大豆球蛋白_葡聚糖硫酸盐水凝胶溶胀行为研究

大豆球蛋白_葡聚糖硫酸盐水凝胶溶胀行为研究 大豆球蛋白/葡聚糖硫酸盐水凝胶溶胀行为 研究 张烨，郭健，杨晓泉 5 (华南理工大学轻工与食品学院食物蛋白工程研究中心，广州 510640) 摘要:本文以微生物转谷氨酰胺酶(microbial transglutaminase，MTGase)交联制备了大豆 球蛋白(soy glycinin)/葡聚糖硫酸盐(dextran sulfate, DS)冷致水凝胶，分析了成胶的主要 作用力、水凝胶中水的状态、水凝胶在酸性(pH 1.2)和中性(pH 7.5)条件下的溶胀行为， 以及对干凝胶在去离子水中的溶胀规律进行了研究。结果表明，该水凝胶网络形成的作用力 10 主要为 MTGase 催化交联形成的分子间共价键;DS 的添加提高了水凝胶的持水性，并对水 凝胶中平衡水、非冻结水、可冻结水比例影响显著;该水凝胶对 pH 敏感，在酸性条件下水 凝胶脱水收缩，中性条件下吸水溶胀，且 DS/大豆球蛋白比值越高对刺激反应幅度越大;凝 胶中的 DS/大豆球蛋白比值和离子强度是影响干凝胶在去离子水中溶胀性规律的主要因素。 关键词:大豆球蛋白;葡聚糖硫酸盐;水凝胶;水的状态;溶胀 15 中图分类号:TS 214.2 Swelling behavior of soy glycinin/dextran sulfate hydrogel ZHANG Ye, GUO Jian, YANG Xiaoquan (Research and Development Center of Food Proteins, School of Light Industry and Food Science, 20 South China University of Technology, Guangzhou 510640) Abstract: In this work, soy glycinin/dextran sulfate (DS) cold-set hydrogel induced by microbial transglutaminase (MTGase) was prepared. The gelation driving forces, water state and swelling behavior of the resulted hydrogels were investigated. The results indicated that the formation of the covalent bonds among the protein molecules induced by MTGase was the main driving force 25 for the gelation. The addition of DS had significant influence on the content of equilibrium water, non-frozen water and frozen water, and it improved the water holding capacity of hydrogel. The hydrogel shrank under acidic condition (pH 1.2), while swelled under basic condition (pH 7.5). The gel that had higher DS/soy glycinin ratio possessed the greater stimulus response to different pH. The combined effects of DS/11S ratio and ionic strength were the main factors of swelling 30 behavior of dry gels in de-ionized water. Key words: soy glycinin; dextran sulfate; hydrogel; water state; swell 0 引言 水凝胶(hydrogel)是一类以物理或化学作用交联形成，在水介质中具有高溶胀性但自 35 身不溶解的三维网络高分子材料[1]。由于其对温度、pH 值、离子强度等的变化具有敏感的 [2] 响应 ，水凝胶近年被广泛应用于制备营养因子及药物输送载体[3]。 目前制备水凝胶的材料以人工合成聚合物为主。虽然水凝胶具有优越的机械性能，但成 胶过程涉及多种诱发剂、化学交联剂等，其安全性、生物相容性和生物可降解性等方面存在 不足。蛋白质来源丰富，可视为亲水性的天然高分子材料，可通过加热，或添加盐离子、酸 40 诱导、酶交联等方式形成凝胶。Hwang 和 Damodaran[4]，使用乙二胺四乙酸二酐对大豆分离 蛋白侧链赖氨酸残基进行化学改性，以戊二醛交联此改性蛋白获得溶胀性良好的蛋白基水凝 基金项目:高等学校博士学科点专项科研基金(20100172110021) 作者简介:张烨(1986-)，女，硕士研究生 通信联系人:杨晓泉(1965,)，男，教授. fexqyang@scut.edu.cn -1- 胶。Song[5]等使用 genipin 对大豆分离蛋白进行交联制备了大豆蛋白水凝胶。Caillard 等[6]通 过低毒琥珀酸酐处理制备琥珀酰化大豆蛋白，改变蛋白荷电量及等电点，制备胃肠缓释片剂。 目前水凝胶正朝着高生物相容性、低毒、安全方向发展，但上述交联剂均未广泛应用于食品、 45 药物加工领域。 本研究团队以微生物转谷氨酰胺酶(microbial transglutaminase，MTGase)交联的方法 成功制备得到了大豆球蛋白(soy glycinin)/葡聚糖硫酸盐(dextran sulfate，DS)透明水凝 [7]，该水凝胶具有良好的机械性能、透光性、高荷电量及高持水性等特点。本研究将进一 胶 步考察该水凝胶在不同条件下的溶胀行为、体系中水的状态以及成胶驱动力等，以期为开发 50 外观透明、安全无毒的食品级蛋白基环境友好型功能因子输送载体材料提供理论指导。 1 实验材料与方法 实验材料 1.1 低温脱脂大豆粕购于山东禹王公司(杜马斯燃烧法测得其蛋白质含量为 55.86?0.22%)。 55 葡聚糖硫酸盐(DS，分子量大于 500 kDa)购于 Sigma 公司。微生物转谷氨酰胺酶(MTGase) 购于日本味之素公司。 实验方法 1.2 大豆球蛋白的制备 1.2.1 大豆球蛋白的分离制备采用 Nagano 等报道方法[8]进行。低温脱脂豆粕粉碎后按 1:15 的 60 料液比加水搅拌，用 2 N NaOH 调 pH 至 7.5，室温下低速搅拌 2 h，离心(9000 g，30 min， 20 ?C)后在上清液中加入亚硫酸氢钠(0.98 g/L)，放置 0.5 h 后用 2 N HCl 调 pH 至 6.4。 此料液于 4 ?C 静置过夜后，离心(6500 g，20 min，4 ?C)所得沉淀即为大豆球蛋白组分。 沉淀用去离子水洗涤两次后，以 1:10 的量加入去离子水，用 2 N NaOH 调 pH 至 7.5，搅拌 使其充分溶解;并在 4 ?C 下对去离子水透析 48 h 脱盐，经冷冻干燥后室温保存备用。杜马 斯燃烧法测定该蛋白质含量为 95.71?0.13 %;电泳条带及光密度显示其纯度达 95 %以上。 65 大豆球蛋白/DS 凝胶的制备 1.2.2 将大豆球蛋白以 10%(w/v)分散于去离子水中，室温下搅拌 2 h，调节 pH 至 7.0。4 ?C 水化过夜后，离心(8000 g，20 min，4 ?C)去除微量不溶物，获得大豆球蛋白储备液。取 一定量储备液与 DS 溶液以不同的比例进行混合，置于 95 ?C 水浴中加热 30 min，冷却至室 70 温后添加一定浓度的 NaCl 溶液，制得大豆球蛋白/DS 热聚集体分散液。以每克蛋白 20 U 的 量加入 MTGase，真空脱气后置于 45 ?C 条件下孵育 4 h，制得大豆球蛋白/DS 冷致凝胶。大 豆球蛋白的终浓度为 6 %(w/v)。 取一定量的大豆球蛋白储备液与 DS 溶液以一定比例进行混合，添加一定浓度 NaCl 溶 液，置于 95 ?C 水浴中加热 30 min，制得大豆球蛋白/DS 热致凝胶。 凝胶溶解度的测定 75 1.2.3 称取质量为 M0 经冷冻干燥的凝胶粉末，分别加入体积为 V0 的四种溶液中(A:0.6 M NaCl;B:0.6 M NaCl，1.5 M 尿素;C:0.6 M NaCl，8 M 尿素;D:0.6 M NaCl，8 M 尿素， 10 mM 二硫苏糖醇)，25 ?C 下搅拌 6 h 后，离心(9000 r/min，20 min，4 ?C)取上清液， 采用 Lowry 法[9]测定样品中的蛋白质浓度 C，以杜马斯燃烧法测定各冷冻干燥凝胶粉末中的 -2- 蛋白质百分含量 n，则干凝胶在各溶液溶解度为: 80 (1) 凝胶中水的状态测定 1.2.4 准确称取 10?0.5 mg 水凝胶样品，小心置于铝试样皿中，密封。试样皿置于差示扫描 量热仪中(TQ-100 型，美国 TA 公司)。从,60 ?C 开始以 5 ?C/min 升温至 50 ?C，氮气流 85 0 速为 40 mL/min，获取样品的差示扫描量热(DSC)图谱。凝胶中水的热焓值 ΔH 与纯水 ΔH fro)即自由水及中间 相同，即 334 J/g;可从 DSC 图上 0 ?C 处的热焓值计算出可冻结水(W 水，以 Wf 和 Win 表示的含量: (2) 将质量为 Md 的干凝胶置于去离子水中浸泡至恒重，擦拭凝胶表面水分后称取其质量 (Ms)，可计算出凝胶平衡水含量(EWC)，则非冻结水(Wnf)含量为: 90 (3) 凝胶溶胀率及平衡溶胀率测定 1.2.5 称取质量为 M0 的凝胶，将其置于盛有不同溶剂的烧杯中于 37 ?C 浸泡至恒重，t 时间后 取出擦拭凝胶表面水分后称量其质量 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 为 Mt，则 t 时刻凝胶溶胀率为: (4) 95 记录凝胶溶胀平衡后(两次称重质量差小于 0.010g)质量 M?，则凝胶平衡溶胀率为: (5) 2 实验结果与讨论 大豆球蛋白/DS 水凝胶的成胶作用力 2.1 为了了解形成大豆球蛋白/DS 水凝胶的主要作用力，本研究首先把制得的凝胶进行冷冻 100 干燥，然后将其分散于不同溶剂中。由于凝胶网络中蛋白质分子间相应的作用力(如静电相 互作用和氢键、氢键、氢键及疏水键和二硫键)在不同的溶剂中(0.6 M NaCl、1.5 M 尿素、 8 M 尿素和 10 mM 二硫苏糖醇)会遭到破坏[10]。因此，通过测定不同分散液中蛋白质的溶 解度便可获知大豆球蛋白/DS 水凝胶的成胶作用力。热致及冷致凝胶在 A、B、C 和 D 溶剂 105 中的蛋白质溶解度如图 1 所示。大豆球蛋白/DS 在溶剂 A、B、C、D 中的蛋白质溶解度呈 逐步上升的趋势，表明静电相互作用、氢键、疏水键以及二硫键均是形成该凝胶的作用力; 该热致凝胶在溶剂 C 中溶解度明显高于 B，而溶剂 D 中溶解度稍高于 C 且近乎完全溶解， 表明凝胶网络结构的形成主要基于疏水键和氢键，部分由二硫键所贡献。冷致凝胶在溶剂 A、 B、C、D 中最高蛋白质溶解度仅为 40%左右，表明除了上述非共价键及二硫键对凝胶结构 具有贡献外，还存在其他键能更高的键，更好地稳定了凝胶结构。随着 DS/大豆球蛋白比值 110 的提高，凝胶在溶剂 D 中溶解度越低，表明该键贡献越大。MTGase 催化蛋白质分子间形成 ε-(γ-谷氨酰胺基)赖氨酸共价键，可认为此分子间共价键是形成该高荷电冷致凝胶网络的 主要作用力。 -3- 115 图 1 大豆球蛋白/DS 热致凝胶及冷致凝胶在不同溶剂中的蛋白质溶解度 A，0.6 M NaCl;B，0.6 M NaCl，1.5 M 尿素;C，0.6 M NaCl，8 M 尿素; D，0.6 M NaCl，8 M 尿素，10 mM 二硫苏糖醇 Fig.1 Protein Solubility of soy 11S/DS heat-set and cold-set hydrogels in various protein-denaturing reagents A, 0.6 M NaCl; B, 0.6 M NaCl, 1.5 M urea; C, 0.6 M NaCl, 8 M urea; D, 0.6 M NaCl, 8 M urea, 10 mM DTT. 120 大豆球蛋白/DS 水凝胶网络中水的状态 2.2 水在凝胶网络中存在着不同的物理状态。“三态水模型”[11]认为，自由水可在冰点冻 结，中间水的相转变温度与焓略低于纯水;而非冻结水与凝胶网络结合最紧密，通常不在冰 125 点附近冻结，且在,100,50 ?C 范围内观察不到相变。本研究以差示扫描量热法(DSC)测 定以不同 DS/大豆球蛋白比值及不同离子强度制备冷致凝胶中非冻结水与可冻结水分布状 况和持水性的影响，如图 2 所示。随着 DS/大豆球蛋白比值的提高，凝胶中平衡水含量增加， 其持水性也随之提高(图 2a)。当 DS/大豆球蛋白低于 0.013，非冻结水占平衡水的比例低 于 4%。当 DS 添加量进一步提高，凝胶中非冻结水比例有所增加。当 DS/大豆球蛋白的比 值处于 0.020 和 0.033 之间时，非冻结水占平衡水的比例接近 5%。当 DS/大豆球蛋白的比例 130 达 0.100，非冻结水占平衡水的比例为 6.59?0.17%。凝胶体系添加 NaCl 后(图 2b)，同等 DS/大豆球蛋白比值下，离子强度与凝胶体系中非冻结水比例呈正比，但 DS/大豆球蛋白比 值对非冻结水比例的影响更为显著。DS 的添加有利于提高凝胶持水性，提高凝胶体系的离 子强度则导致凝胶持水性降低。 [12]。pH 7.0 条件 非冻结水的含量取决于高聚物的亲水性以及网络中分子间氢键的强度135 下，DS 与大豆球蛋白均带负电，DS/大豆球蛋白比值的提高有利于增加凝胶网络分子间斥 力。MTGase 催化蛋白质分子间发生共价交联，进而形成网络结构稳定的带电凝胶体系，导 致在溶胀初始阶段水更容易进入凝胶网络并与聚合物结合形成非冻结水。多余的电荷与蛋白 结合后促进分子间氢键形成，增加体系亲水性。因此，以高 DS/大豆球蛋白比值制得凝胶具 有高含量的非冻结水，且持水性稳定良好。同一 DS/大豆球蛋白比值下，由于离子强度的增 140 加使得凝胶中高分子链变得卷曲和疏水作用增强，凝胶体系在溶胀过程中平衡水总量降低， 平衡水中非冻结水比例增加，而持水性下降。 -4- 145 a b 图 2 大豆球蛋白/DS 冷致凝胶持水能力及凝胶中水的状态分析图 NaCl 浓度:A，10 mM;B，30 mM;C，50 mM Fig.2 Analysis of water state and water holding capacity of soy glycinin/DS cold-set hydrogels NaCl concentration: A, 10 mM; B, 30 mM; C, 50 mM 150 大豆球蛋白/DS 水凝胶溶胀行为 2.3 溶胀性是影响凝胶在不同条件下荷载与释放功能因子特性的重要因素。蛋白基凝胶的溶 胀性不但依赖于凝胶网络密度，而且受蛋白质分子之间荷电量的影响。聚电解质水凝胶由于 具有弱酸性、弱碱性基团，因而能够被电离。当水凝胶的酸性基团(如羧基等)置于碱性环 境下，该基团发生电离使得凝胶网络随着水的进入而荷载负电荷，在静电斥力作用下凝胶迅 155 速吸水溶胀。当凝胶处于酸性环境下，则发生一个质子化的过程，凝胶的电荷被中和，凝胶 [13]。不同 DS/大豆球蛋白比值制备所得冷致凝胶的平 引力大于斥力，最终导致凝胶脱水收缩 衡溶胀度如表 1 所示。pH 7.5 条件下，大豆蛋白侧链上的羧基发生电离，使得凝胶带上负电 荷，加之 DS 与大豆蛋白表面的正电区域结合，使得体系带有大量负电荷;凝胶网络体系以 斥力为主，网络结构伸展，水分子更容易进入凝胶网络与网络中亲水基团作用，在渗透压作 160 用下表现为溶胀。此水合作用部分来自蛋白质复合物提供的孤对电子，部分来自于电解质提 DS 的添加促进了溶胀过程，并提高了凝胶的平衡溶胀度。另一方面， 供的极性基团，因此 在酸性环境下大豆蛋白侧链上的基团与 H+作用发生质子化，电荷被中和，使得蛋白质聚集， 蛋白质网络脱水，凝胶表现为收缩状态。 165 表 1 大豆球蛋白/DS 冷致凝胶在不同 pH 条件下平衡溶胀度 Table 1 Swelling ratio at equilibrium from soy glycinin/DS hydrogels at different pH values 溶胀度(SR / g?g-1) pH 1.2 pH 7.5 DS/11S=0.000, 10 mM NaCl 2.78?0.73 29.73?1.63 DS/11S=0.020, 10 mM NaCl -11.56?0.31 42.33?2.87 DS/11S=0.033, 10 mM NaCl -21.73?0.82 46.67?3.21 DS/11S=0.100, 10 mM NaCl -52.84?1.24 61.68?2.94 大豆球蛋白/DS 干凝胶溶胀行为 2.4 水凝胶经过冷冻干燥以后，聚合物侧链基团未发生电离，其网络为固态网束。当干凝胶 170 置于去离子水后，凝胶首先通过毛细管吸附和分散作用实现吸水溶胀，然后通过亲水基团与 水分子的水合作用使高分子网络电离成离子对，离子间电荷的相互作用使得聚合物网束伸展, 形成三维的空间网络结构。由此可见，水凝胶的溶胀经历三个过程:一，溶剂小分子向网络 中扩散;二，溶剂化作用引起高分子链段松弛;三，高分子链向空间伸展(协同扩散)。如 果第一过程占主导地位，凝胶的吸水量与吸水时间的平方根成正比关系。如果第二过程占主 175 -5- 导，其吸水量正比于吸水时间，吸水量与吸水时间平方根之间的关系曲线呈S型形状。本研 究以不同DS/大豆球蛋白比值及离子强度制得干凝胶溶胀度分别对时间的平方根作图，如图3 所示。大豆球蛋白/DS干凝胶的溶胀曲线呈近似S型，表明在37 ?C的去离子水中，干凝胶的 溶胀速率更倾向于由凝胶中高分子链的松弛运动控制，且DS/大豆球蛋白比值越高，离子强 180 度越低，此趋势更显著。如图4a所示，以DS/大豆球蛋白比值为0.020、0.033、0.100制备所 -1、29.154?0.980 得干凝胶在去离子水中呈吸水溶胀状态，平衡溶胀度分别为24.095?0.761 g?g g?g-1和50.938?0.790 g?g-1。凝胶溶胀速率亦随DS/大豆球蛋白比值的提高而提高，即添加带 负电荷的DS有利于提高干凝胶在去离子水中的平衡溶胀度。如图4b所示，随着离子强度的 提高，凝胶平衡溶胀度逐渐下降，从24.095?0.760 g?g-1下降至13.65?0.380 g?g-1。可见，随着 离子强度的提高，凝胶内部斥力下降，干凝胶的溶胀能力也随之下降。 185 a b 图3 大豆球蛋白/DS干凝胶在去离子水中的吸水溶胀过程 Fig.3 Swelling process of soy glycinin/DS cold-set hydrogels (frozen dried) in de-ionized water 190 3 结论 本研究制备了一种以 MTGase 诱导的大豆球蛋白/DS 冷致水凝胶，该水凝胶具有良好的 溶胀性和持水性。 (1)在 pH 7.0 条件下，大豆球蛋白/DS 冷致水凝胶形成的主要作用力为 MTGase 诱导 195 的分子间共价键，该作用力赋予水凝胶稳定的网络结构。 (2)随着 DS/大豆球蛋白比值的提高，制备所得水凝胶的持水能力增强，其平衡水含 量也随之提高。离子强度是影响水凝胶中水的状态的另一重要因素;随着体系中的离子强度 提高，制备所得水凝胶的平衡水含量降低，非冻结水比例增加，即可冻结水含量降低，宏观 上表现为凝胶持水能力下降。 200 (3)在酸性溶液中(pH 1.2)，大豆球蛋白/DS 水凝胶发生质子化，凝胶的电荷中和， 体系中的引力大于斥力，凝胶脱水收缩;在中性条件下(pH 7.5)，水凝胶去质子化，在凝 胶网络中亲水基团与水相互作用及高分子链内氢键作用下，凝胶呈现吸水溶胀。DS/大豆球 蛋白比值越高，制备所得水凝胶对 pH 的变化感知越灵敏，溶胀及收缩幅度越大。 (4)大豆球蛋白/DS 干凝胶溶胀规律受凝胶中 DS/大豆球蛋白比值及离子强度的影响。 205 DS/大豆球蛋白的比值越高，凝胶溶胀速率越快，最终平衡溶胀度越高。凝胶中离子强度的 提高抑制了干凝胶溶胀速率，且限制了凝胶的最终溶胀程度。 -6- [参考文献] (References) [1] Bolder S G, Sagis L M C, Venema P, van der Linden E. 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