血液制品中人细小病毒污染及其灭活进展

【综述】血液制品中人细小病毒污染及其灭活进展 王敏 侯继锋 【摘 要 】人细小病毒感染率高，献浆员中阳性捐献者的病毒载量很高，导致病毒对原料血浆污染率高，血液制品生产工艺中现有的病毒灭活方法不能将细小病毒有效的灭活，因此存在潜在传播病毒的风险。对血液制品中病毒，尤其是无包膜病毒的有效去除/灭活迫在眉睫。用紫外线对病毒灭活处理由来已久，一种新的短波紫外灭活方法对无包膜病毒灭活效果好，血液制品蛋白回收率高，具有好的研究应用前景。 【关键词】人细小病毒B19；感染率；血液制品；病毒灭活；紫外灭活 Contamination of human parvovirus B19 in plasma-derived medicinal products and its inactivated progress WANG Min, HOU Ji - fen Objective: The infection frequency of human parvovirus B19 is high in general population, and in the plasma donors, this resulting in the high viral load in source plasma. At the same time, human parvovirus B19 can not be inactivated or removed effectively by the existing manufacturing processes, therefore there are potential risk of transmission after administing some blood products. It is imminent to explore a new way to due with the virus especially the uncoated virus in blood products. It is a long time history of using ultraviolet radiation to keep sterilization, and recent research has found that shortwave ultraviolet has a perfectly good effection on uncoated virus inactivation, meanwhile rarely damage the protein of products. The author suppose the new way has a bright prospect.    Key word: human parvovirus B19; infection rates; blood products; virus inactivation; ultraviolet inactivation 血液制品的独特疗效和安全性关系到人民的生命健康，原料血浆的病毒安全性控制是血液制品（血浆蛋白衍生物）的安全与质量控制的关键，世界各国药品监管机构都非常关注这一问题。可经血/血液制品传播的病毒有甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、人类细小病毒(B19) ,巨细胞病毒(CMV)以及人类朊病毒[1]。现阶段，国内外普遍采用原料血浆病原体筛查、原料血浆检疫期管理和血浆蛋白分离过程中增加病毒灭活/去除工艺等不同手段，进行病毒安全性控制，以最大限度降低血液制品病原体污染的风险。另外各种病原体核酸扩增检测技术从生产源头起作用，以灵敏度高和特异性强的特点成为迄今为止最灵敏的病毒检测方法，已经广泛用于原料血浆的病原体早期筛查。该方法显著降低了HIV、HCV和HBV的血清学检测的窗口期,HIV可以减少10-11天、HCV可以减少57-59天、HBV可以减少30天，从而显著降低经血液传播的病毒污染血液制品的风险[2]。 1.人细小病毒B19 人细小病毒B19(human parvovirus B19,简称B19)，最早由Cossart于1975年在筛选献血员乙型肝炎抗原时发现，是已知唯一对人类致病的细小病毒[3]，病毒无包膜、耐热，直径小(18～20 nm)，基因组为线性单链DNA分子，约5.5kb，分子量约为50～80KD，对称二十面体[4]。 1.1 人细小病毒的流行情况 普通人群中流行情况：人细小病毒B19感染非常普遍，全年均可发生，但主要发生在晚冬和早春季节，该病毒可通过呼吸道传播,病毒血症时血液中B19 DNA可到达1012拷贝/ml[5]。大约40%～60%的成年人都曾感染过B19病毒,体内出现IgG抗体,且IgG抗体阳性率随年龄增长而增长，5岁以下儿童及20岁以上成人其阳性率分别为2%和49%，在70岁左右的人群中,80%以上的血清标本中存在抗B19 IgG抗体[6]。在国内没有相关的流行数据报道。 献浆员中流行情况：在无偿献血者中病毒血症的出现频率约1/260～1/40000，年龄段集中在35～45岁之间。其中阳性捐献者病毒血症时病毒载量为2.3×104到6.9×1011拷贝/ml(约合7.1×104到2.1×1012IU/ml)，在急性期过后的几个月，少数甚至几年后仍有低水平的B19 DNA被PCR检测到[1]。国内也有报道吉林省供血者人类细小病毒感染的流行病学情况，在184份血清中,抗B19 IgG抗体总检出率约为55.43%，且女性抗体阳性率高于男性[7]。山东鲁西地区小样本献血员与孕妇人细小病毒B19筛查结果显示，300名献血员中，有19例人细小病毒感 _______________________________ 基金项目：国家科技支撑 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 项目（No.2008BAI54B08). 作者单位：中国药品生物制品检定所（北京 100050). 通讯作者：侯继锋，E-mail:mickeywang@163.com. 染阳性，阳性率为6.33%，且献血员人细小病毒感染率和孕妇感染率比较差异不显著[8]。  1.2  B19病毒感染主要会对以下三类人群造成严重危害：孕妇，免疫力低下/缺陷的人 及儿童。在孕妇病原体感染因素方面，人细小病毒B19是除巨细胞病毒、单纯疱疹病毒、风疹病毒、弓形虫感染之外造成孕妇自然流产的重要病原体之一,反复自然流产孕妇和正常孕妇的流产组织可检测到B19 DNA。B19病毒感染还可以引起儿童的第五病，成人的风湿性关节炎，溶血贫血患者的再生障碍危象和免疫抑制患者的红细胞再生障碍等疾病[9～12]。 1.3 B19病毒对血液制品的威胁 尽管人们认为B19存活感染期短,高滴度的病毒血症只持续7到10天,然而一个感染者体内的低水平病毒量(常在10，000～100，000拷贝/ml) 可持续数月直到病毒被全清除。并且由于B19病毒直径小、耐热、对人群的易感性及目前灭活/去除血液制品中病毒的S/D法、过滤法和热处理法均不能有效的灭活/去除该病毒[13～16】，使得大多经过分离处理的血浆和终产品仍遭受污染，并常含有较高的病毒载量，使B19病毒成为血液制品的主要污染病毒之一。B19病毒DNA污染凝血因子Ⅷ、凝血酶原复合物、因子Ⅶ等血浆制品的比例分别达到86.18%、88.14%和66.11%[17]。长期接受凝血因子类产品（产品中病毒含量大于108 geq/ml时产生抗体，小于103.5 geq/ml不产生抗体）治疗的患者体内抗B19抗体显著升高[18]。大约60%的血浆池包含102到108genome copy equivalents(1gce相当于1.02+0.13 IU,international units)[19]。经S/D处理的血浆仍有23％含有B19 DNA且滴度高达106-108 geq/ ml，而混合血浆中IgG滴度约为44 IU/mL不足以中和抗原[17]。目前美国食品药品监督管理局已规定对血浆库进行B19病毒DNA检测,对于B19病毒DNA浓度超过104拷贝/ml的血浆库将废弃不予使用，如果高病毒载量的捐赠者血浆在混浆前没有被及时去除的话，将会有5%到15%的血浆池不能使用，造成严重损失[20]。 2．B19病毒不同基因型检测 目前把B19病毒分为三种基因型，基因Ⅰ型，A6和Lali（基因Ⅱ型）和最先在法国分离出的V9（基因Ⅲ型），其中基因Ⅱ型10.8%的编码蛋白序列与Ⅰ型不同[21]。在Ⅷ因子产品中，81%的感染型是基因Ⅰ型，14%的感染型是基因Ⅱ型，病毒载量分别达到107和105 geq/ml。不同基因型感染后，症状与宿主先天或后天的体质有关，与基因型无明显的相关性，但在检测方面略有不同，目前已有两种定性实时荧光PCR试剂盒在欧洲商业化用于血浆检测，Roche LC虽然灵敏度高，但不能检测出第Ⅱ基因型病毒，而ArtusB19 PCR试剂盒可检测出第Ⅱ基因型和代表Ⅲ基因型的质粒D91.1,总体来说，B19病毒变异并不多，需扩大8倍才能看出来，可被认为是一个少量变异的家族[22]。 3.血制品中B19病毒的去除/灭活 血液制品的病毒灭活方法主要有物理法和化学法。物理法中常用的热处理法有湿热法(巴斯德法)、干热法(60℃ 72 h，80℃ 72h)、蒸汽加热法（将湿润的冻干产品暴露于60℃、1119mPa的热蒸汽中进行病毒灭活10h）、纳米膜过滤等方法。化学法中较常用的有低pH法、有机溶剂/表面活性剂法(S/D法)等。 3.1 传统病毒灭活工艺：在生产白蛋白的过程中，B19病毒对液体加热敏感，但在生产静注免疫球蛋白时，B19病毒在60%蔗糖浓度下，液体灭活60℃1小时，并不敏感[23]；干热处理能有效灭活HIV和肝炎病毒，但病毒灭活效果受制品水份残留量、配方（如：蛋白质、糖、盐、氨基酸含量)以及冰冻和冻干时间的影响,同时湿度也会影响B19病毒对干热的敏感性，低湿度会加强病毒的抵抗力[19]，一般情况下,干热处理1，2和3小时后，病毒感染性分别下降1.5,2.8,3.8log，但在有蔗糖存在下，B19病毒就不能被很好的灭活，如凝血因子制备工艺研究中采用80℃、72h加热，该法能十分有效地灭活HIV和肝炎病毒，但对B19病毒无效；蒸汽加热法、S/D、低pH法对无脂包膜病毒灭活效果也不如对脂包膜病毒灭活效果好，使B19病毒成为血制品的主要污染病毒。 3.2 新的病毒灭活工艺 3.2.1 纳米膜过滤：纳米膜过滤法，与S/D法或低PH法相结合可灭活部分对热稳定的无包膜病毒。Yokoyama等[24]报道B19病毒在0.3M甘氨酸存在，pH6.2的情况下可形成聚合体，被35nm滤膜除去7.5log，而在其他氨基酸，乙酸铵或PBS中去除很少，由此推测B19的去除并不是依靠形成抗原-抗体复合物，而是甘氨酸使病毒聚合，尺寸变大，进而通过35nm的滤膜被去除。但研究发现此法应用于工业生产时膜孔径大小的稳定性不好，且高分子及高粘度制品不适合用纳米膜过滤法[2]。 3.2.2 光化学法：近年来光化学灭活法成为对病毒灭活的研究热点[25]，在需灭活的血液制品中加入化学光敏剂，光敏剂与病毒DNA相结合，在一定的光辐射剂量下，对病毒灭活达到很好的效果。然而病毒灭活后光敏剂的去除及光敏剂的潜在致畸作用仍是困扰人们的问题。目前亚甲基蓝光化学法灭活单份新鲜冰冻血浆已进入实际应用阶段[26]，但此法对无包膜病毒效果不好。 3.2.3 短波紫外线灭活：紫外线杀菌作用显著，可使DNA、RNA的碱基生成二聚体或加成物而抑制病毒复制，病毒下降滴度与光辐射强度及暴露时间有关。通常，紫外线可分为3个波段: A波段320～380nm(UVA),B波段290～320nm(UVB),C波段190～290nm(UVC)，其中短波紫外线UVC对病毒灭活效果最好[27]。以前紫外灭活普遍被认为对血浆蛋白损伤较大而一度被搁置。最近不断有研究发现，在很好的掌握辐射剂量和暴露时间时，短波紫外线对病毒，尤其是无包膜病毒可达到很好的灭活效果，在不加光保护剂的情况下对血浆蛋白损伤也不大。J.Wang等[28]报道了一种新的紫外灭活仪在短时间内就能有效灭活病毒，尤其是无脂包膜病毒，同时对血浆蛋白不会造成损伤。这种紫外灭活仪 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 的围绕灯管的螺旋形结构使血浆料液在压力泵的推动下形成涡流[29]，进而使每一部分液体分送速率相同，所受辐射均匀，从而达到短的暴露时间，在不需添加任何光保护剂的情况下，无包膜病毒B19灭活大于4log值，制品蛋白检测不到损伤，蛋白回收率高。本 实验室 17025实验室iso17025实验室认可实验室检查项目微生物实验室标识重点实验室计划 研究发现，应用该紫外灭活仪对加入无包膜病毒的静注免疫球蛋白、凝血VIII因子和凝血酶原复合物进行90J/m2，135 J/m2，200 J/m2等剂量下的灭活辐射处理，病毒滴度下降达4log值以上，且处理后的血液制品蛋白质量符合药典要求。该灭活仪特殊的灯管结构如图1所示 Fig 1.Struc 图 1 UVC灯管装置，螺旋型通道外侧是聚四氟乙烯材质的半圆形，内侧是石英玻璃的直方形。螺旋形通道围绕一杆状紫外灯光源，紫外线可穿透通道内侧照到通道外侧。由于灯管装置的螺旋型结构，料液不是以层流的方式通过，而是形成二级漩涡，即涡流。这种设计方式使料液单次通过所受的辐射剂量就可有效灭活病毒。UVivatec的技术原理：可控辐射分布；强烈的流体径向混合；减少滞留时间；可抛弃型模块；结实可扩展模块，有不同的生物制药生产规模；有效的病毒灭活，最小的蛋白损伤。 Fig 1.Structure of coiled tube reactor of UV irradiation apparatus, a helical channel is formed with the semicircular outer side consisting of Teflon and the straight inner side of quartz glass. The helical channel can be irradiated from the inside to the outside by a rod-shape UV light source placed inside the tube. A flow no longer passes the UV lamp linearly but helically through the coiled channel, helical flow guidance leads to the formation of secondary vortices, known as Dean vortices. The systems are designed in such a way that a single flow through the module is normally enough to achieve a sufficient dose for efficient viral inactivation. Principle of the UVivatec technolog: controlled distribution of radiation; strong radial intermixing of fluid; minimised residence times; robust and scalable module; disposable modules at different scales in biopharmaceutical manufacturing; very effective inactivation of viruses with minimum protein damage. 4.结语 人细小病毒B19具有普遍易感性，对免疫力较低的患者具有潜在的致病威胁，献浆员含病毒的单个单位血浆有使整个血浆池污染的潜在危险。中和性抗B19抗体可阻止病毒与细胞的结合,但是否具有对B19病毒感染的保护作用尚不清楚，需要进一步研究。科技进步与发展使生物医学领域日新月异，对血液中已知和未知病毒的检测与灭活/去除工艺研究也不断深入，以期更大程度上保证患者健康。目前国内对献浆员人细小病毒检测并没有纳入法定检测项目，使血制品存在安全隐患。基于此，开发研制出一种新的病毒灭活工艺迫在眉睫，在众多灭活病毒机制中，短波紫外线对无包膜病毒的灭活优势凸显出来，有很好的应用前景，越来越引起人们的重视，也为我们提供了新的思路和方法。 参 考 文 献 [1] Henriques I, Monteiro F, Meireles E, et al. Prevalence of parvovirus B19 and hepatitis A virus in Portuguese blood donors. Transfusion and Apheresis Science, 2005, 33:305-309. [2] Expert committee on biological standardization. Guidelines on Viral Inactivation and Removal Procedures Intended to Assure the Viral Safety of Human Blood Plasma Products, Geneva, 2001. 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