实验
设计
领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计
题目:DNA的提取与鉴定
组数:第七组
组长:杨曼
学校:南通大学
年级:13级
专业:生物工程131
实验内容:
1,采用Chelex-100提取方法提取DNA
2,采用紫外光照射法鉴定DNA。
实验目的
1,掌握各种法医学生物检材DNA提取方法
2,掌握紫外光照射法鉴定DNA的原理和方法
实验原理
1,当检材较少时或者基因分型只需要少量的DNA时,可以用Chelex-100提取方法提取DNA。
2,Chelex-100是一种化学整合树脂,由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成。含有成对的亚氨基二乙酸盐离子,整合多价金属离子,尤其是选择性整合二价离子,比普通离子交换剂具有更高的金属离子选择性和较强的结合力.能结合许多可能影响一步分析的其他外源物质。
3,通过离心除去Chelex-100颗粒,使这些与Chelex-100结合的物质与DNA分离,防止结合到Chelex中的抑制剂或杂质带到PCR反应中,影响下一步的DNA分析,并通过结合金属离子,防止DNA降解。
实验器材
实验试剂:
1,配制1.5%Chelex-100 (w/v):称取5克Chelex-100,加100ml灭菌纯水,放4℃保存。
2,10%SDS :称取10克优级纯的SDS,加纯水到100ml 溶解,室温保存。
3,5mg/ml PK酶(蛋白酶K):称取5mg PK酶,溶于1ml 灭菌纯水中,-20℃保存
4,1M DTT (二硫苏糖醇):称取154.3mg DTT加1ml
灭菌纯水溶解,-20℃保存
实验设备:
干热器、恒温水浴箱、高速离心机、离心管
一,DNA的提取---Chelex-100法
1,全血
1)取3~10μl全血加到0.5ml离心管中,加人500μl纯水,剧烈振荡,室温下放置15分钟。
2) 13,000rpm离心3分钟,去上清,收集沉淀。(必要时可用蒸馏水反复洗沉淀物,直至无色或血色素很少)。
3)沉淀中加入200μl 5%Chelex-100溶液(5% Chelex-100为悬浊液,使用前要充分振摇,使Chelex-100颗粒悬浮),在振荡器上反复振荡,放入56℃保温30分钟以上。
4)取出后振荡,100℃保温8分钟,振荡后,13,000rpm 离心3分钟,上清用于PCR扩增,或放4℃保存备用。
2.血斑
1) 剪取约0.5cm2的血斑,加到0.5ml的离心管中,加入500μl纯水,剧烈振荡,室温放置15分钟。13,000离心3分钟,去上清。(可用纯水反复洗至无色,载体不需去除,始终留在离心管中。)
2) 以下步骤同全血的提取方法
3,混合斑
1) 取适量含有混合斑的检测,剪碎后放入5ml小烧杯中,加入3ml纯水、300μl 10% SDS及150μl 5mg/ml 的PK 酶,用牙签搅拌后,放入37℃水浴6小时以上(最好过夜)。
2) 将水浴好的检材移入1.5ml离心管(检材载体用一次性注射器挤压后去除),13,000rpm 离心3分钟,去上清,每管加1.4ml 纯水,振荡,13000rpm 离心3分钟。洗三次后,移入0.5ml离心管中,13000rpm离心3分钟,弃上清。
3)向沉淀物的离心管中加入200μl 5%的Chelex-100 (可根据检材量的多少进行调节),4μl 5mg/ml 的PK酶及
8μl 1M的DTT(PK酶及DTT的终浓度分别为100μg/ml和0.039M),振荡后56℃保温过夜。次日取出振荡,100℃保温8分钟,振荡,13000rpm离心3分钟,上清用于PCR扩增或放4℃保存备用。
4,含有唾液斑的检材
1) 唾液斑:处理方法与血斑的处理方法相同。
2)烟头:用镊子夹住烟头,剪刀剪下烟头外圈的纸,剪碎后放入0.5ml离心管中,加人500μl纯水,剧烈振荡, 13000rpm离心3分钟,弃上清,加入100μl 5%的Chelex-100,放入56℃保温30分钟以上。取出振荡,100℃保温8分钟, 13000rpm离心3分钟,上清用于PCR扩增或放4℃保存备用。
3) 口香糖:将口香糖剪碎后放入0.5ml离心管中,加人500μl纯水,剧烈振荡,13000rpm离心3分钟,弃上清,加入100μl 5%的Chelex-100,放入56℃保温30分钟以上。取出振荡,100℃保温8分钟,振荡,13000rpm离心3分钟,上清用于PCR扩增或放4℃保存备用。
5,毛根
用镊子夹住毛发的根部,剪去其余部分,将毛根放入0.5ml离心管中(处理毛发时很容易遗失,应小心操作,最好在桌面上铺一张白纸。),加人纯水洗一次,然后加入30μl 5%的Chelex-100和2μl 5mg/ml 的PK酶,放入56℃保温6
小时以上。取出振荡,100℃保温8分钟,振荡,13000rpm 离心3分钟,上清用于PCR扩增或放4℃保存。
二,DNA的鉴定——紫外光照射法
1.配制染色剂。用蒸馏水配制万分之五的溴化乙锭(EB)溶液。
2.将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹于蜡纸上,再滴一滴EB溶液染色。
3.将蜡纸放在紫外灯(260 nm)下照射(暗室中),可见橙红色的萤光(DNA的紫外吸收高峰在280 nm处)。
注意点
1,在DNA提取、制备的过程中,核酸极不稳定,许多因素可破坏其完整结构:
①化学因素,核酸的结构在pH值4.0—11.0间较稳定, pH值在此范围外就会使核酸变性降解,故制备过程应避免过酸过碱。
②物理因素,DNA分子链很长,是双螺旋结构,既有一定的柔性。又有一定的刚性,故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂,不利于收集,应加以避免。
③酶的作用,细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来,它会降解DNA分子。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低温(0℃左右)下进行。
2,所有操作均须温和,避免剧烈震荡。
浙公网安备 33021202002483