EV71病毒特异性单克隆抗体的筛选及鉴定

EV71病毒特异性单克隆抗体的筛选及鉴定 [标签:来源] 作者:李静，蔡芳，高强，王宾 EV71病毒特异性单克隆抗体的筛选及鉴定 【摘要】H的:筛选高亲和力和高中和活性的抗EV71病毒的单克隆抗体(mAb),并对其特 异性和抗原 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 位进行鉴定。方法:采用葡萄球菌A蛋白亲和层析法纯化mAb,并进行抗体的 中和效价、交叉反应性以及表位进行分析。结果:筛选出1株抗EV71病毒的Mb,纯度大 于95%,抗体滴度达到10-7，对EV71病毒具有广谱中和特性，与CA16无交叉反应，为VP1 特异性，并识别EV71的构象型表位。结论:筛选出1株具有高亲和力和中和活性的EV71病 毒的mAb,为研制EV71病毐感染性疾病的诊断试剂提供了重要丄具，并为研制治疗性mAb提 供了条件。 【关键词】EV71;单克隆抗体;中和活性 肠道病毒71型(EV71)是人肠道病毒的一种，其感染性强i致病率高，对中枢神经系统的侵 害尤其严重[1]。EV71与A组柯萨奇病毒(Cox A16型，CA16)是引起手足口病的主要病原 体。手足口病是全球性传染病，近年来手足口病已经成为越来越烕胁国内外儿童健康的广泛 流行性疾病之一。为指导全国各地做好手足口病的预防控制，2008年卫生部发布《手足口病 预防控制指南》;规定自2008年5月2円起，手足口病纳入丙类传染病管理。EV71病毒为 小RNA病毒科、肠道病毒属。引起的手足口病预防控制难度大，目前针对EV71弓丨起疾病的 疫苗、特异性治疗药物等防控手段尚在研制中。高质fi的EV71单克隆抗体(mAb)有可能用 于研制治疗性mAb、EV71患者血清学诊断以及EV71病毒疫苗的抗原含fl的检测，因此具有 重要的应用价值。我们在本实验中筛选了多批EV71 mAb,并对其生物学特性进行了比对研究。 1材料和方法 1.1材料抗EV71病毒Mb腹水由北京科兴生物制品有限公司提供，共12个克隆，编 号 No. 1-No. 12。PEG2000 购自 Sigma 公司。Micro BCATM Protein 购 Pi PIERCE 公司，HRP GAM IgG购岛Jackson ImmuNoresearch。其他试剂由北京科兴生物制品有限公司提供。Gel200 凝胶成像仪购自Kodak公司。 1.2方法 1.2.1 mAb的腹水效价测定采用间接ELISA法[2]。纯化后的EV71病毒抗原用0.01 mol/L PBS 1:100稀释，包被于酶标板，4?C过夜;以含100 mL/L小中血清、10 g/L酪蛋 白、100 g/L蔗糖(北京科兴生 水用0.01 mol/L PBS溶液10倍系列稀释后加入酶标板反应，酶标二抗为HRP GAM IgG,用 TMB显色，读取A450值^BALB/c小鼠阴性血清作为阴性对照。以阴性对照A物制品有限公司提供)的0.01 mol/L PBS溶液封闭。mAb腹 值的2. 1倍作为 阈值，来判定mAb腹水的效价。 1.2.2 mAb腹水的纯化将mAb腹水采用葡萄球菌A蛋白(SPA)亲和层析法纯化[3]， 并用PEG2000浓缩纯化后mAb;采用Micro BCATM Protein Assay Kit检测纯化抗体蛋白浓 度;常规还原型SDS PAGE分析纯度，分离胶浓度120g/L，浓缩胶浓度50 g/L, Gel200 凝胶成像仪扫描电泳胶分析纯度。 1.2.3 mAb的中和效价测定采用细胞培养法。将mAb腹水10倍系列稀释，与A、B、 C 3种基因型的EV71病毒混和37?C 2h后，接种于Vero细胞，培养7 d,观察细胞病变， 计算mAb腹水对EV71 3种基因型病毒的中和效价。 1.2.4交叉反应采用点杂交法(Dot blot法hmAb腹水用50 g/L脱脂奶粉1 : 1000 稀释后，分别与EV71病毒液、Cox A16型病毒液进行dot blot试验。抗原(2 M L/点) 点样于硝酸纤维膜，风干后将膜于50 g/L脱脂奶粉中室温封闭2 h，将膜转移到稀释mAb中 室温摇动反应2 h,洗膜3遍，将膜转移到1 : 2000稀释的AP GAM中，室温摇动反应1.5 h;洗膜，碱性磷酸酶底物显色。 VP2和VP3蛋白进行Dot blot试验。阴性对照 采用无关mAb腹水。 1.2.5 mAb的表位分析采用Dot blot法。EV71 No. 6底物mAb腹水稀释后，分别与 EV71病毒液、基因重组EV71病毒VP1、 2结果 2.1 mAb的腹水效价经间接ELISA法检测，No. 2、No. 3和No. 6 mAb效价分别达10-6、 10-5 和 10-7, No. 4、No. 5、No. 10 和 No. 12 mAb 效价为 10-4。 2. 2 mAb的纯化结果经还原型SDS PAGE可见，SPA亲和层析法纯化的mAb在Mr 50 000与28 000处有2条蛋白条带，分别为mAb的重链和轻链。采用Gel200凝胶成效仪扫描 分析该mAb纯度>95% (图1)。 2.3中和试验结果表1显示了 3株mAb对于EV71病毒的中和活性，No. 2、No. 3对 EV71病毒无中和活性。No. 6 mAb对EV71病毒A、B和C 3种基因型均有中和效果，说明其 具有广谱性;No. 6 mAb对EV71病毒A、B和C 3种基因型的中和效价彡5120。 Cox A16型病毒液无交叉反应，仅与EV71病毒液反应，说明如.6 1^13是计对?771，特异性 好。 2. 4交叉反应结果采用点杂交法对No. 6 mAb进行交叉反应，结果表明No. 6 mAb与 2. 5 mAb识别的表位分析釆用点杂交法对No. 6 mAb进行表位分析。识别No. 6 mAb仅 与未变性的重组EV71 VP1蛋白反应，而对于变性的基因重组VP1蛋白无反应，说明该mAb 特异性结合抗原表位位于病毒外壳蛋白的vpl区，并可能是一种构象型表位(表2)。表1 EV71 mAb对EV71病毒株的中和滴度表2 EV71 No. 6 mAb识别EV71 VP的表位分析 3讨论 EV71属于微小核糖核酸病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员，分 为A、B、C 3种基因型，为单股正链RNA病毒[4]。对EV71病毒研究表明，EV71病毒抗 原表位主要集中于VP1、VP2和VP3上。EV71病毒中和抗原决定簇主要集中于VP1上[5]。 vpl基因具有与病毒血清型完全对应遗传多样性，以及其变异快速的特点，vpl基因是EV71 病毒基因分型的秉要依据[6，7]。 本研究中，我们筛选了 12株抗EV71mAb，采用间接ELISA法测定mAb的腹水效价，细 胞培养法测定mAb的中和效价。No, 6 mAb不仅效价高，而且对EV71病毒A、B、C 3种基 因型均有较高的中和效价，说明其具有广谱性。No. 6 mAb的表位分析结果表明该mAb结合抗 原构象表位位于病毒外壳蛋白的VP1区，而且与EV71 VP2和VP3以及CA16无交叉反应。 筛选出高效价、高中和特性、高特异性的EV71 mAb No. 6可为进一步研制治疗性mAb、 制备较高特异性的诊断试剂盒以及病毒疫苗的抗原含S:检测提供重要条件。 【参考文献】 [1] Komatsu H, Shimizu Y, Takeuchi Y, et al. Outbreak of severe neurologic involvement associated with Enterovirus 71 infection[J]. Pediatr Neurol, 1999，20(1): 17-23. [2] 李永清，杨敬，张莉，等.抗禽流感病毒M2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[J].细 胞与分子免疫学杂志，2008, 24(5): 475-478. [3] Valdes Veliz R，Garcca J，Reyes B，et al, A very sensitive enzyme linked immunoabsorbent assay to Staphylococcal Protein A in the presence of immunoglobulins [J] • Biochem Biophys Res Commun, 2003， 303(3): 863-867. [4] 金奇.医学分子病毒学[M].北京:科学出版社，2001: 606-613. [5] 周世力，艾晓武，萤长垣，等.肠道病毒71型SHZH03结构蛋白基因的遗传进化分析 [J].公共卫生与预防医学，2007, 18(1): 18-20. [6] McMinn PC. An overview of the evolution of Enterovirus 71 and its clinical and public health significance [J] • FEMS Microbiology Reviews, 2002, 26(1): 91-107.