山楂叶总黄酮对脑缺血再灌注损伤的保护作用.doc

山楂叶总黄酮对脑缺血再灌注损伤的保护作用.doc 山楂叶总黄酮对脑缺血 再灌注损伤的保 护作用 作者:纪影实 李红 曲极冰 杨世杰 【摘要】 目的 探讨山楂叶总黄酮(FMCL)对脑缺血 再灌注 (CIR)损伤的保护作用及其可能机制。方法 采用线栓法制备大鼠局 灶性脑缺血 再灌注损伤模型，对其进行行为指标评分，TTC染色 测定梗死范围，HE染色检测脑组织病理变化，透射电镜检测神经元 超微结构变化，并检测大鼠脑组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD) 活性、丙二醛(MDA)及一氧化氮(NO)含量的变化。结果 FMCL可明显改善大鼠神经行为，缩小梗死范围，减轻脑组织病理 改变，并可提高脑组织中SOD活性，降低脑组织中MDA及NO含 量(P,0.05或P,0.01)。结论 FMCL可减轻CIR神经细胞损 伤，其机制可能与抗自由基损伤、减轻NO神经毒性有关。 【关键词】 山楂叶总黄酮; 脑缺血 再灌注;脑梗死 【Abstract】 Objective To investigate the protective effects of flavone mixture of crataegus leaves(FMCL)on cerebral ischemia reperfusion(CIR) injury in rats. Methods The CIR model was built through thread block . The neurologic deficit score and infarction area were measured. Then pathological change in injury brain tissue was detected by HE stain and transmission electron microscope. At the same time, the levels of superoxide dismutase (SOD),malondialdehyde (MDA) and nitric oxide(NO) in brain tissue were observed. Results FMCL reduced cerebral infarction area, and relieved the injury of brain tissue. It also increased the activity of SOD and decreased the contents of MDA and NO in a dose dependent manner(P,0.05 or 0.01). Conclusions FMCL has a protective effect on CIR injury. Its mechanism maybe relate to anti radicals damage and lessen the neurotoxicity of NO. 【Key words】 FMCL;Cerebral ischemia reperfusion; Cerebral infarction 山楂叶总黄酮(FMCL)是从花期山楂的叶子中提取的黄酮类 化合物的总称，已从中分离出30余种单体。研究显示，FMCL具有 多方面的药理作用，如扩张冠状动脉、强心、抗心肌缺血等〔1〕， 但对脑缺血 再灌注(CIR)损伤的作用尚未见报道。本实验通过 模拟CIR损伤模型，研究FMCL对CIR损伤的保护作用并探讨其作 用机制，为其临床应用提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 药品及仪器 FMCL由长春三九生物制药提供，批号030510;舒血宁(ShXN)金陵药业股份有限公司，批号030728;红四氮唑(TTC)中国医药上海化学试剂总厂，批号20031103;超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)试剂盒均由南京建成生物公司提供;6010紫外分光光度计由安捷伦分析仪器厂生产; GF D200半自动生化测定仪由山东高密彩虹分析仪器有限公司生产;JEM 1200EX电子显微镜，日本光电株式会社。 1.2 动物分组及给药 60只雄性Wistar大鼠(吉林大学实验动物部提供)，体重300,350 g，按体重随机分为6组，每组10只，即假手术组、模型组、阳性药组(舒血宁1.8 ml/kg)、FMCL高、中、低剂量组(100、30和10 mg/kg)，每日腹腔注射(ip)给药1次(前两组为相同体积的生理盐水)，连续给药5 d。 1.3 CIR损伤模型的制备 于末次给药后30 min，上述动物经ip水合氯醛(350 mg/kg)麻醉。仰卧位固定在手术台上，行颈正中切口，分离右侧颈总动脉(CCA)， 再分离出颈外动脉(ECA)结扎，在ECA下方分离颈内动脉(ICA)及其小分支翼腭动脉(PPA)并结扎之。结扎CCA近心端和ECA，用动脉夹夹闭CCA，并在CCA剪开一小口，将直径0.175 mm的尼龙线插入约18 mm，遇阻即止，阻塞大脑中动脉起始部，然后逐层缝合肌肉和皮肤，单笼饲养。术后自由进食水，2 h后拔出栓线使血流再灌注22 h，假手术组仅分离右侧CCA、ICA颈内动脉及ECA，其余同上。 1.4 神经功能评分 大鼠CIR 22 h后进行行为指标评分，标准为:活动正常者为0分;竖毛，轻度运动低下者为0.5分;前肢屈曲运动障碍者为1.0分;行动不协调，屈曲姿势，旋转运动者为2.0分;偏瘫，不能站立和行走者为3.0分;痉挛，昏睡者为4.0分;死亡者为5.0分(术后2 h以上死亡者)。得分高者运动障碍明显。 1.5 脑梗死面积测定 实验结束后，将大鼠立即断头取脑，去除小脑和低位脑干，在前联合处将脑组织行冠状切片，间隔4 mm，共5片，放入2,TTC磷酸盐缓冲液(pH7.4) 37?水浴10 min，正常脑组织呈深红色，梗死脑组织呈白色。将每片组织照相，选择每一切面的尾侧面，应用BI 2000软件处理系统计算各部分面积，以各片非染色区面积之和与各片脑组织面积之和的百分比计算脑梗死范围。 1.6 HE染色 实验结束后，断头取脑，脑组织片置入4,多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片， HE染色，于光学显微镜(200倍)下观察病理变化。 1.7 透射电镜观察 实验结束后，将大鼠用10%水合氯醛麻醉， 4,多聚甲醛 4,戊二醛150 ml灌流固定。取1 mm×1 mm×1 mm大小的脑组织(海马CA1区)，4,戊二醛固定2 h，1,锇酸固定2 h，经梯度酒精及95%丙酮逐级脱水，氧化丙烯浸透1 h，Epon 812环氧树脂包埋聚合，37?过夜，60? 24 h，醋酸双氧铀,柠檬酸铅双重染色后，在JEM 1200EX电子显微镜下进行神经细胞超微结构观察，摄片。 1.8 脑组织匀浆中SOD、MDA、NO含量测定 实验结束后，断头取脑，切取缺血侧大脑中动脉(MCA)供血区脑组织0.1 g，用冰生理盐水制成10%的脑组织匀浆，4?离心(3 000 r/min)15 min，取上清，测定SOD活性、MDA及NO含量。 1.9 统计学处理 数据以x?s 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示，组间比较采用t检验。 2 结 果 2.1 FMCL对CIR大鼠神经功能评分的影响 与假手术组比较，模型组大鼠神经功能评分(3.65?0.15)明显增高(P,0.001)，说明模型成立;与模型组比较，FMCL高剂量组神经功能评分(2.55?0.10)明显降低(P,0.05)，而FMCL中、低剂量组大鼠神经功能评分分别为(3.55?0.08，3.65?0.11)，与模型组比较无显著性差异(P,0.05)。2.2 FMCL对CIR大鼠梗死面积的影响 模型组脑梗死面积为(38.25?2.31)%，FMCL高、中剂量组大鼠的脑梗死范围分别为(27.94?3.85)%及(30.65?2.18)%，与模型组比较均明显缩小(均P,0.05)，FMCL低剂量组大鼠的脑梗死范围〔(36.17?2.52)%〕与模型组比较无显著性差异(P,0.05)。 2.3 FMCL对CIR大鼠脑组织匀浆中SOD活性、MDA及NO含量的影响 与模型组比较，FMCL高、中剂量组大鼠脑组织中SOD活性明显增强，MDA含量明显降低(P,0.05，P,0.01);FMCL低剂量组SOD活性，MDA含量也分别有增强及下降趋势，但差异无显著性(P,0.05);FMCL高剂量组大鼠脑组织中NO含量明显下降(P,0.05)，中、低剂量组NO含量与模型组比较有下降趋势，但无统计学意义(P,0.05)，见表1。表1 FMCL对CIR大鼠脑组织 匀浆中SOD活性、MDA及NO含量的影响(略) 2.4 HE染色结果 光镜下假手术组大鼠脑皮质神经元胞体呈圆形，胞核规整，染色质分布均匀，胞膜完整;模型组脑组织水肿、疏松，可见大量神经元胞体为三角形，核固缩，核溶解，核仁消失，水肿空泡形成，神经元间隙扩大;FMCL高剂量组可见少量神经元胞体呈三角形;FMCL中、低剂量组较多神经元胞体呈三角形，见图1。 2.5 电镜观察结果 假手术组神经元核膜清晰完整，染色质较均匀分布可见较多粗面内质网，少量溶酶体及线粒体;模型组神经元核基质变密，胞质空泡化，细胞膜局部破损，细胞间隙增大;FMCL高剂量组神经元核基质深染，核呈不规则形，胞质基质深染，可见粗面内质网轻度扩张;FMCL中剂量组神经元胞质基质深染，线粒体肿胀，内质网扩张，脱颗粒;FMCL低剂量神经元胞质基质深染，呈暗细胞，核基质略空泡化，内质网、线粒体内腔扩大，空泡化，线粒体嵴肿胀断裂，见图2。 3 讨 论 脑功能活动的正常有赖于一定量的脑血流供应，当血流供应突然停止或突然减少，会引起脑功能损伤，但缺血一定时间后即使恢复血流供应，仍使损伤进一步加重，病理检查动脉供血区出现梗死灶，神经细胞变性、坏死，动物则表现为不同程度的神经功能缺损〔2〕，实验结果显示，FMCL能够缩小梗死面积，减轻神经细胞损伤程度，改善脑功能。 研究表明，在缺血性脑损伤中可产生大量的氧自由基(OFR)，但再灌注期间OFR生成加剧，而且随着OFR生成增多，清除自由基的能力则下降，造成OFR大量堆积〔3〕，研究发现，OFR的增加是再灌注损伤的主要机制之一〔4〕。自由基生成增多已被大量的研究所证实，大鼠大脑中动脉结扎15 min后羟自由基有升高，可持续到再灌注30 min〔5〕。自由基可使各型NO合成酶(NOS)激活，从而使NO含量发生变化〔6，7〕。Alberts等研究表明，NO在缺血早期呈突然而持续的增高，30 min时达高峰，以后逐渐降至正常水平，再灌注期间又轻度增高，而增多的NO可产生神经毒性作用，引起神经细胞损伤〔8，9〕。SOD是一种抗氧化酶，其活性的高低可直接反映组织清除自由基的能力。MDA作为脂质过氧化产物，其含量可间接反映组织的损伤程度。有报道表明，FMCL具有明显的抑制自由基产生和增强自由基清除，从而减轻氧化应激损伤的作用〔10〕，本实验结果显示，FMCL可提高脑组织中的SOD活性，降低MDA，与文献报道一致，同时降低脑组织中NO含量，说 明FMCL也具有减轻NO神经毒性作用。 综上所述，FMCL可减轻CIR神经细胞损伤、改善神经行为，其机制可能与抗自由基、降低NO神经毒性有关。 【