸出孔内培养上清液,每孔加 人150Ia,LDMSO,振荡10min,使结晶物充分溶解 后,选择490Bin波长,在酶联免疫检测仪上测定各 孔光吸收值,与试验孔平行设不加细胞只加培养液 的空白对照孔调零.细胞存活率(%)用公式{0D490 (样品)/0D490(对照)lx100 1.2.7以磷酸钙纳米为载体介导自杀基因yCDg— IyTK治疗鼻咽癌实验CNE一2,鼻咽癌低分化细胞 系,来自中山医科大学试验动物中心,用含10%的 新生牛血清的RMPI1640培养基(GIBCO)培养,加 100IU/mL青霉素和100mg/~L链霉素抗菌.将 CNE一2细胞接种培养于160rain的皿中,待细胞在 皿中生长汇合率达70%时加人磷酸钙纳米一 yCDglyTK复合体(100itg:5g),48h后在皿中 加人抗生素G418(600~g/m1)继续培养.15h后,经 G418筛选的细胞,Neomycin基因抗性克隆形成,挑 到12孔板中,当12孔板中细胞汇合度达80% 90%,抽提各孔细胞中的总RNA,做RT—PCR鉴定 yCDglyTK在各单克隆细胞中的表达(所用引物 rtCDglyTK1(ggg,AgA,TTA,gAg,ggC,AAA,gTg,T)和 rtCDglyTK2(ACg,gCG,TCg,gTC,ACg,gCA,TAA)扩增 yCDglyTK的mRNA,以B—actin基因做内对照),然 后筛选出表达yCDglyTK的阳性克隆,并在G418 f300trg/mL)条件下维持培养. 将CNE一2细胞和yCDglyTK阳性CNE一2细胞 移植于96孔板(5000细胞,孔),当细胞汇合度达 到90%95%t~.实验分为四组,分别是yCDglyTK 阳性CNE一2细胞组,脂质体一yCDglyTK复合体加 入到CNE一2细胞组,纳米一yCDglyTK复合体加人 到CNE一2细胞组和CNE一2细胞组.脂质体0ipo— fectamineTM2000,Invitrogen)以0.5L/孔和 yCDglyTK质粒0.2L/孔的剂量将其总量混合在 一 起,室温下20min,然后加人到不含血清的细胞培 养基中.4h后,细胞上清换成新鲜的含10%的正常 培养基.在将复合体加人到CNE一2细胞24h后, 5-FC(200Ia,g/mL)~J1人96孔板中,继续培养5d后, 用MTT法(如上所述)分析96孔板各孔中细胞的 存活率. 2结果 2.1磷酸钙纳米颗粒的制备 将制备的磷酸钙纳米颗粒(自制):在电镜下观 察见分散较均匀,针状大小在23.531.4Bin的颗 粒.见图la,1b,图2,连续10批样品的形态,大小, 均匀度检查无明显的差异,无细菌污染,内毒素符合 生物制品规程的要求;zeta电位检测显示经氯化钙 修饰的磷酸钙纳米颗粒其表面所带电荷为16.8mv. 见图3. 2.2磷酸钙纳米颗粒与DNA的结合实验 实验中将15,10和5g的磷酸钙纳米颗粒悬 液与1g的DNA混合后,加人30L的0.05M CaCI溶液修饰,离心后,将上清用0.8%的琼脂糖凝 胶电泳检测.结果如图4显示:当两者比例为5g: 第18期杨菊云,等:,种新型基因传输载体,磷酸钙纳米颗粒用于肿瘤基因治疗 的研究 l13.g时,离心后的反应液发现有大量的DNA,表明 DNA与磷酸钙纳米颗粒结合的量很少;当两者比例 为l513.g:113.g混合作用室温15min,离心后的反应 液未发现有DNA,表明DNA已完全与磷酸钙纳米 颗粒结合;当两者比例为(3)1013.g:113.g时,离心 后的反应液发现有微量的DNA,表明DNA没有完 全与磷酸钙纳米颗粒结合;为单纯质粒为对照: plasmidpEGFP. . 季辫》''疑,.'?_ ?一 | , , ' ::r亡0难一r, . a 一?I—__一亩l?-—翻嘲 I上bIIIIIII-{ ,r一 . ' h _ _ _ 1,一.^一, 图2zetasizeDELSA-400检测磷酸钙纳米粒径大部分在 23.5nm和31.4nm之间 图3Zeta电位仪检测磷酸钙纳米表面带有正电荷为 +16.8mv 图41:磷酸钙纳米与DNA的比例为5ug:1ug;2:磷酸 钙纳米与DNA的比例为15ug:1ug;3:磷酸钙纳米与 DNA的比例为10ug:1ug;4:对照plasmidpEGFP 2.3磷酸钙纳米颗粒对DNA的保护实验 的质粒DNA与血清在37%条件下反应8h发现, DNA已被完全降解;而DNA在与磷酸钙纳米颗粒 结合后,与血清在37%的条件反应8h,产物琼脂糖 胶电泳结果显示DNA条带大小与对照DNA一样, 没有拖尾,表明磷酸钙颗粒在与DNA结合后,能保 护DNA不被血清中有效成份降解.图5示:1. Marker;2.单纯的pEGFP—Nl质粒DNA作对照;3. pEGFP—N1质粒DNA与10%的胎牛血清/DMEM作 用后,有部分的DNA被降解;4.质粒DNA与10%的 小牛血清/DMEM作用后,有部分的DNA被降解;5. 质粒DNA和磷酸钙颗粒形成复合体后与胎牛血清 作用,经过离心处理,rITE重悬后发现,DNA没有被 降解. 图51.Marker;2.单纯的pEGFP-N1质粒DNA作对照:3. pEGFP—N1质粒DNA与1O%的胎牛血清/DMEM作用后. 有部分的DNA被降解;4.质粒DNA与10%的小牛血清 /DMEM作用后.有部分的DNA被降解;5.质粒DNA和磷酸 钙颗粒形成复合体后与胎牛血清作用.经过离心处理.TE重 悬后发现.DNA没有被降解 2.4磷酸钙纳米颗粒体外转染实验 用磷酸钙纳米颗粒一DNA复合体转染CNE一2 细胞,48h后在荧光显微镜下观察到发绿色荧光的 细胞,在20x的视野下观察及照相,并计数转染效 率,当磷酸钙纳米颗粒与质粒DNA成一定比例时, 磷酸钙纳米颗粒转染效率可达60%,甚至高于用脂 质体转染的效率.见图6a,图6b. ??图6a.磷酸钙颗粒一DNA复合体转染的CNE一2细胞 (pEGFP—DNA1ug.磷酸钙纳米颗粒3OuL),在(20×) 的荧光显微镜下摄片.b.示用脂质体转染CNE一2细胞 (pEGFP-DNA1ug,1OuL脂质体),在(20X)的荧光显 微镜下摄片 2.5磷酸钙纳米体内转染实验 血清中存在大量的可降解DNA的成份,将单纯磷酸钙纳米颗粒一DNA复合体体 内转染鼻咽 ? 2757? }?m-I 一, +一. 一 中国现代医学杂志第15卷 癌肿瘤动物模型,转染1周后,断颈处死各组裸鼠, 剥离肿瘤并行RT—PCR检测,结果发现以纳米为载 体转染的肿瘤组织中基因有很好的表达,而对照组 中GFP没有表达,如图7示:1.为13一actin对照;2. 空白对照;3.磷酸钙纳米瘤内直接注射;4,5.磷酸钙 纳米颗粒一DNA复合体瘤内直接注射的RT—PCR 结果,发现肿瘤组织中有基因的表达;6,7.裸DNA 瘤内直接注射的RT—PCR结果,发现肿瘤组织中没 有基因的表达;8.Marker. 12345678 图71.为9一actin对照;2.空白对照,3.磷酸钙纳米瘤内直 接注射:4,5.磷酸钙纳米颗粒一DNA复合体瘤内直接注射的 RT-PCR结果.发现肿瘤组织中有基因的表达;6,7.裸DNA 瘤内直接注射的RT—PCR结果.发现肿瘤组织中没有基因 的表达:8.Marker 2.6磷酸钙纳米颗粒细胞毒性实验结果 Mr兀'实验结果显示,CPNP对细胞没有明显的 毒性,而脂质体对照组有一定的细胞毒性,见图8. ' 善啪呻t~EIqE-2Cell+t.了h时td训t?s?出 图8结果显示,CPNP对细胞没有明显的毒性,而脂质体对 照组有一定的细胞毒性 2.7磷酸钙纳米颗粒为载体介导自杀基因治疗鼻 咽癌实验结果 以纳米介导自杀基因yCDglyTK转染CNE一2细 胞后,在加入前药5一Fc后发现,经纳米筛选的阳性 克隆组有92.O%的细胞被杀死,对照脂质体介导 yCDglyTK组有76.5%的细胞死亡,纳米介导yCDg— IyTK组有65.24%的细胞死亡,而没用任何转染的 CNE一2组在加入前药5一Fc后没有出现细胞死亡. 见图9. l2O l? ,8O 簧 : 王帅 E 葺 柏 主20 0 ?删, IlllJlt~ttttltsm.^ CH2研nTr~rt4_曲T+Ir+tJtg~t1.~-pro<ling,r? 图9纳米筛选的阳性克隆组有8%的细胞存活,对照脂质 体介导yCDglyTK组有23.5%的细胞存活,纳米介导yCDg- lyTK组有24.76%的细胞存活,而没用任何转染的CNE-2 组在加入前药5-FC后没有出现细胞死亡 3讨论 如何选择合适的载体,使目的基因方便,有效的 表达,是基因治疗成功的关键的因素之一【,目前使 用病毒载体的种类较多,非病毒基因载体因具有无 免疫原性,使用简便,适于大量扩增的优势已经成为 基因治疗研究中的热点问题【,目前常用的非病毒 载体有脂质体,可生物降解材料及多聚阳离子聚合 物等.多聚赖氨酸,二氧化硅,磷酸钙沉淀方法等M 这些方法主要依靠的是二价金属阳离子如ca, M,Mn等,它们与DNA的螺旋磷酸盐或酯结构 形成离子复合物,磷酸钙能与核苷酸骨架形成复合 物,从而有使DNA结构保持稳定的功能,形成这中 复合物经细胞内吞介导借助于离子通道而穿越细胞 膜.尽管磷酸钙沉淀转染方法简便,有效,但是磷酸 钙一DNA共沉淀方法转染效率较低,影响参数较 多,需要熟练掌握操作技术和严格控制溶液的PH, 且对质粒DNA的质量要求极高,质粒溶液中不能含 有杂蛋白及RNA,随着科学不断发展,人们从微观 水平认识到一些纳米材料的生物学活性,当物质小 到纳米级后,就会表现出小颗粒的特性,其颗粒的表 面能和表面张力都相应的增加,表面周围的一些粒 子由于缺少与响应的原子结合,留有许多空位键,具 有不饱和性质,易于其他原子相结合,形成稳定状 阍 .研究表明,纳米颗粒在体内的循环时间明显长 于普通大小的颗粒,在短时问内,不会很快被吞噬细 胞清除,从而更多的渗出到血管外,组织间隙,延长与 细胞接触的时间.提高转染效率【玎.18】. 实验中未经修饰的磷酸钙纳米颗粒与DNA结 合的比例较低,用氯化钙对磷酸钙纳米颗粒的表面 进行修饰,在合适的PH值下,与带负电荷的DNA 结合.同时实验 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 纳米颗粒与DNA结合后能保 ?扎 P鸯??膏毒仁2曩 第18期杨菊云,等:一种新型基因传输载体一磷酸钙纳米颗粒用于肿瘤基因治疗 的研究 护DNA不被降解,这对于体内,细胞内多酶环境具 有重要的意义.磷酸钙纳米体外转染实验结果显示, 在一定比例的纳米颗粒与DNA条件下,可使DNA 的转染效率达到很高(60%),甚至高于目前普遍使 用的脂质体.将纳米与报告基因结合在动物体内转 染实验结果表明,基因在组织内有很好的表达,而对 照组在组织内没有表达. 肿瘤自杀基因治疗是近年来随着分子生物学及 基因工程技术发展起来的一种治疗方法【嘲,其本质 上是一种瘤内化疗,通过将特定基因(自杀基因)转 染肿瘤细胞后,使无毒的前药在细胞内转化为细胞 毒性药物,从而直接或通过旁观者效应杀伤肿瘤细 胞.在所研究的众多自杀基因中,CDglyTK融合自杀 基因前药系统是目前研究较为深入的一个系统,其 作用是将5-FC及GCV两种无毒前药转换为细胞 毒性药物从而达到杀伤肿瘤细胞的目的.以纳米为 载体介导自杀基因在体外治疗鼻咽癌的实验中,纳 米筛选的阳性克隆组有92.0%的细胞被杀死,对照 脂质体介导yCDglyTK组有76.5%的细胞死亡,纳米 介导yCDglyTK组有65.24%的细胞死亡,而没用任 何转染的CNE一2组在加入前药5-FC后没有出现 细胞死亡,从而显示磷酸钙纳米在基因治疗中有很 好的应用前景;以该纳米为载体,在动物体内进行基 因治疗,将是笔者下一步研究的目标. 参考文献: [1】BOYCE,FM,BUCHERNL.Baeulovirusmediatedgenetransfer intomammaliancells:Proc.Nail.Aoad.Sci.USA,1996, 93: 2348—2352. 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