【doc】趋化因子新变异体MPIF—1β重组蛋白的纯化和活性分析

【doc】趋化因子新变异体MPIF—1β重组蛋白的纯化和活性分析 趋化因子新变异体MPIF—1β重组蛋白的 纯化和活性分析 免疫学杂志第18卷第4期20o2~7月IMMUNOLOGICALJOURNALVol18No4July2O02.311. [文章编号】1000-8861(2m2)o4-o311-o4 趋化因子新变异体MPIF.1p重组蛋白的纯化和活性分析 范慧,莫晓宁,曹丽,宋泉声,黄大无,马大龙 (1.北京医科大学联合生物工程公司,北京100083;2.北京大学人类疾病基因研究中心,北京100083) [摘要】目的为深入研究趋化因子新变异体MPIF-lf3的结构与功能,利用 pKPL3a-MPIF-1~ 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达质粒进行原核表达,纯 化工艺研究及活性检测. 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 MPIF-lf3重组蛋白以包涵体形式存在,占总菌体蛋白的15%,工程菌经超声破碎,包涵体洗涤, 变性,复性,肝素Sepharo~CL-6B亲和层析,cMSepharoseFastFlow和Sephocryl$-200层析分离获得目的蛋白.结果还原SDS- PAGE分析相对分子质量15000U,纯度99.O%,纯化倍数6.6倍,总回收率9.07%.体外生物学活性检测证明MPIF-I~重组蛋 白对小鼠骨髓集落形成具有抑制作用,对U937细胞具有趋化活性,且呈一定的剂量依赖关系.结论建立了简便可行的 MPIF-lf3重组蛋白纯化路线,初步证明了MPIF-lf3的生物学活性. [关键词】趋化因子;MPIF-I~;MPIF-1;重组蛋白 [中图分类号】R392[文献标识码】A PurificationandfunctionalcharacterizationofrecombinantMPIF一邛,anovelisoformofhuman chemokine呷一1 FANHui.,MOXiao.ning.,CAOu,SONGQua.一sheng,HUANGDa.,MADa-long2 (1.neijngMedicalUniversityUnionIncorporation,Being100083,China;2.PekingUniversi tyCenterforHuman D/~etxseGenomics,ne0/ng100083,Ch/na) [Abstract]obleetiveInordertostudythestructureandfunctionofMPIF-I~,anewisoformofhumanMPIF-I~,recombinantprotein wasexpressed/nE.co/ianditspurifyingprocedurewasdetermined.MethodsItwasfoundthattherecombinantproteinpresentedasinclu— sionbodyandhadanexpressinglevel叩 to15%.Forthepm4fieationoftheMPIF-lf3,theinclusionbodyWaswashed,denaturedandlena— tured,andthenthreestepsofchromatography(heparinaffmitychrorruatography,CMionexchangeandSephacrylS-200sizeexclusion)Wel'e carriedouttOobtainpurifiedprotein.ResultsSDS-PAGEanalysisshowedasinebandatmolecularweight15000U.Thepurityoftarget proteinWas叩 tO99.O%,thetotalrecoveryrateis9.cr7%.Bioassay/nv/troshowedMPIV-I~couldinhibitmouseLPP-CFCandattractU937 cellswithdose-dependentInallner.C啊lcIIl0璐 AsimplymethodofpurifiedrecombinantMPIF-I~proteinisestablishedanditsbiologicalac— tivityhasbeenfound. 【Keyw吣]chemokine;MPIF-I~;MPIF-1;recombinantprotein 髓样祖细胞抑制因子一1(myeloidprogenitorinhibi— toryfactor1,MPIF-1)属趋化因子家族成员,具有趋化 单核巨噬细胞和抑制骨髓细胞集落形成的效应,目 前已作为肿瘤化疗的造血保护剂进行?期临床实 验….本实验室在克隆MPIF-1时发现,在人肝脏 cDNA文库中存在一种MPIF-1的变异体,比MPIF-1 多51个碱基(17个氨基酸),其余序列均相同,将其 命名为MPIFd~.本室利用基因重组技术成功构建 了MPIFd~的原核表达质粒,转化大肠杆菌并获得 表达(待发表).本文进一步对iPIrq~原核表达蛋 白纯化工艺进行研究,建立了一套简便可行的纯化 路线,并对其生物学活性进行了初步探讨. 1材料与方法 1.1质粒与茵株MPIF-l~质粒表达载体pKPL3a- MPIFI~为本室构建L2J,大肠杆菌Pop2136为C600衍 生株(含CI857,编码温度敏感阻遏蛋白),为温控 表达菌,由Raiband博士惠赠. 1.2设备及介质低压层析Gradifrac及层析介质 肝素SepharoseCL-6B,CMSepharoseFastFlow. [收稿日期]2oo2-03.12;[修回日期】2002.04-27 [作者简介】范慧(1955一),女,辽宁锦州市人,主管技师,大专,主要从事重组蛋白的 纯化工艺研究及中试放大. Tel:(010)62091417;E-maihFanfifi2(D2cn@yahoo.o哪.cn ?312?第l8卷免疫学杂志2OO2年7月 SephaerylS一200均为Phamarcia公司产品 1.3MPIF一113重组蛋白表达与纯化将质粒转化 Pop2136大肠肝菌,挑取单个阳性克隆,30?摇床扩 增生长至A鲫为0.6时升温至42?诱导表达3.5h 收获工程菌.10000×g10min离心收获沉淀菌体; 包涵体洗涤参照参考文献[3]进行.包涵体用 8蟓素(20mn~l/LB—ME)变性,60?水浴3h 至变性完全.30000×g离心12min取上清液过肝 素SepharoseCL-6B亲和层析,于0.5mol/LNaCI洗出 目的蛋白.再按1:10稀释复性至pH7.225mmol/L PB缓冲液经CMSepharoseFastFlow阳离子层析分离 收集0.28mol/LNaCl洗脱峰.再经S印hacrylS一200, pH7.2PBS平衡凝胶过滤柱并分离收集MPIF-113蛋 白峰. 1.4MPIF-113重组蛋白鉴定蛋白定量用Lowrry 法.还原SDS-PAGE3%浓缩胶,15%分离胶分析 蛋白纯度及分子质量.氨基酸成份分析采用酸解法 于日立885—50型氨基酸自动分析仪进行测定. 1.5MPIF-113蛋白的生物学活性检测 1.5.1MPIF一113对小鼠骨髓细胞集落抑制实验:取 6周龄小鼠,断颈处死,无菌条件下取出股骨,用 MEM培养液冲洗髓腔收集细胞悬液,过筛网,滤液 用MEM培养液洗1次,将细胞悬浮在10%dx牛血清 MEM培养液(含15~,/mLI【广1,7.5~,/mLIL广3, 150~,/mLSCF)中按密度5×103/mL种于直径35min 半固体培养基的培养皿中,每个平皿中1mL,每组 3个平行样,37?CO2孵箱生长.第15天计数细胞 集落形成数(50—1000个细胞). 1.5.2MPIF一113对U937细胞的趋化活性:采用微孔 穿膜法l4取常规培养U937细胞2×1a6/rl1L,依次加 入趋化小室上部各孔,不同浓度的MPIF一113蛋白加 至趋化小室底部,每个稀释度平行做3孔.37?, 2h后取出微孔膜进行Giemsa染色.计数趋化细胞 数,并计算趋化指数. 2结果 2.1MPIF-113重组蛋白的纯化MPIF-113重组蛋白 在大肠杆菌中以包涵体形式存在,经超声洗涤包涵 体,变性,复性,肝素SepharoseCL-6B亲和层析,于 0.5mol/LNaCl洗出目的蛋白(见图1).CMSepha— IDseFastFlow阳离子二步层析分离收集0.28mol/L NaCl洗脱峰(见图2).SephacrylS-200凝胶过滤分 离收集蛋白峰(见图3).经SDS—PAGE检定为单一 蛋白带,利用Gene公司SYSGENE成像系统分析纯 度为99%,相对分子质量为15000u. 图1肝素seph趴CL-6B亲和层析分离MP~-I/3 Fig1HeparinsepharoseO_,-6Bchromatographicprofile 1.0 生 暑 C C 篇0.5 ofMPnr-I/3 一 MrlP【p 厂—_., ? 01o203040 t/min 图2CMsepharoseFF层析分离MPIF-I~ Fig2CMsepharoseFFionexchangechromatographic profileofMPIF-I~ 0 图3SephacrylS-200Gel凝胶过滤分离MPIF-I~ Fig3SephacrylS-200Gelfiltrationchromatographic profileofMPIF-I~ 结果表明重组MPIF-113蛋白的纯化由初始工程菌 15%表达量至终产品纯化了6.6倍,回收9.0r7%. 各步纯化倍数与回收见表1及图4.氨基酸成份分 析表明氨基酸组成与理论预期值基本一致.在纯化 工艺研究中发现MPIF-113重组蛋白在变性时易发生 }i釜蠹誊.;;..j 第4期范慧,等.趋化因子新变异体lp重组蛋白的纯化和活性分析'313? 降解,复性时易形成聚合体,透析复性时MPIF一1/3 重组蛋白几乎近95%以上形成聚合体而不能通过 0.2gin滤膜.稀释复性可以减少聚合体的形成. 稀释复性缓冲液由pH8.0至pH4.0MPIF一1p重组蛋 白形成聚合体的量递减见(见图5). 表1MPIF-I~蛋白分步纯化效果 Tabl?mlaryofpurificationofMPIF-Ift "*--200()ou ?一97000u 一68000u "*--430()ou ...l8400I1 .一14300U 1E.?2136/MPIF-l~control;2E.co//2136/MPIF-l~ induced;3MPIF-I~3indisionbodies;4HeparinSephan~ CA,-6Bpurified肌lB;5CMSepllaIDBeFFpurifiedMPW- 1p;6SephacrylS-200purifiedMPW-1p;7proteinmoleon— larmarker 图4MPIF-l8纯化SDS-PAGE图 Fig4SDS-PAGEanalysisofpurifiedMPIF-I~ 8 ?一970()ou ?一680()ou "*-430()ou ?一l8400U 霸霸豢?一14300U 1d日mhlIirlgsolutionwithoutfiltering;2filtereddermmfing solution;3ll|ItIlriI1gsolutionwithontfiltering;4filteredre— mtur~solution(pH4.0);5filteredll|ItIlriI1gsolution (pH5.5);6filteredm1aturiIlgsolution(pH7.2);7filtered nmaturingsolution(pH8.0);8proteinmolecularmarker 图5MPIF-II3复性液SDS-PAGE分析图 Fig5SDS-PAGEanalysisofrellatlli~MPIF-I~ 2.2MPIF.1p重组蛋白的生物学活性 2.2.1小鼠骨髓细胞集落抑制实验:MPIF一1p重组 蛋白对小鼠骨髓集落形成具有抑制作用,与对照组 比较明显偏低,并且呈剂量依赖关系,见表2. 表2MPIF-I~蛋白对小鼠骨髓集落的抑制作用 Tab2InhibitionofMPIF-I~onmousemeyloidprogenetorclone formation 2.2.2MPIF一1p对U937细胞的趋化活性:趋化实 验表明MPIF一1对U937细胞具有明显的趋化活性, 并且呈现剂量依赖关系见图6. l101001000 MPIF一113/(ng.mL一) 图6MPIF-II~蛋白对U937细胞的趋化作用 ng6ChemotaxiseffectofMPIF-I~onU937cells 3讨论 趋化因子是机体内一群能使细胞发生趋化运动 的小分子细胞因子,它们在机体中发挥着重要的生 理和病理效应,根据趋化因子一级结构中半胱氨酸 残基的位点及周围结构特点,将趋化因子分为4类: 第1类趋化因子为CXC或a趋化因子,其结构中氨 基端的2个半胱氨酸残基之间存在着一个氨基酸残 基;第2类趋化因子为CC或p趋化因子,其一级结 构中氨基末端的2个半胱氨酸相邻;第3类趋化因 子为C型趋化因子其一级结构中只保留了趋化因子 的分子结构中4个保守的半胱氨酸的第2和第4个; 最后一种为CX3C趋化因子,在第1和第2半胱氨酸 之间有3个非保守的氨基酸L5J.多项研究表明趋化 因子在机体的免疫防御,免疫调节,炎症反应,造血 调节,血管生成等方面发挥重要的作用.参与造血 干细胞调节的趋化因子主要有CC,CXC,C趋化因子 家族,目前已发现25个对髓样祖细胞增殖有抑制作 765432?O ?314?第l8卷免疫学杂志2OO2年7月 用的趋化因子,如MIP-la,ID8,MPIF一1等,这种抑制 作用往往是可逆的,因此可用作癌症放化疗过程中 造血干细胞的保护剂_6].有关MPIF一1的研究在美 国已进入?期临床,具有良好的应用前景.本室发 现的MPIF一18为MPIF一1的新变异体,其功能尚有待 确定.本文在克隆和表达成功MPIF一1口的基础上, 进一步对原核表达的MPIF一1口重组蛋白进行了纯化 工艺和生物学活性研究.在利用层析分离技术对 MPIF-I~原核表达蛋白进行纯化时发现MPIF-1t~变 性液不能直接进行稀释复性,经过反复摸索比较发 现MPIF-1t~重组蛋白能够特异结合肝素,证明其属 于肝素结合蛋白,首选肝素亲和层析于变性状态下 层析获得较纯MPIF-1t~蛋白,再进一步进行稀释复 性,MPIF一1口蛋白透析复性易于形成多聚体,通过稀 释复性可以有效减少聚合体的形成.使纯化得以较 顺利完成,并由此获得了良好的纯化效果. 对MPIF1口重组蛋白的生物学活性研究表明, MPIF-1t~重组蛋白对小鼠骨髓集落形成有抑制作用, 对U937细胞有明显的趋化活性,且均具有剂量依赖 关系.由此提示MPIF一1/3与MPIF一1的蛋白功能相类 似,但是详尽的功能比较尚待更进一步的实验研究 证明.综上所述,本研究建立了一个简便可行的 MPIF-1t~原核表达重组蛋白的纯化路线,此方法可以 放大,为MPIF一1口进一步的功能研究,开发和应用奠 定了基础. [参考文献] 『1]PatelVP,KreiderBL,LiY,et.Molecularandfunctional characterizationoftwonovelhumanC-Cchemokinesasinhi— bitorsoftwodistinctclassesofmyeloidprogenitors[JJ.JExp Med,1997,185(7):1163—1172. [2]马大龙,劳者歌,孙英.高效表达非融合蛋白的大肠 杆菌质粒载体的构建[J].北京医科大学,1990, 22(2):81—83. [3]范,莫晓宁,张颖妹,等,人重组粒细胞集落刺激因 子突变体rhG-CSF-Ala-17的纯化及部分理化性质[J]. 北京医科大学,2OOO,32(4):337—339. [4]HanW,LouY,TangJ,et.Molectdarcloningandcha- racterizafionofchemokine-likefactor(CKLF1),anovelhu— mallcytokinewithuniquestructureandpotentialchemotafic activity[J].BiochenlJ,2001,357(1):127—135. [5]成军,杨守纯,CHAK:一种新型的免疫杀伤细胞[J]. 免疫学杂志,1999,15(4):282—284. 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