金属硫蛋白作为淡水水体重金属污染生物标志物的研究进...

金属硫蛋白作为淡水水体重金属污染生物标志物的研究进... 环境污染与防治 网络版 第8期 2007年8月 * 金属硫蛋白作为淡水水体重金属污染生物标志物的研究进展 1唐 戈 范文宏 (北京航空航天大学环境 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 系，北京 100083) 摘要 金属硫蛋白(MT)作为生物标志物已得到广泛的应用，但作为受污染淡水水体的生物标志物应用较少。介绍了MT的概念、结构特征、分类、功能和应用，对MT作为生物标志物在淡水水体中的应用进行了概述。并对MT在医学、环保以及相关领域中发挥的作用进行了展望。 关键词 重金属污染 生物标志物 金属硫蛋白 淡水水体 Research of metallothionein as biomarker in freshwater to heavy metal pollution Tang Ge, Fan Wenhong. (Department of Environmental Engineering, Beihang University, Beijing 100083) Abstract: Metallothionein as biomarker were used broadly. But it was not much used in freshwater. The basic knowledge of metallothionein such as research development, definition, structure character, classification, function and applications were introduced briefly based on the references. And moreover, metallothionein as biomarker in freshwater were also briefly presented. And function of metallothionein for medical, environmental and related fileds were prospected. Keywords: Heavy metal pollution Biomarker Metallothionein Freshwater 随着日本由汞污染引起的“水俣病”和镉污染引起的“骨痛病”事件的相继发生，重金属污染问题日趋严重，水体中重金属的污染已成为科学家共同关注的全球性的环境问题。 由于水体中重金属污染具有极大的危害，为了保存人类的生存环境，控制和预防重金属污染具有十分重要的意义。在重金属领域，国内外已经开展了大量研究，在沉积物中重金属的生物有效性、植物中重金属的积累、土壤重金属含量和形态的分布等方面研究已经较为成熟，但在淡水水体受到重金属污染后生物预警即指示淡水水体污染的生物标志物领域的研究还相对较少，相关研究还处在初级阶段。 随着科学工作者研究的深入，研究者发现，与其它方法相比，生物标志物的最大特点在于可以确定污染物与生物体之间已发生的相互作用，测定的是污染物的亚致死效应，它 [1]的主要优势体现在以下几个方面: 可反映污染物暴露的时空变化和历史情况;可联系微观和宏观效应;直接联系污染物浓度与效应;可确定各种暴露途径之间的差异;综合了多种污染物的相互作用;判定污染物引起的效应对生物个体或生态上的意义;可对长期生态效应进行短期预测等。 在早期的研究中，水体生物标志物主要分为:细胞与核酸标志物、铁蛋白和铁蛋白反应器、修热克蛋白、蛋白组技术以及金属硫蛋白。在这些生物标志物中，金属硫蛋白(MT)能够指示生物对污染物的暴露，即污染物引发的生物体的反应，其水平与环境中金属离子浓度成正对应关系，能够反映环境中重金属的污染程度，因而逐渐成为一种重要的分子生物标志物。 第一作者:唐 戈，男，1982生，硕士，研究方向为环境毒理学。 *国家自然科学基金资助项目(No.50678015)。 1 MT不但能指示污染物的毒性效应，而且它的产生是对污染物暴露的早期反应，因此 [2]MT成了污染物暴露和毒性效应早期警报的指示物。由于动物体内的MT与水环境和体 [3]内组织中的重金属之间有显著的相关性，因而MT可以作为重金属暴露的生物标志物，为水产品的清洁管理以及利用水生生物体内MT含量评价水体质量，确定水环境污染程度 [4]提供综合和客观的指标。由于MT具有上述优点，在环境毒理学的研究中，MT越来越受到研究者的青睐。 本文对于MT的结构特征、分类、功能进行了论述，并在前人的研究基础上着重对MT作为淡水水体中重金属污染的生物标志物的应用进行了详细的论述，并进行了展望。 1 MT的结构特征与分类 [5]MT是一类低分子量、富含半胱氨酸、可被金属诱导的特异蛋白质。1957年MARGOSHE和VALLE首次在马肾中发现并分离出MT，以后发现MT广泛存在于各种生物体中，到1997年第四届国际MT会议止，共发现并确定氨基酸序列的MT有170 [6]多种。 1.1 MT的结构特征 MT最重要和最原始的特征是其富含大量的半胱氨酸。1985年第二届国际MT会议提出，MT具有以下几个与马肾MT相似的特征:分子量低(通常少于10 000 u)，金属含量高(通常4~12个金属离子、分子)，半胱氨酸含量高(有丰富的Cys-Cys、Cys-X-Cys 和 Cys-X-Y-Cys 序列结构域)，缺乏芳香族氨基酸，组氨酸含量极少.在这些序列结构域中, X和Y代表不同氨基的酸,而非半胱氨酸.不同种类MT的X和Y的差别性正是作为MT分类的标准。 MT的一级结构:MT一般是由60~68个氨基酸残基组成的多肽单链.肽链氨基端有一个乙酰化的甲硫氨酸，分子内半胱氨酸的数目和位置及碱性氨基酸残基都有一定的保守性，这是MT保持其功能相似的物质基础.虽然MT分子中含有大量琉基，但分子内、分子间均 [7]不存在二硫键，在自然条件下，所有的Scys均与金属结合，这是MT的重要特征。 MT的空间结构:用核磁共振、X射线等技术研究发现，虽然不同MT中氨基酸顺序不同，但空间结构却相似，即MT整个分子呈哑铃形，由α和β两个大小相近的球形结构域组成，两个结构域通过第30、31位的Lys残基(铰链区)相连，MT铰链区的存在使两个结构域存在较大的柔性和可变性，从而使MT中的金属离子与溶液中的金属离子易于交换，为其 [8]调节体内金属离子的代谢提供了结构基础。 1.2 MT的分类 MT可以按许多不同的标准进行分类，但研究者公认的最重要的分类方法是将MT分为 [9]以下3类:第一类是由类蛋白质(like-protein)的MT组成，在这类MT中半胱氨酸的位置与哺乳动物体内的十分相似;第二类是由缺乏与哺乳动物MT这种相似性的类蛋白质MT组 成;第三类是由非类蛋白质的MT组成。 、MT-2和MT-3。其中，MT-1和MT-2广泛存在于机体MT是一个蛋白家族，包括MT-1 各个组织中，而MT-3(生长抑制因子)是大脑特异的成员，可以破坏培养的神经元的生存以及轴突的形成，和其他MT成员几乎以同样的方式结合重金属(如Zn、Cu和Cd)。与其他成员不同的是，该蛋白的生物学功能是作为生长抑制因子，因为该蛋白与Cu的结合能力明显 [10]高于MT-1和MT-2。 [11]随着研究者对MT更加深入的了解，BINZ 和 KAGI于1999年提出了一种新的MT的分类方法，这种新的分类方法将动植物种类史的特征作为一种附加的分类标准，在这种新的分类方法中，第一类和第二类MT被分为15种家族。 根据BINZ 和 KAGI的最新分类方法，类软体动物的MT属于2号家族，而类甲壳类动物的MT则属于3号家族。BINZ 和 KAGI并没有将类环节动物的MT进行归类。 2 MT的功能 由于MT在生物体内普遍存在，含量较大，其在许多重大的生命代谢过程中具有重要的作用。 [12]在1995年，MASON 和 JENKINS提出了MT具有两种最为重要的功能: 第一，由于这种蛋白质是由无毒的、可生物利用的锌和铜所合成的金属酶所组成，其可以控制许多细胞水平过程的动态平衡。现在，许多学者都认为MT可能能够控制生命所需金属的动态平衡，比如锌和铜。他们指出，锌和铜能够合成金属酶和满足新陈代谢的需求，MT能够在细胞与生命所需金属之间架起一座桥梁，使细胞的活动达到一个平衡。 第二，MT可以减小非重要金属和细胞的非特定的结合，因此可以限制其潜在的毒性，即解毒功能。因为MT是富含半肤氨酸的金属结合蛋白，其琉基(—SH)能强烈鳌合金属，并将之排出体外，从而实现解毒功能。MT通过与重金属结合而减轻重金属对机体的毒害，如MT的琉基可与甲基汞等形成高亲合力的复合物，降低甲基汞等与其他生物分子结合的 [13]能力，进而减轻甲基汞等的神经毒性。 许多学者认为当非生命所需的金属，比如Cd、Hg和Ag进入细胞内，会不可避免的和已存在的生命所需的金属间产生竞争去结合细胞内的配位体，如金属蛋白，这时MT的解毒作用的优势就可以体现出来了。 随着研究者研究的更加深入，研究者发现，MT也具有其他的作用，诸如: (1) 抗离子化 [14]电离辐射可以产生大量自由基，直接或间接使生物体受到损伤.有学者研究表明，口服MT能够延长被一次性大剂量电离辐射的小鼠的存活时间，降低一次性大剂量和多次小剂量电离辐射对免疫系统的损伤，口服MT能吸收进入体内的大量Cys，为修复体内受辐射作用而断裂的二硫键提供原料。 (2) 抗自由基的作用 MT清除自由基的功能使其在抗衰老、抗氧化压力及细胞凋亡等过程中发挥着重要作 用。比如，当生物体经过一定浓度金属的预暴露后，经过金属诱导的MT可以通过清除-OH、 [15]-O自由基来达到抗氧化的能力。 2 (3) 环保作用 利用MT与金属结合的特性，可以选育或用基因工程手段建立MT的高表达系统，以治 2+理重金属污染.据报道，转酵母MT基因的烟草能显著提高对污染土壤中Cu的吸收，用这 [16]种方法可以对重金属污染区进行补救。 (4) 预防与治疗疾病 [17]许多实验证明，MT对神经系统有保护作用，鼠刺伤模型和缺血模型的研究发现，MT-3可以参与中枢神经系统损伤的修复。MT还可以治疗一些疾病，例如冠心病，风湿、类风湿性关节炎和由锌缺乏引起的各类疾病，MT还可以补充生物锌，有利于缺锌儿童正常生长发育，对改善贫血非常有效。 另外，MT还可以治疗与金属代谢有关的疾病,还可以作为生物预警、标志物等等其他诸多作用。 3 MT在淡水水体中的应用 一般的化学监测方法虽然能对环境或生物体内污染物含量进行定量描述，但仅凭含量无法反映这些污染物对生物的毒性效应，在这种情景下，通过测定污染水系中动植物体内的MT含量来监测环境中水质的污染程度，用动植物体内MT含量的变化来检测和评估重金属对淡水水环境质量的影响，是能够表现混合污染物之间毒性相互作用的累积效应。因此，MT作为指示淡水环境污染的主要生物标志物在淡水环境研究中有着有益的应用背景。 3.1 浮游植物 藻类是浮游植物的代表物种，是淡水生物的重要类群，在水生生态系统及水生食物链中，作为其它浮游动物的食物及氧气来源，藻类占据着重要位置。有学者指出:淡水浮游藻类与介质接触的比表面较大，具有较高的富集系数，可以利用一些微藻的敏感种类作为指示生物，监测水体重金属的污染程度。 藻类的重金属结合蛋白分成植物鳌合素(简称PCs)和类金属硫蛋白(简称类MT)。1985年，第二次全球MT和其他低分子量金属结合蛋白大会确定，PCs属于植物第III类MT。PCs是植物体内另一种重要的金属结合蛋白，广泛存在于植物界中，目前在许多淡水浮游植物中均发现有PCs的存在。 [18]对于淡水藻类，有关研究还相对较少。杨红玉等报道Cd能破坏某些绿藻的叶绿素，引起光合作用下降，还对斜生栅藻呼吸作用产生影响，诱导斜生栅藻体内PCs的变化，抑制苹果酸脱氢酶活性。KATJA等对欧洲几大淡水湖泊的研究表明，PCs对于Cd及Cu很敏感，在较低浓度下浮游藻类便产生PCs。但他们不能证实PCs可能能够作为一种指示物。也有学者的实验结论则是实验室和野外数据标志PCs是一种对金属暴露很好的定量指示物。目前，对此领域的研究还存在着一定的疑问，需要更加深入地研究。 3.2 原生动物类 原生动物四膜虫(Tetrahymena)是单细胞真核生物，以自由游泳方式生活在淡水环境中，对污染物胁迫响应更直接、更敏感，因处于水生态系统食物链的底层，更有利于污染物毒性的早期预报，并且由于其生活周期短，加上成熟易操作的无菌纯培养方法，一直被 [19,20]作为毒理学研究的良好模式生物。 [21]俞婷等在荧光定量PCR优化的基础上，考察了不同浓度的重金属镉和铜对嗜热四膜虫金属硫蛋白基因(MTTl)诱导表达的变化规律。他们的研究结果表明，MTTl基因的表达对镉离子的诱导更灵敏，且在一定阈值浓度(<35.2 μmol/ L)范围内，镉离子浓度升高会增加MTT1基因表达量，超过该阈值后表达量迅速下降，镉与铜同时诱导时MTT1基因的表达情况与镉单独诱导的类似，但阈值浓度减小为22 μmol/ L，表明二者的联合毒性为协同作用。镉离子低于22 μmol/ L时，与铜离子的共同作用会大大增加MTT1基因的表达量，从而增强了四膜虫的解毒能力。 另外，有关原生动物MT的研究显示，在镉离子的诱导下，四膜虫T.pyriformis和 [22]T.pigmentosa会产生相同的由107个氨基酸组成的金属硫蛋白MT-1，嗜热四膜虫T.thermophila可以产生MT的另一种亚型MTT1，由162个氨基酸组成，是目前所知的最长 [23]的一种MT。 3.3 底栖动物 底栖动物是指水蚯蚓、螺类和蚌类等无脊椎动物，多生活于水体底部的水生动物群，是生物链的重要环节。由于底栖动物对环境变化较敏感，因此通常用作水体污染的指示生物，并被称为“水下哨兵”。 [24]HAMZA -CHAFFAI对河蛤的原位重金属暴露研究表明，MT与所研究的每种重金属Cd, Cu和Zn都存在正的显著的相关性，并且在考虑所有金属的多元回归中发现Cd和Zn与 [25]MT的相关很显著，尤其是Cd。OLSSON等的研究证实，在受精后及在随后的胚胎发育期间，MT mRNA在原肠胚形成时增加并在孵出时达到峰值，这些改变与Zn和Cu的亚细胞区室化改变有关。在原肠胚形成时，MT结合的Cu增加伴随有MT的两种同工型增加。引起注意的是，观察到鱼的胚胎对Cd的敏感性在原肠胚形成后大大下降，这与胚胎MT转录的初始积累密切相关。 3.4 浮游动物 水蚤类是浮游动物的代表动物，是淡水生物的重要类群，对许多毒物很敏感，反应灵敏，而且由于蚤类，试验方法简便，繁殖周期短，产仔量多，是一类很好的试验生物，因此常被选定为毒性测试生物。早在100多年前，就有人用它来检测药物的毒性。 [26]WANG等在2004年的研究表明，在一定浓度和时间的金属Cd的暴露下，大型蚤体内的MT的含量会随着暴露浓度的升高而升高，同时也会随着暴露时间的增加而增加，但 会在某一时间时达到峰值，随后趋于平衡。在他们的研究中，当以低浓度0.5 μg/L暴露时， 天达到一个最大值，之后随着时大型蚤体内MT的含量会随着时间的增加而增大，会在第8 间的增加，MT的含量趋于一个平稳的水平(27~28 μg/g,以湿重计)。同样，当时间确定(3 d)，而浓度变化时(0,20 μg/L)大型蚤体内的MT含量也会随着浓度的升高而升高。 [27]WANG等在2005年研究了大型蚤的两种克隆体经过相同的金属暴露实验，其体内MT变化量结果的比较以及这两种克隆体子代体内的MT的变化量结果的对比。在此研究中,他们指出来自北美的大型蚤种要比来自中国武汉水生物所的大型蚤种更加能够耐受金属的毒性，经过金属的诱导后,其体内MT的含量的平均水平要比中国武汉水生物所的大型蚤的高，这两种克隆体的第一子代、第二字代和第三子代也相应的表现出相同的变化水平。 3.5 淡水鱼类 水生生物在某种程度上均积累金属，但积累量视生物种类而异。鱼类是淡水水体中最为常见的生物，与人类联系最为密切。由于鱼体内的MT与水环境和体内组织中的重金属之间有显著的相关性，因而鱼类MT可以作为重金属暴露的生物标志物，有效地表征水体中重金属对生物的影响，为水产品的清洁管理及利用水生生物体内MT含量评价 [28]水体质量。 [29]任宏伟等对取自不同淡水水域，不同鱼种的肝脏、肾脏、心脏、脑和鳃内MT进行了测定，其结果表明MT含量在5种淡水鱼间有较大差异，在同一类鱼中各组织中差异也很大，尤其在肝脏，肾脏内含量明显突出，反映了在Cd诱导下，MT合成在肝脏和肾脏旺盛，是络合和积累Cd的主要器官;研究还表明，不同种类的鱼体内MT也有所不同，鲢鱼的积累量最少、其次是鲤鱼、而草鱼集积累量最多。GAGNE在1990年的研究证明，施用Cd、Cu、Zn和Hg一类金属会导致鱼类及鱼类细胞系中MT水平上升。ZAFARULLAH在1990的研究进一步证实，不同金属在体内和体外的诱导强度不一样，Zn是最强的诱导剂，其次是 [30]Cr、Cu是最弱的诱导剂，因此，诱导MT的能力不受金属与MT的结合亲和性的影响。 4 结 语 MT的检测能提供有毒化学污染物环境生物效应的信息，对生态毒理研究和环境危险评价具有重要意义。它的早期检测可使人们采取措施预防或缓解污染物危害，因此加强这类生物标志物在生态危险性评价中的作用，充分发挥其预警优势是十分必要的。但自然环境系统十分复杂，生物体常暴露于混合污染中，故实验室条件下联合毒性及长效应的研究应受关注。同时仍需注意这类标志物研究的生态相关性应尽可能反映实际环境暴露情况。 40多年来的研究证明了MT广泛的应用前景和巨大的市场潜力。MT可作为生物学标志物在疾病检测和环保检测中发挥作用;可利用其基因的高度可诱导性，建立一系列外源基因高效表达系统;可回收金属和清除环境中重金属污染等。 总之，MT具有很大的开发潜力和无法估量的价值，相信随着人们对MT研究的不断深入，MT的应用也会越来越广泛. 参考文献 [1] MCCARTHY J F, SHUGART L R. 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