模拟失重对胃粘膜上皮细胞增殖和周期的影响

模拟失重对胃粘膜上皮细胞增殖和周期的影响 模拟失重对胃粘膜上皮细胞增殖和周期的 影响 第18卷第6期 2005年12月 航天医学与医学 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 SpaceMedicine&MedicalEngineering VoI.18No.6 Det.2005 模拟失重对胃粘膜上皮细胞增殖和周期的影响 朱鸣,吴本俨,聂捷琳,李莹辉 (1.解放军总医院消化科,北京100853,2.航天医院工程研究所,北京100094) ? 研究快报? 摘要:目的探讨模拟失重对胃粘膜上皮HFE-145细胞增殖和周期的影响.方法采用回转器模拟失重, 用免疫组化法观察HFE一145细胞PCNA 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达的变化,用流式细胞仪测定细胞周期.结果回转器模拟失 重后,与正常对照组相比,回转组HFE-145细胞24,36,48及72h的PCNA抗体阳性细胞比率无明显差 异,12h回转组阳性细胞比率明显减少(P<0.05).24,36,48,72h回转组HFE-145细胞的细胞周期分 布与对照组无明显差异,12h回转组G0+G期细胞比例明显增多(P<0.05),S+G2+M期细胞之和 显着减少(P<0.05).结论回转器模拟失重使胃粘膜上皮HFE-145细胞在12h时出现了细胞周期阻 滞和增殖抑制. 关键词:失重模拟;胃粘膜细胞;细胞增殖;细胞周期;免疫组化法 中图分类号:R854文献标识码:A文章编号:1002-0837(2005)06-0465-04 EffectsofSimulatedWeightlessnessonCellularMorphologyandCeuC)}cleCeuLineHFE-145.ZHU Ming,WUBen-yan,NlEJie-lin,LIYing-hui.SpaceMedicine&MedicalEngineering,2005,18(6):465 ~ 468 Abstract:Obiweightlessnesslhuma.ie n ctiveTonvestigate I th I eeffect - sof . simulatedonproliferationandcel cycleofgastricmucosacelineHFE145MethodArotatingclinostatwasusedtosimulated weightlessness.Theexpressionsofproliferatingcellnuclearantigen(PCNA)wereexaminedbyim- munohistochemicafstain.Thechangesofcelfcyclewereexaminedbyacytometer.ResultCom- paredwithcontro1.theexpressionofPCNAofcelllineHFE-145showednosignificantchangeafter 24h,36h,48hand72hsimulatedweightJessness,butdecreasedsignificantlyafter12hsimulated weightlessness(P<0.05).Ascomparedwithcontrol,thecellcyclesofcelllineHFE-145in24h, 36h,48hand72hgroupsshowednosignificantchange,butthecellsjnGn+GIphaseafter12h simulatedweightlessnessincreasedsignificantly(P<0.05),andthecellsinS+G,+Mphase de— creasedsignificantly(P<0.05).ConclusionTheproliferationofHFE-145celliSinhibited duringsimu— latedweightlessnessonaclinostatfor12h.TheconversionofcellfrOmG1phasetoSphaseiSa lso blockedby12hsimulatedwelghtlessness. Keywords:weightlessnesssimulation;gastricmucosacells;cellproliferation;cellcycle;im munO— histochemistry Addressreprintrequeststo:WUBen.yan.DepartmentofGastrOenterOlOgy,GeneralHospi talofChi— nesePLA.Beijing100853.China 太空飞行对人类来说是一个全新的领域,而 人体细胞在失重状态下的变化目前也不甚清楚. 许多实验证明单细胞对重力敏感,在某些细胞中 重力减少导致一系列改变,如:基因表达,细胞增 殖,信号转导和细胞骨架的结构等?.但是,迄 今没有见到对失重或模拟失重状态下胃粘膜上皮 细胞的研究.回转器模拟失重为我们提供了一个 新的模拟失重的模型和方法J,使我们可以从另 一 个角度去观察和了解胃粘膜上皮HFE-145细 胞的增殖和周期的变化. 收稿日期:2oo5-o7-o7 通讯作者:吴本俨benyanwu@vipsina.com.cn $基金项目:总装备部预研项目(51400020204JB1002) 万法 细胞株胃粘膜上皮细胞株HFE145细胞 由第一军医大学肿瘤研究所馈赠. 主要化学试剂DMEM培养基,胰蛋白酶及 灭活小牛血清:华美公司.增殖细胞核抗原(pro- liferatingcellnuclearantigen,PCNA)抗体:中 山公司.PV9000:中山公司.DAB染色液:中山 公司. 主要仪器BH2Olympus显微镜.MG3型 回转器,中国科学院生物物理所研制.FACSCali- bur型流式细胞仪:B-D公司,美国. 细胞培养接种HFE-145细胞至培养瓶中 466航天医学与医学工程第18卷 (20ml/瓶,如做HE染色,测PCNA抗体或 TUNEL法检测凋亡时,瓶底贴细胞爬片),密度2 X10/瓶,加入DMEM培养基(含100ml/L灭活 小牛血清,100u/ml青霉素及100i~g/ml链霉素 的双抗,50g/L碳酸氢钠,调pH至7.2)5mI.24 h待细胞完全贴壁后,瓶中灌满培养基,排气后将 瓶口密封,将其随机平分为两组.一组放置在回 转器上,并把回转器放置在培养箱(30r/min,37 .C)中,另一组放置在培养箱中正常生长作为对 照. 回转器模拟失重后的细胞PCNA抗体阳性 比率的检测分别在模拟失重12h,24h,36h, ,取出细胞爬 48h和72h后,两组各取5瓶细胞 片,用pH=7.4磷酸盐缓冲液(PBS)清洗,700 ml/L乙醇固定30rain以上.PBS清洗5rain 后,采用二步法免疫组化法检测PCNA抗体.细 胞爬片用30ml/L过氧化氢孵育10min,PBS洗 3次,每次5min.用正常山羊血清封闭30min. 滴加一抗,一抗稀释度为1:300,4.C过夜.PBS 洗3次,各5min后,滴加PV一9000试剂1,37oC 孵育30min.PBS洗3次,各5min后,滴加PV一 9000试剂2,37?孵育1h.PBS洗3次,各5 min后,DAB显色.苏木素复染3min,洗片.梯 度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树脂封片.在200 X高倍镜下观察5个能代表总体染色情况的区 域,共计1000个细胞,计数其阳性细胞百分比. 阴性对照用和第一抗体同比稀释的正常兔 血清代替第一抗体染色. 回转器模拟失重后细胞周期的分析分别在 A 模拟失重12h,24h,36h,48h和72h后,两组 各取5瓶细胞,以胰蛋白酶消化后离心收集细胞, 悬于1ml700ml/L冷乙醇,4.C冰箱中保存至 少24h.测定时,将细胞离心(1500r/min,5 min)收集,用PBS清洗.悬细胞于50mg/L的 核糖核酸酶(ribonuclease,RNase)A中30rain. 离心后加入碘化丙啶(PI,50mg/L)染色30min. 在流式细胞仪上进行细胞周期测定. 统计分析用state7.0统计分析软件进行 统计.分别以t检验比较回转组和对照组PCNA 阳性细胞百分比和各细胞周期所占比率的差异. P<0.05为统计学有显着差异. 结果与讨论 PCNA阳性染色位于细胞核,呈颗粒样或片 状棕黄色染色(图1A,B).与正常对照组相比, 回转组HFE一145细胞24,36,48及72h的PCNA 抗体阳性细胞的比率无明显差异;12h回转组 PCNA抗体阳性细胞比率显着低于对照组(表1, P<0.05).说明HFE一145细胞在模拟失重前期 的增殖被抑制,但在模拟失重的后期得到了恢复. 24,36,48,72h回转组HFE一145细胞的G+G. 期,S期和G+M期细胞比例与对照组相比无明 显差异,12h回转组G.+G期细胞比例较对照 组明显增多(表2,P<0.05),单独比较12h组的 S期及G+M期细胞比例,无统计学差异,但S 期与G:+M期细胞之和较对照组显着减少(表 2,P<0.05).说明HFE一145细胞仅在12h时发 生了细胞周期阻滞,较多的细胞停留在G.+G. B 图112hPCNA的表达(X200) Fig.1ExpressionsofPCNAofHFE?145cellafter12h(X200】 A.clinostat;Bcontrolgroup 第6期朱鸣,等.模拟失重对胃粘膜上皮细胞增殖和周期的影响467 表1模拟失重作用下HFE一145细胞的PCNA表达的变化(?S,%,n=5) Table1ExpressionchangesofPCNAofHFE-145cellundersimulatedweightlessness(?s,%,n=5J 表2模拟失重作用下HFE-145细胞的细胞周期的变化(i?S,%,n:5) Table2ChangesofcellcycleofHFE-145cellundersimulatedweightlessness(?s,%,n=5J Note:P<005.ascomparedwiththesameitemincontrolgroup 期,此后,与对照组则无明显差异. 回转器是一种地面模拟失重的仪器,其工作 原理是:在样品回转实验时,样品在电机的带动下 不停地绕水平轴匀速旋转,重力相对于样品的方 向连续改变,在适当转速下,样品总是来不及对重 力做出响应,从而达到模拟微重力条件下生物效 应的效果j.本实验为了最大程度地减少培养 液和细胞表面的相互作用,把回转器上细胞培养 瓶中灌满培养基,排气后将密封瓶LI.但是,如密 闭时间过长,将影响细胞的营养和生长,因此设定 的实验最长时间为3d.因为大多数细胞周期时 间为l0,48h,所以,本实验分l2h,24h,36 h,48h和72h5个时间段.PCNA的表达与细 胞周期有关,能反映全部细胞的增殖情况l4J.流 式细胞术可以通过荧光探针对细胞进行相对 DNA含量测定,分析细胞周期各时相细胞的百分 比J.故本实验将PCNA作为衡量细胞增殖水 平的客观指标,并用流式细胞仪测定细胞周期. 以往对失重状态下其它一些正常细胞的研究 为:人骨髓CD34+细胞在回转器模拟失重后,细 胞周期的进行被显着抑制;成骨细胞增殖受到 抑制,G.期细胞显着增多,而S期细胞则显着减 少,G:+M期的细胞也明显少于对照组J.人血 管内皮细胞增殖的活力明显下降,出现细胞骨架 的改变J.太空飞行5d后,大鼠空肠粘膜细胞 的增殖不受影响,有丝分裂的数据与对照组无差 异J.可见,失重对一些其它正常细胞的影响可 以是抑制增殖,细胞周期阻滞,但是,也有些细胞 在失重后增殖不受影响.尤其是有研究证实太空 飞行5d后,大鼠空肠粘膜细胞的增殖不受影响, 这与本实验观察到的胃粘膜正常上皮细胞的结果 相似,说明胃肠道粘膜对较长时间的失重或模拟 失重可能会逐渐适应. 到目前为止,失重引起细胞变化的具体原因 和途径还不是很清楚.有研究推测,可能是因为 重力的变化打破了由细胞间连接和细胞骨架建立 的受力平衡,然后,通过一些相互联系的因素导致 细胞生物学行为的变化.首先,有细胞骨架的破 坏和重分布,这种重分布可间接作用于细胞间的 连接和细胞外基质,细胞形态和结构的变化可导 致一系列细胞内信号转导系统的反应,进而引起 基因表达的变化,最终表现为细胞生物学特征的 改变,如增殖和周期的变化.但是,可能由于 胃粘膜上皮细胞的更新速度较快或适应重力变化 的能力较强而建立了新的受力平衡,所以,只是在 l2h回转组发生了细胞增殖和周期的改变,而在 模拟失重的后期,增殖和周期得以恢复. 失重对细胞的影响是多方面的,而且对于不 同的细胞,其影响也不尽相同.本实验显示回转 器模拟失重可引起胃粘膜上皮HFE一145细胞在 模拟失重l2h时出现增殖减少和细胞周期阻滞, 在模拟失重的后期恢复正常.说明在3d内,回 468航天医学与医学工程第18卷 转器模拟失重胃粘膜上皮细胞影响不明显.诚 然,回转器模拟失重只反映了细胞的变化,并不等 同于生物体失重时的变化,但是,我们希望本实验 能对失重或模拟失重状态下人体消化系统的研究 提供一些参考. [2] [3] [4] [参考文献] PippiaP.MeloniMA,CossuG,etalCellularadhesion inneoplasticandsyngeneicnormaJcellsunderaltered gravitationaJconditions『J].JGravitPhysiol,1998,5 (1):165?166. WANGXinmin.RENQingrong.FUShImi.eta1.Devel? opmentandapplicationofclinostatforSjmulationofmi. crogravitybiologicaleffects『J1.ActaBiophysicaSini- ca.1997.13(4):691-694 ZHANGYuxia.Thedevelopmentoftheresearchofreg- ulationofcelIcyclefJ].SectionofGeneticsForeign MedicaISciences.2001.24(5):262-266 ZHA0Lan.WUKun.QJUJunTherelationbetween expressionofFasandPCNAandjnvasion.metastasis ofgastricadenocarcinoma『J1JHealthToxicol,2002, [5] [6] [7] [8] [9] [10] 16(2):76.78. MAHongxing,ZHANGChunbin,WANGJingbing,et alTheprincipleandclinicaJapplicationofflowcytome try『J].ChineseJournaJofPrepotencyandHeredity. 2003,11(4):145-146. PlettPA,AbonourR.FrankovitzSM.eta1.Impactof modeledmicrogravityonmigration,differentiation,and celJcyclecontroIofprimitivehumanhematopoieticpro. genitorcells[J].ExpHematol,2004,32(8):773_781. 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