霉菌和酵母菌检测
霉菌和酵母菌检测 1 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下: 1.1 冰箱:2?,5?。
1.2 恒温培养箱:28??1?。
1.3 均质器。
1.4 恒温振荡器。
.5 显微镜:10×,100×。 1
1.6 电子天平:感量0.1g。
1.7 无菌锥形瓶:容量500ml、250ml。
1.8 无菌广口瓶:500ml。
1.9 无菌吸管:1ml(具0.01ml刻度)、10ml(具0.1ml刻度)。 1.10 无菌平皿:直径90mm。
1.11 无菌试管:10mm×75mm。
1.12 无菌牛皮纸袋、塑料袋。
2 培养基和试剂
2.1 马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基:见附录A中A.1。
2.2 孟加拉红培养基:见附录A中A.2。
3 操作
方法
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3.1 试验前准备
3.1.1 将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、量筒、吸管(1ml、10ml)、
稀释剂等移至操作室内。准备好足够用量，避免操作中出入操作间。 3.1.2 开启无菌室紫外杀菌灯和洁净工作台的空气过滤装置30min。 3.1.3 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外杀菌灯，进入缓冲间，换工作鞋，用消毒液洗手
或用乙醇棉球擦手，穿戴好无菌衣、帽、口罩、手套等。 3.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手、工作台面，再用乙醇棉球擦拭供试品瓶、盒、袋等的
开口处周围，待干后用灭菌剪刀或镊子将供试品启封。 3.2 样品稀释液的制备
根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备样品稀释液。样品稀释液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45?。样品稀释液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。
3.2.1 固体和半固体样品
称取25g样品至盛有225ml灭菌蒸馏水的锥形瓶中，充分振摇，即为1:10稀释液。或放入盛有225ml无菌蒸馏水的均质袋中，用拍击式均质器拍打2min，制成1:10的样品匀液。
3.2.2 液体样品
以无菌吸管吸取25ml样品至盛有225ml无菌蒸馏水的锥形瓶(可在瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
3.3 霉菌和酵母菌计数
3.3.1 用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1ml，沿管壁缓慢注于盛有9ml 稀释液的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面)，振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。
3.3.2 按3.3.1操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1ml 无菌吸管或吸头。
3.3.3 根据对样品污染状况的估计，选择2个,3个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液)，在进行10倍递增稀释时，吸取1ml样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1ml空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。 3.3.4 及时将15ml,20ml冷却至46?的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基或孟加拉红培养基(可放置于46??1?恒温水浴箱中保温)倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 3.4 培养
待琼脂凝固后，将平板翻转，28??1?培养5d，观察并
记录
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。
3.5 菌落计数
肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数。以菌落形成单位(colony forming units，CFU)表示。选取菌落数在10CFU,150CFU的平板，根据菌落形态分别计数霉菌和酵母数。霉菌蔓延生长覆盖整个平板的可记录为多不可计。菌落数应采用两个平板的平均数。
3.6 结果与
报告
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3.6.1 计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数计算。 3.6.1.1 若所有平板上菌落数均大于150CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
3.6.1.2 若所有平板上菌落数均小于10CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
3.6.1.3 若所有稀释度平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算;如为原液，则以小于1计数。
3.6.2 报告
菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。
时，前3位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2位数字，菌落数大于或等于100
后面用0代替位数来表示结果;也可用10的指数形式来表示，此时也按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字。
称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/ml为单位报告，报告或分别报告霉菌和/或酵母数。
附录 培养基和试剂 1 马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基
1.1 成分
马铃薯(去皮切块) 300g
葡萄糖 20.0g
琼脂 20.0g
氯霉素 0.1g
蒸馏水 1000ml
1.2 制法
将马铃薯去皮切块，加1000ml蒸馏水，煮沸10min,20min。用纱布过滤，补加蒸馏水至
1000ml。加入葡萄糖和琼脂，加热溶化，分装后，121?灭菌20min。倾注平板前，用少
量乙醇溶解氯霉素加入培养基中
2 孟加拉红培养基
2.1 成分
蛋白胨 5.0g
葡萄糖 10.0g
磷酸二氢钾 1.0g
硫酸镁(无水) 0.5g
琼脂 20.0g
孟加拉红 0.033g
氯霉素 0.1g
蒸馏水 1000ml
2.2 制法
上述各成分加入蒸馏水中，加热溶化，补足蒸馏水至1000ml，分装后，121?灭菌20min。
倾注平板前，用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基中。
浙公网安备 33021202002483