动物肝脏中DNA的提取

实验八 动物肝脏中DNA的提取 一、目的 学习和掌握用浓盐法从动物组织中提取DNA的原理和技术 二、原理 核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形式存在，其中DNA主要存在于细胞核中， 应（4℃）进行， 动植物的DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液（如1mol/L NaCl），但在0.14mol/L 的盐溶液中溶解度降低，而RNA核蛋白则溶于0.14mol/L 盐溶液，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖蛋白和核糖蛋白从样品中分别抽提出来。 将抽提得到的脱氧核糖蛋白用SDS（十二烷基硫酸钠）处理，DNA即与蛋白质分开，可用氯仿将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向含有DNA的水相中加入冷乙醇，DNA即呈纤维状沉淀出来。 三、实验器材 1．猪肝。 2．722型（或7220型）分光光度计。 3．匀浆器 4．量筒50ml（×1）、10ml（×1）。 5．离心机（5000r/min）。 6．离心管。 7．试管及试管架。 8．吸管0.50ml（×2）、1.0ml（×2）、2.0ml（×2）、5.0ml（×1）。 四、实验试剂 1．0.1mol/L NaCl－0.05mol/L柠檬酸钠（pH6.8）。 2．0.015mol/L NaCl－0.0015mol/L 柠檬酸三钠溶液：氯化钠0.828g 及柠檬酸三钠0.341g溶于蒸馏水，稀释至1000ml。 3．95％乙醇（A．Ｒ．）。 4．NaCl固体（A．Ｒ．）。 5．5％SDS溶液：5g SDS溶于100ml 水中。 6．氯仿（A．Ｒ．）。 7．V（氯仿）：V（异戊醇）混合液20：1。 五、操作 1．称取猪肝8g，用匀浆器磨碎（冰浴），加入相当于2倍肝重的0.1mol/L NaCl－0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液，研磨三次，然后倒出匀浆物，匀浆物在4000r/min 下离心10min；沉淀中再加入25ml缓冲液，于4000r/min 离心20min；取沉淀。 2．在上述沉淀中加入40ml 0.1mol/L NaCl－0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液、20mlCHCl3－异戊醇混合液、4ml 5％ SDS使其终浓度为0.41％，振摇30min，然后缓慢加固体NaCl，使其浓度为1mol/L（约3.6g）。将上述混合液在3500r/min离心20min，取上清水相。 3．在上述水相溶液中加入等体积冷95％乙醇，边加边用玻璃棒慢慢搅动，将缠绕在玻棒上的凝胶状物用滤纸吸去多余的乙醇，即得DNA粗品。用蒸馏水溶解并定容至50ml，用二苯胺法测定DNA含量。 4．提纯将上述所得的DNA粗品置于20ml 0.015mol/L NaCl－0.0015mol/L 柠檬酸三钠溶液中，加入1倍体积的氯仿－异戊醇混合液，振摇10min，离心（4000r/min，10min），倾出上层液（沉淀弃去），加入1.5 倍体积95％乙醇，DNA即沉淀析出。离心，弃去上清液，沉淀（粗DNA）按本操作步骤重复一次。最后所得沉淀用无水乙醇洗涤2次，真空干燥。 四、实验结果 是否可见DNA？颜色如何？有无断裂现象？ 实验九 酵母RNA的提取和定性检测 【实验目的】 1．学习稀碱法提取RNA的原理和操作方法 2. 掌握RNA组分的鉴定方法 【实验原理】 酵母中含有丰富的RNA(可达酵母干重的2.62％～10％)，是工业上大规模制备核酸和核苷酸的原料。稀碱法是工业上常用的RNA提取方法，是用稀碱溶液使细胞裂解，使RNA释放到碱液中，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA；或用酸调整pH至2.5，利用等电点沉淀RNA。 RNA用H2SO4水解时，可以生成磷酸、戊糖和碱基，各种成分以下列反应鉴定：①磷酸：用强酸使RNA中的有机磷消化成无机磷，后者与定磷试剂中的钼酸铵结合成磷钼酸铵（黄色沉淀），当有还原剂存在时磷钼酸铵立即转变成蓝色的还原产物—钼蓝。②核糖：RNA与浓盐酸共热时，发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与苔黑酚反应，在Fe3+或Cu2+催化下生成鲜绿色复合物。③嘌呤碱与AgNO3能产生白色的嘌呤银化合物沉淀。 【器材与试剂、】 (一) 器材 1. 150ml锥形瓶 2. 沸水浴 3. 量筒 4. 移液管 5. 吸管及滴管 6. 布氏漏斗和抽滤装置 7. 试管、试管夹及试管架 8. 离心机 9. 滤纸 10. pH试纸 11. 烧杯 12. 天平 13. 酵母粉 (二) 试剂 1. 0.2% NaOH溶液 2. 95％乙醇 3. 冰乙酸 4. 无水乙醚 5. 1.5mol/L H2SO4 6. 浓氨水 7. 5％AgNO3溶液 8. 苔黑酚乙醇溶液 称取苔黑酚6g，溶解于95％乙醇100ml (冰箱中可保存1个月)。 9. FeCl3的浓盐酸溶液 取10％FeCl3 2ml，与浓盐酸400ml混合。 10. 定磷试剂 （1）17％H2SO4溶液 （2）2.5％钼酸铵溶液 （3）10％抗坏血酸溶液(贮存于棕色瓶中，溶液在冰箱放置可用1个月。溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄色或棕色则已失效。) 临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合(限当天使用)： 17%H2SO4:2.5％钼酸铵:水:10％抗坏血酸=1:1:2:1（V:V） 【实验步骤】 （一） RNA的粗提取 1. 取酵母粉5g，置于100ml烧杯中，加入0.2％NaOH溶液20ml，搅拌成悬浮液。 2. 将悬浮液在沸水浴中加热30min，冷却至室温，分两管4000rpm离心10min。 3. 将上清液缓缓倾入95%乙醇30ml中，注意边搅拌边缓缓倾入,用冰乙酸调pH值至2.5。静置，待RNA沉淀完全后，3000rpm离心3min。 4. 弃上清，以95％乙醇10ml洗涤沉淀，3000rpm离心3min。再用95％乙醇10ml洗涤沉淀，并移入布氏漏斗中抽滤。 5. 用无水乙醚洗涤沉淀2次，每次20ml，于布氏漏斗中抽滤至沉淀干燥。 (二) 水解RNA 将提取的RNA加入5ml 10% H2SO4中，沸水浴加热10min,使RNA水解。 (三) RNA组分鉴定 1. 嘌呤碱：取试管1支，加入水解液1ml，浓氨水2ml，5％的AgNO3 1ml，观察是否产生白色絮状嘌呤银化物沉淀（放置后可能变为棕黑色）。 2. 戊糖：取试管1支，加入水解液1ml，苔黑酚-FeCI3溶液1ml，在沸水浴中加热，观察试管中颜色变化。 3. 磷酸：取试管1支，加入水解液1ml和定磷试剂1ml，在沸水浴中加热，观察试管中颜色变化。 【要点提示】 1.苔黑酚(又名地衣酚,3,5-甲苯二酚) 鉴定戊糖时特异性较差，凡属戊糖均有此反应。微量DNA无影响，较多DNA存在时有干扰作用，在试剂中加入适量CUCl2·2H2O可减少DNA的干扰，甚至某些戊糖持续加热后生成的羟甲基糠醛也能与地衣酚反应，产生显色复合物。 2. 苔黑酚鉴定戊糖时也可用下列配方： (1)苔黑酚试剂：FeCI3 0.1g溶于浓盐酸100ml，摇匀，贮存备用。使用前加入苔黑酚0.476g。 (2)苔黑酚试剂：苔黑酚0.1g溶于浓盐酸100ml中，再加FeCI3 0.1g（临用前配制）。 3．RNA中磷酸的鉴定方法有两种，原理如下： （1）钼酸铵试剂鉴定： 钼酸铵试剂：钼酸铵2g溶解于10％的硫酸100ml。 强酸使RNA分子中的有机磷消化成无机磷，使与钼酸铵试剂中的钼酸铵结合成磷钼酸铵（NH4）3PO4·12MoO3（黄色沉淀）。 PO43-+3NH4++12MOO42-+24H+=(NH4)3 PO4·12MOO3·6H2O↓+6H2O (2)定磷试剂鉴定：上述反应当有还原剂存在时，MO6+被还原成MO4+，此Mo4+再与试剂中的其它MO42-结合成MO（MOO4）2或MO3O8,呈蓝色，称为钼蓝。在一定浓度范围内，蓝色的深浅和磷含量成正比，因此也可用分光光度法定量测定RNA。 4.用乙醇沉淀RNA时，需用酸中和稀碱，可以加冰乙酸至pH2.5，也可以直接用酸性乙醇（浓盐酸1ml加入乙醇100ml中）至溶液pH至2.5。 5.用AgNO3鉴定RNA中的嘌呤碱时，除了产生嘌呤银化物沉淀外，还会产生磷酸银沉淀，磷酸银沉淀可溶于氨水，而嘌呤银化物沉淀在浓氨水中溶解度很低，加入浓氨水可消除PO43+的干扰。 【思考 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 】 1.用苔黑酚鉴定RNA时加入Cu2+或Fe3+的目的是什么？ 2.用AgNO3鉴定嘌呤碱基时加入浓氨水的目的是什么？