免疫共沉淀 原理
?因为你IP的时候用的抗体~为了说明是你的抗体特异性的IP下来的东西~而不是其他抗体IP下来的~所以要用IgG作为对照。
当细胞在非变性条件下被裂解时~完整的细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间结合的保持下来。这一事实可被用于检测和确定生理条件下相关的蛋白质-蛋白质之间的相互作用。这种
方法
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叫做免疫共沉淀
IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上~使之与含有抗原的溶液及抗体反应后~beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。 其优点为:,1,相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的~处于天然状态,,2,蛋白的相互作用是在自然状态下进行的~可以避免人为的影响,,3,可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为:,1,可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质,蛋白质相互作用,,2,两种蛋白质的结合可能不是直接结合~而可能有第三者在中间起桥梁作用, ,3,必须在实验前预测目的蛋白是什么~以选择最后检测的抗体~所以~若预测不正确~实验就得不到结果~方法本身具有冒险性。
实验流程为:
(1)转染后24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30min, 细胞裂解液于4?C, 最大转速离心30 min后取上清;
(2)取少量裂解液以备Western blot
分析
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,剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液,4?C缓慢摇晃孵育过夜;
(3)取10μl protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3 次,每次3,000 rpm离心3 min;
(4)将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4?C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;
(5)免疫沉淀反应后,在4?C 以3,000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3,4次;最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液,沸水煮5分钟;
(6)SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。
注意的问
题
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:
(1)细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质,蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2,SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的cocktailer。
(2)使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用
(3)使用对照抗体:
单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗
兔多克隆抗体:正常兔IgG
在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性,应注意以下几点:
(1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;
(2) 要确保抗体的特异性,即在不
表
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达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;
(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。
免疫共沉淀技术路线
准备工作:
预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机
1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS;
7 2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/10个细胞、10cm培养皿或150cm2培养
6瓶,0.5ml/5×10个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)
3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP
管中,4?,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上)
4. 4?,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中
5. 准备Protein A agarose(琼脂糖珠),用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠
6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠(50%),4?摇晃10min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景
7. 4?,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除Protein A珠子
8. (Bradford 法)做蛋白
标准
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曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20?保存一个月)
9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10 μg/μl)
10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异
11. 4?缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育
12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4?缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加2 μl“过渡抗体”(兔抗鼠IgG,兔抗鸡IgG)
13. 14000rpm瞬时离心5s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的RIPA buffer洗3遍,800μl/遍,RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合,可以使用PBS
14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60 μl足够上三道)
15. 将上样样品煮5min,以游离抗原, 抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20?,留待以后电泳,电泳前应再次煮5min变性。
RIPA Buffer配制:
基础成分:
Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性)
NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集)
NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液)
去氧胆酸钠(离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液;避光保存)
注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失。
RIPA蛋白酶抑制剂
苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液,室温保存)
EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100mM的储存液,PH 7.4)
亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20?保存)
抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20?保存)
胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1mg/ml的储存液,分装,-20?保存)
RIPA磷酸(酯)酶抑制剂
激活的Na3VO4(用H2O配制成200mM的储存液,见Sodium Orthovanadate
Activation Protoco)
NaF(200mM的储存液,室温保存)
注意:在准备做磷酸(酯)酶实验的时候,不加磷酸酯酶抑制剂
工作液配制:
配制100ml的modified RIPA buffe:
1. 称取790mg 的Tris-Base,加到75ml 去离子水中,加入900mg的NaCl,搅拌,直到全部溶解,用HCl调节PH值到7.4
2. 加10 ml 10%的NP-40
3. 加2.5 ml 10%的去氧胆酸钠,搅拌,直到溶液澄清
4. 加1 ml 100mM的EDTA,用量筒定容到100ml,2-8?保存
5. 理论上,蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入(抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂各100 µl; PMSF, Na3VO4, NaF各500 µl),但
是PMSF在水溶液中很不稳定,30分钟就会降解一半,所以PMSF应该在使用前现加,其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。
各种成分在工作液中的终浓度:
• Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4
• NP-40: 1%
• 去氧胆酸钠:0.25%
• NaCl: 150 mM
• EDTA: 1 mM
• PMSF: 1 mM
• 抑蛋白酶肽,亮抑酶肽,胃蛋白酶抑制剂: 各1 µg/ml
• Na3VO4: 1 mM
• NaF: 1 mM
通过免疫共沉淀确定结合蛋白
1(用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。
2(将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上4?以最大速度离心15 min。
3(收集上清(约30 ml)并加入30μg的适当抗体,4?摇动免疫沉淀物1 h。
4(加入0.9 ml的蛋白质A-Sepharose 悬液,4?摇动免疫沉淀物30 min。
5(用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物,再重复洗5次。最后,用NETN洗一次。
6(吸出混合物的液体部分。加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中,煮沸4 min。
7(将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中,在10 mA的恒定电流下电泳过夜。
8(通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。
9(从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用1ml 50%乙腈洗两次,每次3 min。
10( 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。
11( 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。
免疫共沉淀原理及实验方法
一 原理
IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A”特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的protein A预先结合固化在argarose的beads上~使之与含有抗原的溶液及抗体反应后~beads上的protein A就能吸附抗原达到精制的目的。
实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同~免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。
其次~要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白~特别是骨架蛋白~缓冲液必须要使其溶解。为此~必须使用含有强界面活性剂的缓冲液~尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面~如用弱界面活性剂溶解细胞~就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果~抗原决定族被封闭~影响与抗体的结合~即使IP成功~也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。
再次~为防止蛋白的分解~修饰~溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂~低温下进行实验。
每次实验之前~首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原~过多则就不能沉降在beads上~残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原~过多则抗原被稀释。欲速则不达~确定好比例很必要
二 准备:
器械
微量高速冷冻离心机
移液枪
旋转盘
电泳设备
vortex震荡器
液氮及组织粉碎器
eppentube
试剂
细胞或组织
蛋白定量kit
SDS电泳试剂
抗体(单抗时选择protein G,二抗选择抗鼠Ig兔血清) PBS
NaN3
proteinA sapharose 试剂配制
抗原蛋白溶解缓冲液
1. RIPA缓冲液 (最终浓度)
1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM)
5MNacl 15ml (150mM)
0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)
20%TritonX-100 25ml (1%)
10% DOC 50ml (1%)
10%SDS 5ml ( o.1%)
TLCK 18.5mg (0.1mM)
TPCK 35mg (0.2mM)
DDW 395ml
toal 500ml
另外~使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精~浓度100mM~-20度遮光保存。注意不易溶于水)
2. NP40 lysis 缓冲液
1MTris-HCL(PH7.4) 5ml (10mM) 5MNacl 15ml (150mM)
0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM) 20%NP40 25ml (1%)
TLCK 18.5mg (0.1mM)
TPCK 35mg (0.2mM)
DDW 450ml
toal 500ml
使用前加1mM的PMSF
注意点:
*Tris缓冲剂PH随温度变化~高浓度盐酸滴定时发热~冷却后PH增高。
*反复使用PMSF要注意保管方法。
*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂~作用温和~~DOC
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