论文.牦牛褪黑素受体在松果体、下丘脑、垂体、性腺的表达量。邓木金

论文.牦牛褪黑素受体在松果体、下丘脑、垂体、性腺的表达量。邓木金 论文.牦牛褪黑素受体在松果体、下丘脑、垂体、性腺的表达 量。邓木金 题 目 牦牛褪黑素受体在松果体、下丘脑、垂体、性腺中的实时定量表达 姓 名 邓 木 金 学 号 P081412675 所在学院 生命科学与 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 年级 六年级体育公开课教案九年级家长会课件PPT下载六年级家长会PPT课件一年级上册汉语拼音练习题六年级上册道德与法治课件 专业 08级动物医学 指导教师 霍生东 完成时间 2012 年 月 日 指导教师评语: 评定成绩: 指导教师签名: 答辩小组意见: 评定成绩: 答辩小组长签名: 综合评定成绩: 日期: 日期: 牦牛褪黑素受体在松果体、下丘脑、垂体、性腺中的实时定 量表达 专业: 08级动物医学 姓名:邓木金 指导教师:霍生东 摘 要 褪黑素是影响牦牛季节性发情的主要因子，本研究以 18srRNA为内参基因，采用实时定量PCR技术检测 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 了成年牦牛发 情 季节中褪黑素受体基因在下丘脑、垂体、松果体、性腺中的表达情况。 实时定量PCR检测结果表明，褪黑素受体基因在松果体、下丘脑、垂 体、性腺的表达量比为1:0.039:0.017:0.011。 关键词:牦牛 褪黑素受体 实时定量PCR Abstract Melatonin is the main factor which affect the seasonal cycle of yak,18srRNA was treated as reference genes in this study。 The expression level of melatonin receptors gene of adult yak during estrus season in the hypothalamus。 The pituitary and pineal gland and that in the gonad were analyzed by real-time quantitative PCR method。The result of real-time quantitative PCR were showed。The expression of melatonin receptors gene in the hypothalamus。The pituitary and pineal gland and that in the gonad is for 1:0.039:0.017:0.011。 Key words: Yak ,Melatonin receptor ,Real-time quantitative PCR 0引言 褪黑素( Melatonin, MLT )是由哺乳动物分泌的一种吲哚类神经 内分泌激素,除25%由其他组织(垂体、下丘脑、性腺)分泌外，主 2 要由松果体分泌[1]。化学结构为5—甲氧基—N—乙酰色胺，是色氨 酸的衍生物由松果体分泌[2]。自1958年褪黑素被发现以来，很多研究学 者对其进行了深入和广泛的研究，研究发现褪黑素具有调节生物的昼夜节 律和季节性节律[3]，除此之外还具有抗氧化、抗衰老、免疫调节、抗肿瘤、镇静镇痛、抑制生殖等作用。深入表明褪黑素是一种小的脂溶性分子,易透过细胞膜，在生理浓度下通过高亲和力的膜受体介导，然后通过信号转导系统来调节动物的青春期发育、控制促性腺激素和性激素合成与分泌及繁殖周期等。此外，褪黑素可能还通过信号介导作用于生物体内自由基对其的产生明显有抑制的作用，因此也有抗衰老及抗炎的作用[4] 。据报道褪黑素可通过褪黑素受体MT1调节小鼠视网膜的视觉功能和细胞活力[5]。因此, 本文通过荧光定量PCR研究褪黑素受体在牦牛下丘脑、松果体及垂体、性腺中的相对表达量, 对于分析褪黑素通过光照调控季节性繁殖及动物发育的作用机制有重要意义。 荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，QPCR)即实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法，自今已经成为基因表达解析的必要手段。它秉承及发展了普通PCR的快速、高灵敏检出等全部优点，同时克服了普通PCR布能准确定量、容易污染等的不足。在反应体系中加入荧光分子，通过荧光信号的按比例增加来反应DNA量的增加，使PCR产物的实时检测成为可能。满足实验目的的荧光化学物质包括DNA结合染料和荧光标记的 3 序列特异引物和探针，专门的热循环仪配备荧光检测模块。用于监测扩增时的荧光，检测到的荧光信号反应了每个循环扩增产物的量。荧光定量PCR结果可以用于定性(判断一序列的有无)，也可以用于定量(确定DNA拷贝数)，即QPCR，而常规PCR只能做半定量。另外，荧光定量PCR 的结果无需通过琼脂糖凝胶电泳来评估，大大节省实验时间。提高实验效率。还有，由于PCR反应和检测都在反应管中进行，样品污染的几率大大降低，无需扩增后的实验操作。荧光定量PCR具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等特点，是对原有PCR技术的革新，扩大了PCR的应用范围[6-9]。PCR目前已广泛应用于不同发育阶段或不同组织中基因表达量的检测[10]。 1.材料与方法 1.1 动物材料与仪器 牦牛松果体、下丘脑、垂体、卵巢采自天祝屠宰场，RNA保护液保存，带回实验室。仪器:PCR自动扩增仪(Biometra,Germany) 1.1.2 实验中各组织总RNA的提取 A.成年牦牛屠宰后，立即取出下丘脑、松果体、垂体、性腺迅速将各组织标记至于RNA保护液保存。 B.将保存好的组织块放入液氮预冷过的研钵中，加入少量的液氮，迅速用力均匀研磨。在此过程中多次加入液氮研磨，直至组织磨至粉末后加入1mlRNAiso Plus研磨至均匀无颗粒透明状。 C.将研磨好的组织液移至离心管中，静置5分钟。 4 D.加入200ul氯仿，盖紧离心管盖，摇匀，温静置5分钟。 E.4? 12000rpm离心15分钟后有分层现象，用移液枪小心吸取上层液至另一离心管中。 F.在上层液的离心管中加入等量体积的异丙醇轻轻摇匀，室温静置15 分钟。 G.4? 12000rpm离心10分钟，用移液枪小心吸取全部上层液，剩下RNA在管低。 H.沿离心管壁缓慢加入1ug/ml蛋白酶K处理的75%乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁(防止沉淀物溶解)。 I.4? 12000rpm离心5分钟，用移液枪吸取上层液弃之。 J.室温干燥2-5分钟，加入适量的RNAse-free水溶解沉淀，待RNA沉淀完全溶解后，置于-80?保存。 1.2 褪黑素受体基因在松果体、下丘脑、垂体、性腺中的实时定量PCR检测 1.2.1 设计褪黑素基因表达分析的引物 根据NCBI网上公布的褪黑素基因序列，通过primer5软件在线设计褪黑素基因表达的引物，利用Blast检索确定引物的特异性确保引物可用性。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。 1.2.2 各组织RNA的质量检测 提取各组织的RNA质量由琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结束后，即可在紫外灯下检测其结果，从显象观察是否有明显的基因片段。 5 1.2.3 各个组织的RNA反转录成cDNA 按照所购买宝生物(大连)有限公司生产的反转录试剂盒PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time操作说明书进行配备反转录反应液，配备完反应液后迅速摇匀，放入PCR仪，旋紧加热盖。PCR仪反应条件设置为:第一阶段37? 15min，第二阶段 85? 5s。反转录结束后将所得各个组织的cDNA置于-20?的条件保存。 1.2.4 各组织引物的筛选 以各组织的RNA反转录得到的cDNA为反应模板，按照宝生物(大连)有限公司生产的试剂盒SXBR Premix Ex Taq?(Perfect Real Time)说明书进行设定PCR反应条件，荧光实时定量的反应液体系为:SXBR Premix Ex Taq?(2×)加入12.5ul,引物上、下游各加入1ul,cDNA模板加入2ul，DEPC灭菌水加入8.5ul,反应液总体积为25ul。根据溶解曲线峰的个数和峰值筛选用于检测褪黑素受体基因在各个组织表达的特异性引物。 1.2.4 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线的制作 将各个组织RNA反转录得到的cDNA按照五倍配比梯度稀释成1倍、5倍、25倍、125倍的四个浓度。用上一步筛选到的特异性引物与内参基因18sRNA作为特定引物，用PCR自动扩增仪合成标准曲线。 1.2.5 褪黑素基因表达量的分析 在PCR自动扩增仪中按照说明书进行实时定量荧光PCR反应条件的设置和操作，利用计算机TM TM 6 配备好的primer5软件对实时定量荧光PCR反应的数据进行解析，通过各个有效数据来分析褪黑素基因表达的情况。 2 结果与分析 2.1 褪黑素基因在松果体、下丘脑、垂体、性腺的表达量 利用Real Time PT-PCR方法进行基因表达解析，测定的结果表明松果体、下丘脑、垂体、性腺中褪黑素受体基因表达量的比为1:0.039:0.017:0.011。 2.2 提取各个组织RNA的质量检测 取各样品(松果体、下丘脑、垂体、性腺)3.0ul进行琼脂糖凝胶电泳，结果表明提取质量较好目的基因片段明显(图1)，可用于荧光定量PCR反应。 2.3 引物设计与筛选 引物设计由引物设计软件 Primer Premier 5 Premier Biosoft international 的Primer Premier 5设计。遵守三个原则:首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间要避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次，引物不能再模板的非目的位点引发 7 DNA聚合反应(即错配)。经荧光实时定量PCR反应，得到单一峰且峰值在85?附近的溶解曲线，证明该引物没有引物二聚体的产生和非特异性扩增，所以可以选作本实验的褪黑素受体基因在各个组织表达分析的特异性引物。选用各引物的序列如表1。 表1.内参基因和MLT特异性引物序列 名称 引物序列 ACGGACAGGATTGACAGA 18s TCGCTCCACCAACTAAGA GGCACTCGTCATCATTCC MLT CGTCCACTCCAGTCTTCT 2.4 标准曲线分析 本实验按照配比稀释的方法进行的PCR扩增，扩增反应Ct值和模板 量cDNA浓度的对数值的线性关系如图1和表2，标准曲线回归方程为:y=ax+b,其中a表示标准曲线的斜率，斜率反应扩增效率(E)，PCR理想的扩增效率应在0.8<E<1.2的范围。 斜率与扩增效率的关系:E=10-1/斜率 扩增效率E转化为百分率:,效率=(E-1)×100, 斜率是评价标准曲线优劣的其中的一个指标，另一个指标是相关系数(R2)它是反映标准曲线的直线性，理想值应大于0.98，越接近于1说明直线性越好，定量越准确。x为标准样品中模板量cDNA浓度的对数值。b为标准曲线的纵坐标的值。 8 a.18s rRNA标准曲线 b.MLT标准曲线 图1 表2.内参基因18srRNA和褪黑素基因的相关系数和线性关系 名称 18s rRNA MLT基因 相关系数 0.99884 0.99720 线性方程 y=-3.38915x+16.05355 y=-3.38660x+28.83349 由图1和表2可得，内参基因18srRNA和褪黑素基因的扩增效率在正常值内(0.8<E<1.2)而且相关系数(R2)均大于0.98，所以可用于褪黑素受体基因的表达分析。 2.5 褪黑素受体在下丘脑、垂体、松果体、性腺的基因表达分析 根据表2的线性方程，将样品的Ct值代入样品的线性方程计算定量结果如表3。 表3.褪黑素基因和内参基因18s的原始定量结果 褪黑素基因定量结果 18srRNA定量结果 松果体 3764.2 1778.8 下丘脑 76.5 916.0 垂体 41.9 1173.5 性腺 45.7 1892.0 9 根据表3计算校正值和相对量，所谓校正值是指目的基因的定量结果 除以管家基因的定量结果。相对量是指通常将对照样品的表达量作为“1”， 计算出相量，在进行样品间相对量的比较如表4。 表4褪黑素受体基因在松果体、下丘脑、垂体、性腺校正值和相对量 的计算 检测样品 松果体 下丘脑 垂体 性腺 18s定量结果 1778.8 916.0 1173.5 1892.0 MLT定量结果 3764.2 76.5 41.9 45.7 校正值 2.1162 0.0835 0.0357 0.0242 相对量 1.000 0.039 0.017 0.011 由上表4可知褪黑素受体基因在松果体、下丘脑、垂体、性腺的表达 量比为1:0.039:0.011:0.017，为了更直观的表示褪黑素在各个样品的相对 表达量的差异将表4计算得到的相对量用图表的形式表示如图2。 2.结论与讨论 褪黑素重要的生理功能之一是对季节性繁殖动物生殖系统的调节,但 目前还不清楚其确切的机制[10]。本实验采用了荧光实时定量法对褪黑素 受体基因在松果体、下丘脑、性腺、垂体的定量分析。实验 10 结果表明，褪黑素受体基因在松果体、下丘脑、垂体、性腺的表达量之比为1:0.039:0.017:0.011。这一实验结果为进一步了解褪黑素基因受体对牦牛的生理调节的靶器官提供了试验参考依据。近年来，随着生物技术和分析仪器先进技术的快速发展和应用，对褪黑素受体基因的深入和广泛的研究已经得到了突破性的进展，褪黑素受体基因在哺乳动物生理调节中的重要地位已经得到了认可。但目前对褪黑素受体基因如何作用靶细胞的机制尚有模糊之处，因此，本实验对褪黑素受体基因表达分析为褪黑素产生作用的探讨提供了试验的参考。 褪黑素受体基因在成年牦牛松果体、下丘脑、性腺、垂体组织中有表达,说明在牦牛发育过程中,松果体、下丘脑、性腺、垂体组织中褪黑素受体的表达并未发生丢失,但不排除表达降低的可能性,这或许与牦牛的明显季节性繁殖特征有某种联系。虽然褪黑素通常认为是一种膜受体,但可能并不仅仅作用于松果体、下丘脑、性腺、垂体的细胞膜表面,由于褪黑素受体基因有小分子和脂溶性的特点,可能进入细胞内,通过细胞内受体发挥作用,调节牦牛松果体、下丘脑、性腺、垂体的功能。研究表明,MLT通过其Gi蛋白偶联的膜受体MT1和MT2发挥众多的生理作用，这些作用主要包括:A、通过细胞因子发挥免疫调节作用，在一定程度上发挥抗肿瘤作用。B、抗氧化作用，因此对多种细胞具有保护作用。C、镇静、催眠、镇痛，影响下丘脑神经内分泌激素的释放，调节昼夜及季节性节律。D、对生殖系统发挥抑制作用，调节动物初情期的发育，可引起性腺萎缩;抑制GnRH 的释放;调 11 控动物的繁殖季节[11]。褪黑素是松果体分泌的调节繁殖季节的重要 激素,这已经在许多动物,包括常日照动物如马、绵羊、短日照动物??在本实 验牦牛褪黑素受体基因在各组织表达量的研究中也得到了证实。 从现有的理论分析褪黑素受体基因可能作用的位点有松果体、下丘脑、 性腺、垂体等,以产生作用来调节和控制动物生殖腺系统及发育机制等作用。 因此，本实验虽然简述了褪黑素受体基因在松果体表达量最大，依次是下 丘脑、垂体、性腺。但褪黑素受体基因表达作用靶细胞的过程还有待进一 步努力深入解析。 参考文献 [1] Djeridane Y, Vivien Roels B, Simonneaux V, et al. Evidence for melat onin sy nthesis in r odent Harderiang land: a dynamic in vitro study [J]。J PinealRes,1998, 25(1):54-64。 [2] 占今舜，张彬。浅谈褪黑素在动物生产中的应用[A]。伺料博览 41，2011年第七期。 [3] Nelson R J, Dr azen D L。latonin mediates seasonal adjustments in immune function [ J ] 。 Repr od Nutr Dev , 1999, 39(3):383-398。 [4] Department of Psychiatry, Faculty of Medicine, University of Toronto, Centre for Addiction and Mental Health, 250 College St., Toronto, ON M5T 1R8, Canada。 [5] Baba K, Pozdey ev N, Mazzoni F. M elatonin modulates visual function and cell v iability in the mouse r et ina via the MT1 melato nin recepto r [ A] 。 Pr oc Natl Acad Sci USA, PM CID: PM C2736407, 2009。 [6] 朱水芳。实时荧光聚合酶链式反应检测技术[M]。北京中国计量出版社, 2003, 2:33-49. [7] 侯秋莲, 张富等。定量PCR研究细粒棘球蚴抗氧化相关基因的差异表达[J]。中国人兽共 患病学报, 2010, 26(1):1-5。 [8] 高博, 杨晓农, 于学辉等。家兔GAPDH基因实时荧光定量RT-PCR方法的建立[J]。中国 畜牧兽医, 2010, 1(3):69-73。 [9] 曹军平, 赵国, 顾敏。等。 实时荧光定量RT2PCR方法检测禽流感病毒[J]。中国兽医学 报, 2010, 1(1):47-50。 [9] 赵刚, 张洪义, 等.。实时荧光定量PCR检测人肝癌组织皮层肌动蛋白基因[J]。军医进修 学院学报, 2010, 31(2): 171-174。 [10] Revel F G, MassonPvet M, Pv et P, et al. Melatonin controls seasonal breeding by a network of hypotha Lamic targets[J]。Neuroendo crinology,2009,90(1):114。 [11] 赵兴绪。兽医产科学。第四版。中国农业出版社。 12 答 谢 本论文在霍生东老师的严格 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 和细心指导下圆满完成。在实验的过程中有着许多复杂而繁琐的问题，和蔼可亲的霍老师都以受之与渔的方式不辞辛苦的给我讲解和举例，使我在实验的操作和数据的处理简明易懂。在平常的讨论中霍老师不仅让我在实验的问题上迎刃而解也在做人做事中受益匪浅。霍老师的教学态度、教学方法和本校西北民族大学先进齐全的仪器设备使我轻松愉快的完成了本次论文要求。在此，衷心感谢我的指导老师霍生东在本论文的精心指导和帮助。希望以后霍老师工作顺心，西北民族大学桃李芬芳。 13