银染PCR—SSCP方法检测恶性纤维组织细胞瘤P53基因点突变

银染PCR—SSCP 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 检测恶性纤维组织细胞瘤P53基因点突变 银染PCR—SSCP方法检测恶性纤维组织细 胞瘤P53基因点突变 ,j-7中华肿瘤杂卷1996年1月第18卷第1朝 I!f衄自记磁霉目.窘专" 银染PCR—SSCP方法检测恶性纤维组织 细胞瘤p53基因点突变 李家良杨光华卓甘地 ———— , ———一 /f32s2 ,, 摘要'应用银染PCR—SSCp方法检测常规石蜡包埋恶性纤维组织细胞瘤(MFH)中p53基因点 突变.结果显示,16倒MFH中,9倒SSCP阳性 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明这些病倒相应DNA片段中发生了点突变,其中 第5,6,7,8外显子SSCP阳性出现的例次数分别为1,4,4,3次(2倒转移的病倒同时有6,7,8三个外 显子异常).微波处理ABC法检梗I突变型p53蛋白表达,1o倒为阳性,SSCP与p53蛋白表达的船性 符合率为90.O,p53基因点突变及蛋白表达与MFH的组织学亚型无关.p53基困突变可能在MFH 的发生发展及转移中起作用.本研究结果表明,银染PCR—SSCP是一简便,快速,有效的检测基因点 突变的方法 主题词组织细胞瘤蛋白质p53免疫组织化学聚台酶链反应突变 Detectionofpomtmutationofp53genebysilverstalingPCR-SSCPinparaffin— embeddedmali~aaat fibroushisttocytoma厶 Jialiang,yGuanghua,LiGandi.DepartmentofPathology,WestChina Unive,-sityofMedicalSc埘?Chengdu610041 AbstractSilverstainingPCR—SSCPmethodwasusedtodetectpointmutationofp53genein paraffin— embeddedmalignantfibroushistiozytoma(MFH)tissues.Theabnormalshiftingofthe~inglo— strandedDNA(ssDNA)wasjdentlfiedin9OUtofl6ca9es.ThepositivefigureofSSCPwasl,4,4,3 inexon5.6t7,8,respectively.Themutantp53proteinwasdetectedbymicrowaveoventreatment andAB(=immunobistochemistry.Positivenuclearstainingwasobservedib10C88eS.Thepositivecoinci— dencerateas90.ObetweenSSCPandp53proteinexpresaion.Themutsfioaofp53genewasnot corre]atedwiththesubtypesofMFH.Ourresultsindicatethatdetectionofpointmutationswithfilver stainingPCR— SSCPisconvenienttrapidandreliableinthescreeningofpointmutationofgenes. SubjectwordsHistlocytomaProteinP53[mmunohistocbemistryPolymerasechain— actionMutat[on 大量研究表明+野生型p53基因是一种抑 癌基因,它编码一53000的核结合蛋白[.在芷 常细胞中可能参与细胞GO期进入G1期的 负调节,从而控制细胞的增生和分化.p53基因 的异常主要有点突变,等位基因缺失和基因重 组等,p53基田点突变在肿瘤发生上的重要作 用,已在大多数上皮源性肿瘤中得到证实.. 本课题受国家教委博土点基金及卫生部政策性拨款资助 者单位:610041成都,华西医科大学附属第一医院病理 学教研室[李家良(博士研究生,现工作单位:510089广州,中 山医抖大学病理学教研室),杨光华,李甘地: t l? 而人类第二大类肿瘤,间叶源性肿瘤中p53基 目的作用,目前研究的较少.既往检测基因突变 的方法为序列 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 ,但该法费时,昂贵+尤其不 适用于基层实验室开展.我们用银染PCR SSCP(Single—strandedconformationpolymor— phism,SSCP)法检测石蜡包埋恶性纤维组织细 胞瘤(malignantfibroushistiocytoma,MFH)p53 基因的点突变+并用微波处理ABC法检测p53 蛋自的表达. 材料与方法 1.标本;均取自病理存档蜡块共16例 其中2倒伴转移,1侧转移至肺部,1例为淋巴 结.MFH的组织学亚型分布为:普通型11例, 粘液型2例,巨细胞型2例和炎症型1例. 2.DNA提取:按常规方法进行 3.聚合酶链反应(PCR):p53基因点突变 主要位于4个保守区,即外显子5,8.我们应 用4对引物(由美国FOXCHASE癌症研究中 心张世羽博士惠赠)扩增了含有易发生突变位 点的p53基因4个DNA片段,PCR条件见附 表. 附表PCR扩增P53基因第5,8外显子 的4个DNA片段 霉键一扩增条件 4.SSCP分析:SSCP分析法是在Orita 等"报道的方法基础上加以改进简述如下:取 1oPCR产物,加入8l变性缓冲液(80甲酰 胺,20mmol/LEDTA,0.05溴酚蓝,0.05二 甲苯晴蓝)混匀,96?变性6分钟,冰上骤冷,立 即上样行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(丙烯酰 胺:甲叉丙烯酰胺=49:1),0.5×TBE为电泳 缓冲液,10mA恒电流电泳5,6小时,直至溴 酚蓝接近凝胶底部为止. 5.银染:取下凝胶,置1o乙醇内固定5 分钟;然后用1硝酸脱色3分钟,蒸馏水漂洗 2次;0.12mol/L硝酸银染液染色20分钟,蒸 馏水漂洗2次;加入0.28mol/L碳酸钠一 0.019福尔马林显影液显影10分钟,直至样 本信号足够强而背景不致过高为止,10冰醋 酸固定5分钟.蒸馏水漂洗5分钟后,即可用来 照相及永久保存凝胶. SSCP法检测点突变的原理是:在SSCP凝 ChinJOa~ol,January1996,Vol18,No.1 胶中电泳时,单链DNA的泳动速率主要取决 于二级空间结构,因此,若DNA片段中碱基发 生突变,将会引起单链DNA二级空间结构的 改变,使SSCP凝胶上出现异常移动的电泳带 (即SscP阳性). 6.免疫组化染色:采用微波处理AN; 法进行p53单克隆抗体购自DAKO公司, ABC试剂盒购自Vector公司,抗体稀释度及孵 育时间参考公司 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 . 结果 1.SSCP分析:16例MFH病例,经ssCP 凝胶电泳分析p53基因第5,8外显子4个 DNA片段,发现9例有异常移动的单链DNA 电泳带(56.3).在MFH的不同组织学亚型 之间,p53基因的SSCP虽有差异,但未具备统 计学意义.异常电泳带在5,8外显子中出现的 例次数分别为1,4,4,3次;2例伴转移的MFH 病例,其原发灶组织中同时存在6,7,8三个外 显子异常,而转移灶中则仅见第6外显子异常. 代表性病例SSCP分析结果见附图. DNA J 嚣一-_-d|DNA MpBR322一t-laeIDNA分子量标准{1-未变性出 DNA;2{正常对照DNA,,%SCP阴性;3MFtt病倒.SS- CP阳性I4MFH麝倒瘤旁组织,SSCP阴性I5:MFH病 例,SSCP阳性(肿瘤原发灶)I6MFH病例,SSCP阳性 (肿瘤转移灶) 附圈代表性MFH病例p53基因第8外显子SSCP分 析结果 2.免疫组化染色:应用微波处理ABC法 检测p53蛋白表达,发现10例为阳性 (62.5),阳性产物位于细胞核,p53蛋白表达 掌_毽,弹 .r 0参 M霉舔 中华肿瘤杂志1996年1月第18卷第1期 阳性与MFH组织学亚型无关;2例伴转移的病 例原发灶和转移灶中,p53蛋白的表达无明显 差异;SSCP与p53蛋白检测的阳性符合率为 90.0,另l例p53蛋白阳性的病例,SSCP检 测未见异常. 讨论 p53基因突变在肿瘤发生中的重要作用, 已在大多数上皮源性肿瘤中得到证实.].p53 基因点突变主要位于第5,8号外显子内野 生型1)53蛋白的半衰期为6,20分钟,而突变 型p53蛋自由于构象等改变,其半衰期可延长 20倍左右_.因此,一般认为,用免疫组化法在 肿瘤组织中检测到的p53均为突变型蛋白. 我们应用银染PCR—SSCP方法检测石蜡 包埋MFH组织p53基因的突变,该法与序列 分析相比,较简便,省时,而且其敏感度比溴化 乙锭法高5,10倍0],且可同时对几十例标本 进行分析.因此,特别适用于基层实验室或大样 本DNA突变的筛选,值得大力推广与应用. SSCP分析不仅能了解哪些病例发生了点突 变,而且可将突变定位在基因的某一片段,因 此,对了解肿瘤中p53基因的点突变提供了重 要信息,如需进一步了解点突变发生的位点及 碱基的改变,只需对SSCP分析筛选出的阳性 病例作序列分析.问叶源性肿瘤,由于其病理形 态学改变复杂多样,并有不步相似之处,因此, 从分子生物学水平上了解这类肿瘤的发生发展 很有必要.本研究结果显示,在l6倒MFH中, SSCP的阳性率为56.3,p53蛋白表达的阳 性率为62.5,二者的符合率为90.0.本组 的符合率明显高于其他学者的报道],可能系 我们采用微波处理后,使封闭的p53抗原决定 簇得"暴露,因而增加了免疫组化染色的灵敏 度所致.分析肿瘤的转移灶和原发灶的p53基 因突变情况可以发现,两者虽然有较好的一致 性,但后者的突变情况更为复杂.对这一现象的 可能解释是:肿瘤的原发灶并非源自有单纯遗 传特性的肿瘤细胞的克隆性增殖,而是由多个 遗传特性不同的异质性肿瘤细胞亚克隆组成的 细胞群体,因此可以表现为p53基因多个外显 子同时发生突变.反之,肿瘤转移灶仅源自原发 灶中的一个或数个肿瘤细胞亚克隆,故其p53 基因突变情况较原发灶单纯.而p53蛋白阳性 的l例,SSCP检测阴性,其原因可能是本例 p53基因点突变发生在引物扩增序列范围之 外. 研究结果表明,p53基因点突变及蛋白表 达可能在MFH的发生发展及转移中起作用, 但p53基因突变与MFH发生的确切机制尚有 待进一步探讨.本研究还表明,银染PCR—SSCP 是检测基因点突变的简便,快速,有效的方法, 值得大力推广应用. 参考文献 1BatsakisJG,El-Nagg~AK.p53:fi:[teenyearsafterdis- covery.AdvanAnatPathol,1995.2:71. 2Ambr~RA,VlgnaPAtFiggeJ,eta1.ObservatLorLsontu- m0fandmetastaticsuppressorgenestatuinendometria[ carcinomawithp~rticutaremphasisonp53.Cancer,1994. 79:1686 3HurtimannI.Chaube|tP—B~1])Rttal-J.p59genealt~atlons andp53proteinaccumulat[oaininfiltratingduct~breast ?oF/~&.correlationbetwl~n molecutarbLologytechnique~.ModPathol,l994,7:429. 4InnisMA,GelfandDH,Sni~kyJJ.PCRprotocol:aguide tomethodsandapplieatlopsAc且dPress.SanDiego,l990? l46. 5OritaM.1wahanaH,KHteta1.Dectionof polymorphisros0humanDNAbygelelectrophor~issin gle-stratldedc~aformatlonpolymorphism.ProcNatlAcad SniUSA,l989.86,2766. 6LeongASY.contributionofiramunocytochemLstry stainingini~mourdiagnosis.Histop~tho[ogy,l987,1l: l295. 7FirdayCA.HindsDW,LevhaAJ.Thep59pr呲o—oncoI cnactsappressc~oftrB~5formationC,l989.57: 1083. 8Spagno[oDV,TurbettGR,DixB,eta1.Polymerasechain reactionandsngk—strandconfotmatioapolymorphism lysls(PCR—SSCP)novelnsofdetectingDNAmilts- tLo【.AdvAnatPathol,1994.261. 9Mul[iga~LM,MatlashewakiGJ,ScrableHJ,etaLMecha nlsrr~p59l0ssinhumaasmO『rLas?NatlAndSc[ USA.1990,87|5863.(收稿:1995—06—07)