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包涵体的纯化和复性总结.doc

包涵体的纯化和复性总结

别暧昧填满爱
2017-11-16 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《包涵体的纯化和复性总结doc》,可适用于自然科学领域

包涵体的纯化和复性总结一、菌体的裂解、怎样裂解细菌,细胞的破碎方法高速组织捣碎:将材料配成稀糊状液放置于筒内约体积盖紧筒盖将调速器先拨至最慢处开动开关后逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。玻璃匀浆器匀浆:先将剪碎的组织置于管中再套入研杆来回研磨上下移动即可将细胞研碎此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高适用于量少和动物脏器组织。超声波处理法:用一定功率的超声波处理细胞悬液使细胞急剧震荡破裂毫克菌体此法多适用于微生物材料用大肠杆菌制备各种酶常选用毫升浓度在KG至KG频率下处理分钟此法的缺点是在处理过程会产生大量的热应采取相应降温措施时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整超声完全了菌液应该变清亮如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。反复冻融法:将细胞在度以下冰冻室温融解反复几次由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀使细胞结构破碎。化学处理法:有些动物细胞例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏细菌细胞壁较厚可采用溶菌酶处理效果更好我用的浓度一般为mgml。无论用哪一种方法破碎组织细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中使大分子生物降解导致天然物质量的减少加入二异丙基氟磷酸(DFP)可以抑制或减慢自溶作用加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性加入苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能清除蛋白水解酶活力但不是全部而且应该在破碎的同时多加几次另外还可通过选择pH、温度或离子强度等使这些条件都要适合于目的物质的提取。这是标准配方:裂解液:mMTrisHCl(pH~),mMEDTA,mMNaCl,TritonX,mgml溶菌酶。(溶菌酶在这个pH范围内比较好发挥作用)但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白一般配ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够判断裂解好坏的标准是,溶液很粘protocol是mlml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)g湿菌体如果只做一个鉴定,我觉得ml菌就够了但凡超声,我都用ml裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用ml小烧杯,装ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来菌多我就延长超声时间沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用M尿素洗涤一下再用M尿素溶解如果不上柱,只是跑跑电泳,可以直接用M尿素溶解以后,离心取上清,加入适量体积的loadingbufferloadingbuffer对于包涵体的溶解能力是较弱的"取微升菌液离心后直接加上样buffer度分钟后上样然后SDSPAGE这个方法到底能不能溶解细菌中的包涵体"而楼主的问题,虽然loadingbuffer对于包涵体的溶解能力是较弱的,但是我觉得你的做法只是在鉴定有无表达,用loadingbuffer是没有问题的、表达重组蛋白时细菌裂解方法都有哪些,在表达重组蛋白时诱导以后跑SDSPAGE发现表达都很好但是在裂解细胞时遇到问题。总是不能彻底裂解细胞。首先我采用超声裂解可是不管我如何超声总有部分细菌没有裂解。我的超声条件如下:宁波新芝超声细胞破碎仪功率W超秒间隔秒重复次。然后显微镜观察不彻底时再重复次。菌体来自ml培养液用mlPBS重悬。然后我又尝试加溶菌酶首先加至终浓度ugmlC半小时菌液不变粘加大浓度至mgml半小时后仍无明显变化。因为我用的PBS是pH我怀疑是pH不合适换用pHTEbuffermgml溶菌酶C半小时仍无明显变粘。因为这次使用的溶菌酶是前一天配好的担心溶菌酶失效重新称取冻干粉末直接加入菌液仍然没有明显变化。真是郁闷。到底出了什么事,请高手解答并介绍优化的方案。同时希望能介绍一下如何选择细胞破碎方法以及如何确定最佳条件。溶菌酶在pH时是否没有活性了,可否配成浓缩液保存溶菌酶如果可以应如何保存,加入溶菌酶以后如果细胞壁已破坏菌液应该变粘吧因为核酸被释放出来。而超声破碎细胞我觉得菌液是不会变粘的因为超声可以把大分子核酸打碎成小片段。我判断细胞破碎不完全是因为在将破碎后样品离心分离上清和沉淀跑SDSPAGE观察发现在细胞碎片组分中除了经常出现的一两条带以外还有菌体总蛋白样品中的很多带出现。据此可以判断细胞只是部分破碎。不知我的分析是否正确请版主和各位高手指教。如果溶菌酶效果还可以我觉得先用溶菌酶初步裂解细胞然后再用超声进一步破碎并断裂大分子核酸以降低粘度的细胞破碎策略可能比较好。因为超声有可能使蛋白变性但单用溶菌酶不能确定是否完全破碎还要再加核酸酶降低粘度。这种两步法策略应该还可以减少破碎条件优化的时间。我用的溶菌酶放置时间比较长了有可能失活了。我刚从生工又定了一支不过得后天到货但愿它有用。如何观察溶菌酶是否已裂解细胞通过观察粘度变化是否可以,只反复冻融是否可以有效裂解大肠杆菌细胞,溶菌酶只有在pH值大于的条件下才能发挥溶菌作用请务必保持PBS的pH,同时溶菌酶的量一定要足~在加入溶菌酶后最好放于磁力搅拌器上搅拌分钟再进行超声破菌我的超声条件是:功率W工作秒间隔秒重复次。菌体来自ml培养物用mlPBS重悬超声效率还是可以的。哪儿的溶菌酶好用,我用生工的溶菌酶称取干粉mg。ml菌液用mlNaCl重悬加入mlmMTrisHCl(pH)将溶菌酶干粉加入体系混匀测pH降低到,加ulMTris碱体系pH升到,。C放置小时菌液上层变澄清摇动发现体系没有变粘。测pH仍在左右。再C保温小时还没有变化我简直不知如何才好了。另一瓶ml培养物溶菌酶处理小时后超声。条件:W超秒停秒重复次。菌液有变化但很不明显。继续超声次从外观来看没有太大区别。我简直要说tmd了。见鬼了。我的操作有什么地方不妥当请各位指正。溶菌酶的厂商要求是否很重要,我的诱导物来自:过夜培养物接种C生长小时后C诱导小时(mMIPTG)。是否菌液太浓Pharmacia的说明书ml培养物用ml重悬我用ml仍然不够稀,有人告诉我菌液应该稀一些ml用,ml重悬。但实际操作也不够理想。SDSPAGE总是观察到细胞破碎效果不够彻底。超声那么多次蛋白都要被超碎变性了。、酵母的破碎酵母是一类单细胞真菌的总称其成员分别属于不同的真菌纲细胞壁成分是否会有较大差别这些都是做破碎酵母细胞前要考虑的。我归纳了一下做破碎酵母的几种方法:机械的方法:一般的PROTOCOL都是用glassbeads:如sigmaG加玻璃珠后超声蛋白活性保持较好。化学裂解的方法:g酵母加ml的乙酸乙酯充分搅拌至液体状(希望高手点评)尿素裂解液(尿素molL,NaClmolL,TrismmolL,EDTAmmolL,SDS,PH值)高压匀浆。(这个好象也该在方法中)液氮冻融并研磨酵母破壁我认为这种可能在小试中比较合适。温和的酶法可能不会会破坏酵母原生质体酶法裂解主要用两种酶:。蜗牛酶可以直接从蜗牛的胃液中获得。lyticase可以从sigma定购。这两种酶解法都可以和上面的几种方法结合使用尤其是glassbeads方法效果很好。我用过化学裂解的方法g酵母加ml的乙酸乙酯充分搅拌至液体状。此法的裂解效果不错的不妨试一下。一篇文章是加尿素裂解液(尿素molL,NaClmolL,TrismmolL,EDTAmmolL,SDS,PH值)据说效果可以酵母破碎效果好的我所做过的方法中还是玻璃珠就象microbe和rongjunli所说的那样效率很高的而且对目的蛋白活性不会有什么影响。一般应该用这个方法。、超声破碎的条件选择超声破碎的条件不能一概而论要看你的实验要求有的是细菌破碎有的是对组织细胞进行破碎要掌握好功率和每次超声时间功率大时每次超声时间可缩短不能让温度升高必要时在冰浴条件下进行超声破碎。至于每次超声时是否起泡沫到不是关键的问题这与你超声的量明显有关。、如何鉴定细菌超声破碎的程度最简单的方法:涂片革兰氏结晶紫溶液染色分钟显微镜观察切记:只用结晶紫染色别忘了染色后再用水稍冲洗一下、细菌裂解的DNaseI不同纯度的酶换算标准不同所以你最好查查是哪个公司的酶,仔细看说明书可能会有换算说明。另外看一下参考文献所用的酶是哪个公司的到该公司的主页也可能有收获。我用过华美和TAKARA的DNA酶华美的是用mgml。华美也有RNasefree的DNA酶定量用活性单位。TAKARA的两种酶都是用活性单位定量的。我在超声裂解细菌时加入一些DNA酶一般用超声液加不同量的酶做一个预实验选取符合你需要的酶量。其实根据目的和方法的不同所需要的酶量也是可调节的比如酶切温度(度或度)。、超声裂解细菌是否完全,最简单的方法:涂片革兰氏结晶紫溶液染色分钟显微镜观察切记:只用结晶紫染色二、包涵体的洗涤、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的我以前是这么做的先把包涵体用M盐酸胍溶解充分过滤除去未溶解的物质注意留样跑电泳然后用水稀释到M,离心把沉淀和上清分别跑电泳如此类推可以一直稀释到合适的浓度你可以找到一个合适去除杂质的办法其实这就是梯度沉淀的方法我觉得比通常的直接洗脱效果好。包涵体一般难溶解所以你要注意未溶解的部分你可以跑电泳对比因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比免得把目标蛋白弄丢了。此外刚处理完的包涵体好溶解。冷冻后难溶解溶解也需要长点时间也需要大量的溶剂。如果说是不少不溶解的不是你要的那就不用管了。、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化包涵体的前处理是很重要的。包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒,,,和其它杂质。洗涤常用以下的中性去垢剂如Tween、Triton、Lubel和NP等加EDTA和还原剂巯基苏糖醇(DTT)、β巯基乙醇等反复多次进行因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强在洗涤包涵体时可加mMNaCL。这样提取的包涵体纯度至少可达以上而且可保持元结构。也可用低浓度的盐酸胍或尿素中性去垢剂EDTA还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜使用的还原剂为mM。EDTA为mM。去垢剂如TritonX、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白OmpT(KDa)在molL尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。对于尿素和盐酸胍的选择:尿素和盐酸胍属中强度变性剂易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用所需浓度尿素M盐酸胍M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱溶解度为尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐对重组蛋白质的氨基进行共价修饰但用尿素溶解具有不电离呈中性成本低蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点故目前已被广泛采用。盐酸胍溶解能力达以上且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。包涵体最后的纯化一般是离子交换疏水或者是亲和层析亲和层析尤其是金属螯合层析用得比较广泛而纯化的效果也不错通常是一步就能达到纯度为以上的包涵体。M高浓度尿素溶解后离心获得的包涵体溶解液放在度冰箱过夜后出现沉淀开始感觉很奇怪后来发现是我们的冰箱的温控这种现象我也在实验中遇到过出了问题实验际温度要比设定温度低至少度(呵呵不好意思~)。不过我接着往下进行SDSPAGE、层析等发现没有什么不良影响。所以你不用担心也许你的蛋白也只是和你开了个玩笑呢~三、关于包涵体的溶解:、请教GST包涵体溶解直接用M的脲或M胍融解取上清测浓度。直接稀释后包被检测相应抗体。(由于快速稀释相当于复性过程产物用于检测没有问题的)我所用的包涵体提取方法:(PBS或生理盐水洗涤诱导后菌体BufferA重悬菌体超声波破碎至清亮,(,度,,,,,rpm离心,,分钟弃上清,(用,,,或生理盐水洗涤沉淀,,,次,(往沉淀中加,,(,mlBufferA及,(,ml,,,的,,,(十二烷基肌氨酸钠)贮存液剧烈搅动使其缓慢溶解室温静置,,分钟至,小时,(,度,,,,,rpm离心,,分钟取上清,(加,,,,,,,,,,,,,ul至终浓度为,(,,加,,mM的氧化型谷胱甘肽,,,ul至终浓度为,mM,加mM的还原型谷胱甘肽,,,ul至终浓度为,mM,静置,,分钟至,小时(亦可,度复性过夜),以,,,(pH)或,,(pH)透析取出,,,度保存备用~BufferA配方:TrisbasemMEDTAmMNaClmM甘油DTTmM、包涵体的溶解十二烷基肌氨酸钠与十二烷基肌氨酸在溶解包涵体时可不可以互相代替,可以替换调pH不久没什么区别了吗两者的功能团相同pH不同前者钠盐便于保存罢了、有关包涵体的溶解问题强的变性剂如尿素(M)、盐酸胍(GdnHClM)是通过离子间的相互作用打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键使多肽伸展一般来讲盐酸胍优于尿素因为盐酸胍是较尿素强的变性剂它能使尿素不能溶解的包涵体溶解而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化特别是在碱性pH值下长期保温时。SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等是去垢剂可以破坏蛋白内的疏水键也可溶解一些包涵体蛋白质。另外对于含有半胱氨酸的蛋白质分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原剂如巯基乙醇、二硫基苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶有时还原剂的使用也是必要的可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。、M尿素溶解的包涵体溶液应如何保存我在度放了半个月目前没出什么问题、M尿素溶解的包涵体溶液在室温下可以放多久而不出现问题BI溶液在室温放置小时可能会对目的蛋白有影响因为尿素在碱性条件下可使一些氨基酸酰基化因而早些处理BI溶液比较好。具体有什么影响我也不是很清楚。、GST融合蛋白形成包含体不溶咋办,GST融合蛋白应该不能用尿素等作用太强的变性剂否则GST融合蛋白是不能与beads相结合的GST的Beads是应用酶与底物结合的原理所以要去除处理因素后才好结合不知你的温和的去污剂是什么,做完裂解之后加TritonX,轻摇,,min蛋白溶解的会多些~四、包涵体的复性、包涵体如何复性包涵体的复性主要有两种方式:稀释溶液但是操作的液体量大蛋白稀释透析超滤或电渗透析去除变性剂其中透析很适合实验室应用但是时间长。另外如果蛋白质右两个以上的硫键很可能错误形成配对应用还原剂。还有复性的具体方法还要根据前期试验及筛选来确定~另外你用多大体积的透析缓冲液,可能不够要更换几次你家了多少蛋白呀,蛋白量过大也会使复性困难。你用的透析代是否是新的处理过没有,新代有化学杂质~最后有些复性过程就是还有沉淀(透析方法的缺点)看看溶液中蛋白含量说不定已经够用了~~包涵体的复性还要注意以下几点:首先要获得较高纯度的包涵体。包涵体溶解要彻底一般应使溶解液体量较大不要怕蛋白被稀释要有助溶措施。透析前后均要离心透析不能太快纯化的最佳条件要摸索。小技巧:)包含体要彻底洗涤干净洗涤液中加入适量TritonX)包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性)复性液的组成很有讲究本人使用OxidisedGlutathioneReducedGlutathione还加入一定的LArginineHydrochlorideh)复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析h)复性率的测定据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定(望有经验的战友能更详细地讲解))TritionX、SDS这一类去垢剂最后不易去除在制药行业中一般不允许采用。好像SDS最后残留量不能大于吧忘了。我用Triton洗涤有些包涵体效果不是很好。包涵体洗涤是纯化极为重要的一步改变培养条件再洗涤包涵体有时可以在上柱前已经只剩下条杂带这样后续的纯化就很方便了。因为色谱柱的纯化条件比较难optimize。这段文字可以参考:用Novagen公司《pETSystemManual》提供的方法分别进行细菌渗透休克超声波裂解研究融合蛋白在细胞周质细胞质和包涵体中的分布。渗透休克用方法诱导细菌(ml体积)测菌液ODrmin离心min去上清加入渗透休克溶液(V=OD×VV为渗透休克溶液V为培养新鲜菌液)冰浴minrmin离心min去上清。加V体积渗透休克溶液重悬摇动冰浴minrmin离心min保存上清、细菌沉淀。作如下处理:上清用三氯乙酸(TCATrichloroaceticacid)沉淀加体积TCA(wv)涡漩sec冰浴minrmin离心minul丙酮洗涤沉淀干燥h加V体积×PBS(pH)溶解保存取ul加入等体积×SB进行SDSPAGE电泳分析UNIUERSALHooDSNs成像系统照相。超声波裂解细菌渗透休克细菌沉淀加培养体积mMTrisHCl(pH)重悬冰浴超声波裂解工作选择脉冲粉碎min然后rmin离心min保存上清、细菌沉淀。上清进行TCA沉淀处理同上。沉淀用ProteinExtractionReagent(NiNTAHiBindPurificationKitBugBuster提供)按Novagen公司《pETSystemManual》提供方法反复处理洗涤包涵体。包涵体按培养菌×ODul体积加SDS溶解加等体积×SB进行SDSPAGE电泳分析进行蛋白条带灰度扫描计算融合蛋白TrxPrPC占细菌总蛋白的相对含量。重组融合蛋白的纯化PrPpETa()转化表达菌EcoliBL(DE)TB培养基中AMPugml摇床(r,min)培养至OD约为更换等体积新鲜TB培养基加入IPTG至终浓度mMAMPugmlhg离心收集菌体。按NiNTAHiBindPurificationKit使用说明溶解包涵体纯化融合蛋白。或使用笔者改进方法将NiNTAHiBindPurificationKit使用说明中BufferD改成WashBufferBufferE改成EluteBuffer最后用BufferE重生NiNTAHiBindRasinBindingBuffer平衡以后加酒精保存以免长菌。洗脱所得蛋白用TCA沉淀处理同上得融合蛋白TrxPrPC冻干保存。然后SDSPAGE凝胶电泳分析。、包涵体复性精氨酸可助溶但精氨酸是代谢产物高浓度对人可能不好。另外甘氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸有助溶作用。你可以试一试。对于疏水蛋白的可溶表达可以降低诱导温度(可以试试度诱导过夜)和IPTG的量降低蛋白的表达速度从而减少包涵体形成的速度增加正确折叠蛋白的量。或者换成GST融合表达载体GST可以增加后面融合蛋白的可溶表达。我的蛋白包涵体在经变性纯化后透析复性过程中在透析液中加入了的甘氨酸和的甘油有一定的助溶效果。我想对于你的情况由于含有二硫键还要加入一定比例的谷胱甘肽才能形成正确的二硫键。复性是一个很难捉摸的过程不同蛋白的复性条件也各不相同。、包涵体复性问题包含体复性三大原则:。低浓度。平缓梯度。低温有蛋白析出最大的可能型是:蛋白浓度太高建议你稀释以后再作透析。此外透析的盐浓度(比如ura)要平缓降低:mmmmpbsHO。、包涵体复性形成聚集物关键是蛋白在复性过程中凝聚了以后调节PH可以使其溶解但是这样复性好的蛋白有没有活性还是问题虽然样品溶解了但活性不高或没有也不行呀~、复性中蛋白析出~出现蛋白析出肯定是条件变化太剧烈了。复性应该采取复性液浓度和PH值逐渐变化的方法例如根据你包含体的溶液成分每隔个PH或浓度值配置一种溶液逐步透析到正常。此外透析时必须浓度极低条件温和使蛋白质能够正确折叠。但是复性的比率应该很低。若加变性剂尿素可加到M盐酸胍可加到M另外可将甘油浓度增加范围可在且在复性样品中也可加适量甘油一些拙见。、包涵体复性液配方对于包涵体复性一般在尿素浓度M左右时复性过程开始到M左右时结束。对于盐酸胍而言可以从M开始到M时复性过程已经结束。TRIS系统和PBS系统都没有明确的规定这些需要你在实验过程中不断试验确定合适的缓冲系统不过复性过程主要是注意以下几个问题:)最适pH值范围为之间)温度适宜选择)复性过程蛋白浓度不宜过大一般为mgmL)复性时间一般为小时)低分子化合物如LArg有助于增加复性中间产物的溶解度脲、盐酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺类等在非变性浓度下是很有效的促进剂都可阻止蛋白聚集Tris对蛋白质复性有促进作用EDTA可以防止蛋白降解)氧化还原体系如GSHGSSG、DTTGSSG、DTEGSSG等。还有就是你的蛋白质的特性、什么叫复性成功复性效果的检测:根据具体的蛋白性质和需要可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。凝胶电泳:一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。光谱学方法:可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱(CD)等利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测但一般只用于复性研究中的过程检测。RPHPLC、CE等由于两种状态的蛋白色谱行为不同色谱方法:如IEX、生物学活性及比活测定:一般用细胞方法或生化方法进行测定较好的反映了复性蛋白的活性值得注意的是不同的测活方法测得的结果不同而且常常不能完全反映体内活性。黏度和浊度测定:复性后的蛋白溶解度增加变性状态时由于疏水残基暴露一般水溶性很差大多形成可见的沉淀析出。免疫学方法:如ELISA、WESTERN等特别是对结构决定簇的抗体检验比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。在正常的生理条件下组成蛋白质的多肽链都能以独特的方式进行折叠形成自己特有的空间结构以执行某一些生命活动。当外界环境改变时可能造成基因突变和蛋白质序列改变错误剪接和运输错误折叠和异常聚积形成对机体有害的反应引起构象病的发生和无生物活性、不可溶的包涵体形成。目前对包涵体形成和复性过程中发生聚集的机制尚不清楚许多已建立的高效复性方法是在反复实验和优化的基础上建立的且没有普遍性但从这许许多多的个例中发现了一些规律:如聚集的发生是由链间的疏水相互作用介导、聚集具有相对特异性、折叠中间体可能具有不同的作用等等并利用这些知识建立了一些重组蛋白质高效复兴性的方法。相信随着结构生物学、生物信息学、蛋白质工程学及相关新技术和新设备的发展和完善在不久的将来预测和设计最佳复性方案将成为可能。另外还向这位战友荐一文章有关包涵体蛋白复性的文章~点击浏览该文件、怎样鉴定融合蛋白复性是否成功问:最近在做GST融合蛋白的纯化由于目的蛋白主要存在于包涵体中所以在变性条件下将包涵体溶解经复性透析后用GSHsepharoseB纯化结果得到了比较纯的融合蛋白这是否说明GST的活性已得到恢复(因为能与GSH结合)请问这种情况下是否能代表我的目的蛋白的活性也得到了恢复,由于我的目的蛋白只是一个蛋白的某一段不具有酶活性也不是什么受体之类的所以不知如何鉴定它的活性。如果我得到的是变性的融合蛋白那么用于制备多抗或者单抗会有影响吗,如果我的融合蛋白是可溶性的那么用GSHsepharoseB纯化得到的融合蛋白可以直接用于制备多抗吗,溶液中的GSHTis等成分对免疫动物有影响吗,是否需要透析除取这些成分才能去免疫动物呢,答:)。不可以。GST具体多大忘记了但做为TAG使用的蛋白一般是很小的一段AA可以用相对应的抗体做PULLDOWN亲和纯化等。但蛋白的活性是需要构象存在的一小段TAG空间结构几乎没有就算是没有恢复活性的蛋白也可以与这小段AA对应的抗体结合。)。变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物用来免疫动物具有更强的抗原性。只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的如果用来检测天然蛋白可能会有假阳性。做单抗也可以同样道理筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部是否能用还要看将来该单抗用来干什么。)。免疫动物要求抗原体种尽量小。在这种小体积的情况下缓冲液里的小分子成分只要没毒影响就不大可以不用考虑。)GST为kd,你得到的蛋白活性应通过目的蛋白功能分析才能验证是否复性。GST融合蛋白可以免疫动物但抗体纯化须用GSHsepharoseB和蛋白A或G进一步纯化去掉抗GST抗体如果你的目的蛋白很大可以凝血酶切割除去,,,再免疫动物GSH,Tris是小分子没影响。)既然目的蛋白没有活性何来得活性鉴定复性是否成功就主要是看是否恢复到原来特有的三级结构这就要看你目的蛋白的特异性和天然的目的蛋白片断进行比较看其复性是否彻底这必须有个对照才能知道复性是否完全。不知道你得到目的蛋白有什么用处如果是用来做抗原就没有必要进行活性鉴定了。变性的融合蛋白做抗原是没有影响的gst的分子量是kda当然如果将融合伴侣除去抗体的特异性会要更好一些如果不除影响也不会很大。最好进行透析除去溶液中的杂物质但是Tris没有什么关系其就如同PBS一样本身是缓冲体系不会对免疫造成太大影响。)做抗原的话变性了没关系的纯化后可以直接免疫动物我们这就有人做不过他是用的His融合表达挂着GST挺好的不切也行蛋白大些岂不是抗原性更强些另外你看没看过菌液上清里的蛋白量,那里可能有许多的有活性的蛋白呀五、包涵体的纯化复性以后的蛋白质的纯化策略与可溶性蛋白质相似这里不再赘述。(注:当然也可以先纯化然后再复性一般多采用凝胶柱或者纯化与复性同步进行比如柱上复性。)六、综述以及其他、蛋白复性和纯化在线资料包涵体表达的蛋白的复性#重组蛋白纯化方法组织细胞的破碎目标蛋白的粗提蛋白质沉淀方法色谱分离、综述蛋白的复性是一个世界性的难题没有通用的方法甚至没有靠得住的规律只能试。可以参考以下文章。该文出处已经忘了如果有人知道原创作者或网上出处请补充。包涵体表达的蛋白的复性包涵体表达的蛋白的复性包涵体:包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集形成无活性的固体颗粒。包涵体的组成与特性:一般含有以上的重组蛋白其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等环状或缺口的质粒DNA以及脂体、脂多糖等大小为um难溶与水只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。包涵体的形成:主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适无法形成正确的次级键等原因形成的。、表达量过高研究发现在低表达时很少形成包涵体表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快以至于没有足够的时间进行折叠二硫键不能正确的配对过多的蛋白间的非特异性结合蛋白质无法达到足够的溶解度等。、重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。、重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类致使中间体大量积累容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。包涵体表达的有利因素:、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降解。、降低了胞内外源蛋白的浓度有利于表达量的提高。、包涵体中杂蛋白含量较低且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离有利于分离纯化。、对机械搅拌和超声破碎不敏感易于破壁并与细胞膜碎片分离。破菌:、机械破碎、超声破碎、化学方法破碎分离:gmin离心可使大多数包涵体沉淀与可溶性蛋白分离。、离心:、过滤或萃取方法:洗涤:由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体通常用低浓度的变性剂如M尿素在mMTrispH左右,mMEDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX洗涤去除膜碎片和膜蛋白。溶解:常用的变性剂有尿素(M)、盐酸胍(GdnHClM)通过离子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果少差异氰硫酸胍(GdnSCN)最强。去垢剂:如强的阴离子去垢剂SDS可以破坏蛋白内的疏水键可以增溶几乎所有的蛋白。问题是由于SDS无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用。极端pH:可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如有人在pH>溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在mMHCl中。这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。变性剂的使用浓度和作用时间:一般在偏碱性性的环境中如pH尿素在碱性环境中不稳定一般不要超过pH。有些蛋白只能用盐酸胍如IL。增溶时一般室温过夜但盐酸胍在度小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。还原剂:由于蛋白间二硫键的存在在增溶时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是mMBME或DTT也有文献使用mM浓度。在较粗放的条件下可以使用mll的浓度。还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响如牛生长激素包涵体的增溶。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶有时还原剂的使用也是必要的可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。复性:通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构同时去除还原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度M左右时复性过程开始到M左右时结束。对于盐酸胍而言可以从M开始到M时复性过程已经结束。复性中常采用的方法有:稀释复性:直接加入水或缓冲液放置过夜缺点是体积增加较大变性剂稀释速度太快不易控制。透析复性:好处是不增加体积通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度有人称易形成沉淀且不适合大规模操作无法应用到生产规模。超滤复性:在生产中较多的使用规模较大易于对透析速度进行控制缺点是不适合样品量较少的情况且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性。柱上复性:是最近研究较多并成功的在生产中应用的一种复性方法如华北制药的GCSF复性据说是通过柱上复性进行的。常用于复性的层析方法有SEC、HIC等。还原剂的去除:还原剂一般和变性剂的去除一起慢慢的氧化去除使二硫键慢慢形成。但是由于二硫键的形成并不是蛋白质正确折叠所必须的可以考虑在变性剂完全去除之后在去除还原剂使已经按照正确的结构相互接近的巯基间形成正确的二硫键。常用的氧化方法有:空气氧化法:在碱性条件下通空气或者加入二价铜离子能够取得更好的效果缺点是不易控制氧化还原电势。氧化还原电对(redox):常采用GSSGGSH通过调整两者的比例来控制较精确的氧化还原电势也可以在添加了还原剂如BME、DTT的增溶液中直接加入GSSG,如:mMGSSGmMDTT=GSHGSSG()。复性的效率:复性是一个非常复杂的过程除与蛋白质复性的过程控制相关外还很大程度上与蛋白质本身的性质有关有些蛋白非常容易复性如牛胰RNA酶有对二硫键在较宽松的条件下复性效率可以达到以上而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL很多蛋白的复性效率只有百分之零点几。一般说来蛋白质的复性效率在左右。影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。复性过程的添加剂:、共溶剂:如PEG据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会也可能对复性效率的提高起作用。一般的使用浓度在左右具体条件可根据实验条件确定。、二硫键异构酶(PDI)和脯氨酸异构酶(PPI):PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合从而有利于恢复到正常的结构此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量常常是复性过程中的限速步骤而PPI的作用是促进两种构象间的转变从而促进复性的进行。、分子伴侣即热休克蛋白(HSP)是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株据说效果不错。不过在生产中还没有看到和的应用的例子。、MLArg:成功的应用于很多蛋白如tPA的复性中可以抑制二聚体的形成。、甘油等:增加黏度减少分子碰撞机会一般使用浓度在。、一定的盐浓度可能是为了降低某些带电集团间的斥力有利于蛋白质的折叠。、辅助因子:添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等很多时候对蛋白质正确的折叠是有利的。、色谱法:通过将目标蛋白结合到层析柱上减少蛋白分子间的相互影响该方法得到越来越多的应用常用的色谱有SEC、HIC、IEC、IMAC等。当然虽然有很多所谓的理性的复性方案设计目前的复性工作更多的是一个经验的过程没有一种通用的方法可以套用。复性时的蛋白浓度:mgml太高的浓度容易形成聚体沉淀太低的浓度不经一般使用浓度为济而且很多蛋白在低浓度时不稳定很容易变性。复性效果的检测:根据具体的蛋白性质和需要可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。、凝胶电泳:一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。、光谱学方法:可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱(CD)等利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测但一般只用于复性研究中的过程检测。、色谱方法:如IEX、RPHPLC、CE等由于两种状态的蛋白色谱行为不同。、生物学活性及比活测定:一般用细胞方法或生化方法进行测定较好的反映了复性蛋白的活性值得注意的是不同的测活方法测得的结果不同而且常常不能完全反映体内活性。、黏度和浊度测定:复性后的蛋白溶解度增加变性状态时由于疏水残基暴露一般水溶性很差大多形成可见的沉淀析出。、免疫学方法:如ELISA、WESTERN等特别是对结构决定簇的抗体检验比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。几个复性的实例:、MHCIIJBC():增溶:mgProtein,MGdnHCl,mMDTT,mMEDTA,mMTrispH度hr复性:folddilutiontomgmlProtein、增溶:mMDTT,SDS,mMTris,mMGlucinepH复性:倍稀释到mMDTT,mMDodOMalt(dodecylbetaDmaltoside),mMNaCl,mMTrispH对起始缓冲液密闭透析hr开口透析hr对mMNaCl,mMTrispH透析hr。、BovinePrethrombin,JBC():四对二硫键。增溶:MGdnHCl,mMTrispH,mMEDTAmgml复性:稀释到mMNaHPO,mMEDTA,PEG,MGdnHCl,mMGSSG,mMGSH,pH,mgmlProteinRThr对LmMsodiumphosphate,mMEDTA,PEG,pH透析次温度度。纯化:一般说来复性液的体积较大为了减少处理体积在进行柱纯化以前可以先进行硫酸铵沉淀沉淀在低速离心收集后复溶的盐浓度较高可以直接进行HIC纯化目标峰经适当稀释后(cond<mScm)进行IEX纯化然后通过SEC脱盐更换缓冲液除菌过滤后在质量合格的情况下便可以进入制剂阶段。当然在复性浓度较高的情况下也可以直接将复性液进行IEX纯化优点是在纯化的同时进行体积的浓缩为以后的精制创造条件。从生产的角度看由于每增加一步纯化工序便降低很多收率所以可过两到三次柱纯化工艺越简单越有利于收率的提高。当然这只是一个一般的原则对于纯度要求较高的产品如重组人白蛋白不得不进行多次纯化。

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