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【doc】MNP—NAG底物测定尿NAG方法的建立【doc】MNP—NAG底物测定尿NAG方法的建立 MNP—NAG底物测定尿NAG方法的建立 彝M询镌上海第二医科大学霄 Act?u…tasMed?n自1lssec.ndeshhal』 7友,,/ ,,MNP— NAG底物测定尿NAG方法的建立 上海第二医科大学科技中心实验室(2.0025)施强华张建华桂生 f-z 摘要应用自行合成的底物间甲氧基硝基乙烯基苯基N一乙酰彝基卢D葡萄糖苷(MNP—NAG)测 定尿NAG活性.以NAG酶作为标准.建立了底物冷冻干燥测定管试剂盒.色原MNP在碱性条件下呈...

【doc】MNP—NAG底物测定尿NAG方法的建立
【doc】MNP—NAG底物测定尿NAG方法的建立 MNP—NAG底物测定尿NAG方法的建立 彝M询镌上海第二医科大学霄 Act?u…tasMed?n自1lssec.ndeshhal』 7友,,/ ,,MNP— NAG底物测定尿NAG方法的建立 上海第二医科大学科技中心实验室(2.0025)施强华张建华桂生 f-z 摘要应用自行合成的底物间甲氧基硝基乙烯基苯基N一乙酰彝基卢D葡萄糖苷(MNP—NAG)测 定尿NAG活性.以NAG酶作为 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 .建立了底物冷冻干燥测定管试剂盒.色原MNP在碱性条件下呈红色不 受尿色干扰用MNP—NAG的最适反应pH4.6.批内变异系数CV<2蟛批间Cv<10.-~PNP终点法 比较r?0.98测定5"80例正常人尿NAG酶活性参考范围0.47,1.05U/mmolCr,并测定了部分肾脏病患者. 具有重要的意义 关键词卢DN乙酰氪基葡萄糖苷酶:间甲氧基硝基乙烯基卢DN一乙酰氪基葡萄糖苷: 肾疾病 中田号R446.122 尿N一乙酰口一D一氨基葡萄糖苷酶(NAG)广 泛存在于细胞的溶酶体内.肾脏是其贮存的主要器 官之一,以近曲小管上皮细胞中含量最高.尿 NAG是肾毒性损伤敏感指标,对肾移植排异,高 血压和糖尿病疾病引起的肾小管损害具有重要的诊 断价值目前检测NAG活性方法有两大类一类 是荧光法.需要荧光分光光度计,使用上受到一定的 限制.另一大类是化学显色法该法空白读数 高(~max400nm)易受尿中色素干扰需要每份样品 作空白.实验操作复杂我们自行合成MNP— NAG,作为尿NAG测定底物.采用的色原呈红 色(3.max505nm),排除了尿液色原的干扰摩尔吸光 系数(27800)较PNP(MW17500)明显提高,提高了 方法灵敏度. 材料与方法 试剂 1.MNP—NAG自行合成.NAG标准:Boe. hringer产品14,5U. 2.NAG制备取正常小鼠肾脏,用10mmol/L 磷酸盐缓冲液(pH6,8)制成匀浆,在4?离L,30min (3000r/min),取上清液.每ml上清液中加入叠氮钠 100~I,PBS1g,BSA100mg.加入适量的蒸馏水以 l4.5U/L标准酶调节至16.7U/L. 3.底物反应液准确称取MNP—NAG90mg, 加入到100ml沸腾的蒸馏水中,lmin后,迅速置冰浴 施强华:男,1952年2月出生.讲师.医学学士,管理学硕士 中冷却,过滤,收集滤液,加入lmol/L的盐酸0.5ml, 4?冰箱保存. 4.底物冷冻干燥反应管取底物反应液lml,加 入pH4.650mmol/L的柠檬酸缓冲液0.5m1.混匀 干燥.NAG测定时只需加入1.5ml蒸馏水溶解即可 使用. 5.终止液缓冲液为pH9.8,50mmol/L的硼酸 缓冲液.称取2.36g1~酸钠,取85mlO.2mol/L氢氧 化钠加蒸馏水至500ml. 6-尿肌酐测定Jafja'法 7.尿样本随意尿一20?贮存测定时37?水 浴溶解. 方法 1,原理在37?pH4.6条件下,NAG酶水解 MNP—NAG糖苷链游离出MNP—NAG,可在 505nm波长MNP的吸光度.1000ml尿液中NAG酶1 rain水解MNP—NAGlpmol/L的MNP为1U酶活 性,简称U/L(见反应式图).为了减少尿量变化对酶 浓度的影响常规分析结果以酶单位与尿肌酐比值 方式 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示:U/mmol?Cr. NAG 尿NAG酶 MNP—NAG 反应式田 2.操作步骤见表1. N H 上海第二医科大学 Act,aUniversicatisMedicirtalJsSe~ondaeShanghai 裹1撮作步囊裹1) 3.计算方法 样本测定fu/L1睾×H5 As—A 结果 酶最适条件选择1.酶反应最适pH:选择pH 3.8,4.0,4.2,4.4,4.6,4.8,5.0,5.2/k种柠檬酸缓冲 液,其它条件不变.根据测定步骤对16.7u/LNAG 标准酶进行测定,最适pH4.62.底物浓度选择:根据 ; 一 g 景 围1标准曲缱 正常值测定正常人8O侧,男40倒,女4o例,年 龄20~60岁,均无肾脏疾患,高血压,糖尿病史.未曾 服用肾毒性药物常规尿蛋白定性和尿沉淀镜检验 均呈阴性,正常值尿NAG活性以NAG(U/L)与肌酐 (Cr)比值(U/retoolCr)表示,尿NAG排泄值,土s 为0.76土0.29 疾病组NAG测定随机测定了76例各种肾疾 患病人的尿NAG(表2)三组患者尿NAG活性均明 显高于正常对照组. 测定方法中所列条件,改变底物浓度为0.5,1.0,1.5, 2.0,3.0mmol/L.对16.7U/LNAG标准酶进行测 试最适底物浓度为2.0mmol/L.3.反应时间与酶促 反应的关系:根据方法所列条件,选择5,15,20, 25,30,40,5O,60,70,80,90,100,ll0min酶反应时 问,对16.7U/LNAG标准酶进行测试在40min内 保持稳定的线性,我们选择30min为测试时间. 精密度与正确性试验1.精密度:为了判断方法 的精密度.以17U/L和110U/L两种浓度尿样本,8复 管测定求得的批内变异(Cv)为2.3和1.8对 ,求得批问 上述两种酶浓度标本在2周内共测定8次 变异(CV%)分别为8.13晰和6.2%.2回收率:为了判 断方法的正确性,取含量为9u/L尿样本5份在每份 样本中分别加入相当于51.96,25.98,12.99,6.49, 3.24u/L五种NAG酶.通过理论与实际测定值计算 回收率,分别为100,963,1001.99.6 110.8%.为101.3%3.标准曲线:以3--5OU/L标准 酶制备标准曲线,结果见图1.4.与PNP的比 较:MNP—NAG底物测定法与PNP—NAG测定方 法比较.r—O.98,结果见图2 3 025 主 山 量l5, 5 D 围2PNP—NAG与MNP—NAG方法比较 裹2碌NAG测定~(U/mol'Cr.?s1 与正常组比较:p<O001;p<0.O1 讨论 本文提供了一种简便可靠的尿NAG比色测定 施强华等MNP—NAG底物测定尿NAG方法的建立 法.结果与Yllen报道参考值均数和标准差(0.7 ?O.27)相符合 用本法测定肾小管病变的肾病病人(白蛋白 <26.8mg/mmolCr)8例,三类病人的尿NAG均高 于正常组,经检验均呈显着差异,提示NAG测定对 肾小管损伤的病变是一种灵敏的指标. 尿NAG测定对肾小管损伤诊断具有重要价值, 国内普遍采用的PNP—NAG作为底物的测定方法. 由于其产生的色原为黄色(^max40Onto),与尿液颜 色相似,故空白读数较高,且灵敏度低.为了排除尿 液本身色原对测定的影响,国外选择"MNP—NA G和MCP—NAG对尿NAG测定,其产生的色原 为红色(2505nm)和紫色(2508nm),从而排除了尿 色干扰.我们采用MNP—NAG底物测定NAG活 性检测时只需选择任意一个尿样本空白,简化了测 定方法.同时,我们用检测测定管提高了MNP— NAG"的溶解度,为临床大量检测样本提供了方便. 在测定尿NAG时,采用产生色原作为NAG标 准,当底物浓度或仪器状态略有改变时由于酶反应 达不到摄适条件,测定的吸光值会发生变化,从而影 响了测定结果的正确性.我们采用酶标准进行测定, 排除了因底物浓度变化引起的结果偏差. 本法产生的色原(MNP)~碱性条件下,随着时 间的增加色泽略有下降趋势.在0.5h内下降1%因 此,在测定时最好严格控制比色时间. 参考文献 1PriceRG.Urinaryemzymes.nephrotoxicityandrenal Toxicology,1982;23:99 2.DanceN.TbeexcretionofN—acetyl一口一D—glucosa- minidaseand口一galactosidasebypatientswithrenal diseaseClinChimActa.1970;27:89 3CorbettCRR.A5一yearexperienceofN—acetyl — p—D,ucosaminidasefordiagnosisofrejectionin renaltransplantati0n.TransplantProceed,1979; 11:1226 4MansellMA.MeasurementofurinaryNAGandthe detectionofrenovascularhypertension.ContribNe. phrol,1978;11:202 5.YuenCT.ColorimetricassaysforN—acetyl一一gluco- saminidaseand口一D—galactosidaseinhumanurine usingnewly—developedw—nitrostyrylsubstratesClin ChimAeta,1982;124:195 f1997—05—16收稿.19971L19修回) ColorimetricAssaysforN—acetyl一8一D—glucosamindasein HumanUrineUsing2一methoxy一4一(2'一nitroviny1)一 phenyl一2一acetamido一2一deoxy一口一D—glucopyranoside ShiQiangHua,ZhangJianhua,ZhangGuisheng Lab'ouratoryforScience&TechnologyCenter.ShanghaiSecondMedicalUniversity,Shanghai(200025) AbstractThisarticleintroducesthemeasurementofurineNAGactivityusingsubstrate MNP—NAG.N—acetyl一卢一D—glucosaminldase(MNP— NAG)wassynthes~edbyourlaboratory. ThecorrespondinglyophilizedsubstratetesttubekitwasalsosetupwithreferenceNAGinalkaline condition,thecolor— derivedMNPappearsredandisnotinterferedbythecolorofurine.Themost optimalreactionpHofMNP—NAGis4.6.TheintraassayCVislessthan2%andtheinter— assayCV is】 essthan1O.Thecorrelationcoefficientis0.98comparingwithPNPterminationmethod.We measuredtheurineNAGactivityof8Onormalpersonsandthereferencevaluerangeform0.47to1.05 U/mm01.Cr KeywordsN—acetyl一口一D—glucosamindase;2一methoxy一4一(2'nitro—viny1) 一 phenyl一2一acetamido一2一deoxy——D—glucopyranoside;renaldisease
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上传时间:2017-11-15
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