手性氨基酸的制备及生物活性研究进展

手性氨基酸的合成及生物活性研究进展 专业:物理化学学号:M110393 姓名:秦锦摘要:综述了近年来手性氨基酸的制备方法及其生物活性,包括化学拆分法、不对称合成法、结晶法、微生物法、酶法、配位萃取法、膜拆分法以及色谱法等制备方法,还介绍了手性氨基酸作为手性药物的生物活性作用,并对其研究的前景进行了展望。 关键词:手性,氨基酸,制备,拆分,生物活性 随着人们对手性氨基酸的深入研究,发现有些物质的D-(-)-异构体和L -(+)-异构体在生物体中的活性差异很大。对这一问题的探讨,有助于了解生命过程中药物作用的化学基础与生物基础。本文综述了近年来手性氨基酸的制备方法及其生物活性作用,并展望了其研究的前景。 1 手性氨基酸化合物的制备方法 1.1 化学拆分法 DL-对羟基苯甘氨酸可用化学拆分剂进行拆分,常用的拆分剂有溴化樟脑磺酸a-苯基乙胺,酒石酸,脱氢枞胺等。Yamada S.等用溴化樟脑磺酸(d-BCS)作为拆分剂,对DL-对羟基苯甘氧酸进行拆分,D-对羟基苯甘氨酸的收率可达92%。但此法反应步骤长、收率低,关键是选择使用周期长、回收容易的拆分剂。严兆明等应用嗜热菌蛋白酶通过酶促由DL-苯丙氨酸-I-C与Z-L-广丙氨酸合成Z-L-Ala-L-Phe-OMe(1-C)二肽,藉此达到消旋苯丙氨酸的拆分,然后将二肽用嗜热菌蛋白酶在N-甲基吗啉缓冲溶液中进行酶促水解反应,从而获得L-苯丙氨酸。 Umemura等开发了由麦芽假丝酵母不对称降解DL-丙氨酸生产制备D-丙氨酸的实用工艺。最适降解条件为3O摄氏度、pH6.0、通风量1.0vvm和振荡(1200r /min)。此工艺在200g/L DL-丙氨酸规模下,L-丙氨酸在40h内完全降解,剩余的D-丙氨酸可很容易地从反应混合液中分离出来,最终可得99.0%的化 学纯和99.9%旋光纯度的D-丙氨酸90g。 Yokoaeki等以醛为原料,经Bucherer反应合成DL-5-取代乙内酰脲,然后用恶臭假单胞菌的二氢嘧啶酶催化选择性水解为N-氨甲酰D-氨基酸,再经化学法或酶法脱氨甲酰基得D-氨基酸,拆分DL-5-对羟基苯乙内酰胺生产D-对羟基苯甘酸,由30 g/L DL-5氨-对羟基苯乙内酰胺生产D-对羟基苯甘氨酸,收率达92%。 李叶芝等人以新手性拆分试剂R(-)四氢噻唑-2-硫酮4-羧酸[简称R(-)TIEA]对DL-氨基酸酯进行手性拆分,其方法是:取DL-氨基酸酯(2mmo1)溶于10ml乙酸乙酯,滴入10ml含1 mmolR(-)TTCA的乙酸乙酯溶液,搅拌反应30~60min,有大量白色沉淀或者粘稠油状物析出,分离出固体或油状物,即为R(-)TTCA-氨基酸酯铵盐1a-1f,滤液先后以10ml1.50mol/L NaOH和饱和食盐水(3×5m1)洗涤,有机层用无水Na2S04干燥,蒸发除去溶剂,得光活性氨基酸酯2a-2f,其光学纯度为35.4%~75.8%。取R(-)TTCA氨基酸铵酯盐1a 一1f加入1.5moL/L NaOH溶液10ml,使盐分解,用乙酸乙酯(3 x 10m1)萃取,分离出光学活性氨基酸酯3a-3f,其光学纯度为39.5%~69.1%,萃取后的液体加入稀盐酸调pH=1,用乙酸乙酯萃取可回收R(-)TTCAA,回收率81.0%~ 85.0%。 Hmby等人通过对含氟药物DL-3-氟酪氨酸氢溴酸盐三氟乙酰化后,再用羧肽酶水解,拆分得光学活性的L-3-氟酪氨酸。Kenneth L.KirK发展的方法经由酪氨酸羧基、氨基保护后,在其苯环上3-位直接硝化,硝化后的产物以Pt02作催化剂高压加氢还原成3-位氨基的衍生物,再重氮化、光照下发生氟代反应。最后,氟代完成后的产物水解除去保护基后即得到光学纯的L-3一F一酪氨酸。 1.2 不对称合成法 双不对称合成为高纯度物质的合成提供了一条有益的思路。苏贵发等人在手性相转移催化条件下,邻苯二甲酰亚胺钾与手性a-溴代丙酸龙脑酯的Gabriel 反应制取光学活性丙氨酸,观察到显著的双不对称诱导效应。此外,用手性苯丙氨醇作为亚胺底物的手性胺,同一系列醛合成亚胺底物,亚胺底物与三甲硅基氰作用后,得到手性a一氨基酸,改变底物醛可以合成一系列光学纯手性a一氨基 酸。陈继俊等研究了在手性双季铵盐相转移催化剂碘化1,8一双[N一苄基一(3s,4S)一3,4一二羟基四氢吡咯]一3,6二氧辛烷(PTC1)存在下,二苯亚甲氨基乙酸乙酯的不对称烃基化反应,合成2一氨基一3一苯基丙酸、2一氨基一3一(4-氯苯基)丙酸、2-氨基一3一(4一溴苯基)丙酸、2一氨基一3一(4一硝基苯基)丙酸和2-氨基-4-戊烯酸等5个光学活性的a氨基酸。 1.3 结晶法 以价廉易得的硫酸作为拆分剂,以低级羧酸、醇、酮中的一种或几种按一定比例混合作为溶剂,对DL-对羟基苯甘氨酸进行拆分。文健等报道用L-苯丙氨酸与DL-氨基酸,如丙氨酸、a-氨基丁酸、缬氨酸、正缬氨酸、亮氨酸和蛋氨酸形成1:1mol的盐,经结晶拆分可以得到相应的D一氨基酸。庞秀言等人将丙氨酸的消旋混合物,用接种晶体析解法,在DL-a-丙氨酸的乙醇-水饱和溶剂中加入L-丙氨酸晶种,通过冷却恒温结果,得到了L-丙氨酸晶体。DL-蛋氨酸可以从L-苯丙氨酸的加合物形成得以拆分,从此化合物中,可获取75%光学纯的D一蛋氨酸。Kimihim等人指出用反式一(±)-2,2-环乙烷二羧酐酰化可得出非对映体酰胺。此酰胺分步结晶后水解可得光学活性的D或L型蛋氨酸。 1.4 微生物法 Yokozeki等人以醛为原料,经Bucherer反应合成DL-5-对羟基苯乙内酰脲,然后用恶臭假单胞菌(p-putida)的二氢嘧啶酶催化选择性水解为N-氨甲酰-D -对羟基苯甘氨酸,再经化学或酶法脱氨甲酰基得D-对羟基苯甘氨酸,收率达92%。许激扬、吴梧桐等采用乙二醛、苯酚和尿素为原料合成底物DL-5-对羟基苯乙内酰脲,以沟槽假单包菌(Pseudomonas striata)CPU1628或放线形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)CPU1211为酶源,将DL-5一对羟基苯乙内酰脲转化为D-对羟基苯甘氨酸,产率分别为86%和80%。南开大学化学系曾以粘红酵母Rhodotorula glutinis As2.102,1001-20-6R和深红酵母Rhodotorula rubra AS2.279为出发菌株,经紫外诱变筛选得到一株苯丙氨酸解氨酶高活力菌株Rh.glutinis NC06,在最适转化条件下,肉桂酸转化率达57%,每升转化液生成L-苯丙氨酸11.54g。 1.5 酶法 由于底物、反应条件和所用酶的不同,酶法合成的效率有较大的差别。姜忠义等人用N一乙酰-苯丙氨酸酯类衍生物为底物,以氨基酰化酶为催化剂进行L -厂苯丙氨酸的制备,结果达到很高的纯度。Gokhale等筛选了125株Pseudomonas菌株,获得了能分泌水解DL一苯乙内酰脲的乙内酰脲酶的Pseudomonas desmolyficum菌株NC/M2112。酶解生成D-N一氨甲酰基苯甘氨酸的适宜条件为pH9.5、温度30℃,24h内可将27.0g/L的D一苯乙内酰脲完全转化为26.5g/L的D-N一氨甲酰基苯甘氨酸,收率可达90%。进一步经化学转化后可得收率为80%的苯甘氨酸。DL-5一苯乙内酰脲转化为D一苯甘氨酸的总收率为65%一68%。DSM公司(Geleen,荷兰)采用恶臭假单胞菌-L氨肽酶拆分DL一氨基酸酰胺生产半合成青霉素和头孢菌素类抗生素的重要侧链的D -苯甘氨酸和D-对羟基苯甘氨酸。森口等人分离出D-酰化氨基酸,光学拆分得DA。古井等人报道用门冬氨酸-B一脱羧酶仅转入化DL-门冬氨酸的L型异构体为L-丙氨酸,从而获得残留的D-门冬氨酸。Mirviss等利用胰凝乳蛋白酶能高选择性地催化L-苯丙氨酸甲酯水解反应的特性,采用琼脂糖凝胶固定化的胰凝乳蛋白酶从外消旋的DL-苯丙氨酸甲酯成功地拆分出L-苯丙氨酸。刘立建等人用酶活力为2.5mg/g多孔硅球固定化胰凝乳蛋白酶可拆分DL-苯丙氨酸甲酯得L-苯丙氨酸,拆分收率92.3%,光学纯度96.2%。采用a-糜蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶对2-氟苯丙氨酸、3-氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、2-氯苯丙氨酸、3-氯苯丙氨酸、4-溴苯丙氨酸、3-硝基苯丙氨酸等7种消旋苯环取代苯丙氨酸类氨基酸进行拆分得到D-和L-型氨基酸。王燕等分析了固定化米曲霉拆分DL-丙氨酸的动力学特性,通过问歇反应器的实验数据处理,获得了酶促反应的动力学参数,提出的模型能较好地描述固定化菌体连续拆分DL-丙氨酸过程。王淑豪等人在固定床反应器中采用固定化米曲霉菌体光学拆分DL-蛋氨酸,底物浓度为200和400mmol/L时,L-蛋氨酸的转化率分别为93%和78%。利用氨基酰化水解酶拆分混旋蛋氨酸可制得左旋蛋氨酸,利用麴霉属酰基化酶可将N-2酰基-DL-蛋氨酸拆分成L-蛋氨酸。 1.6 配位萃取法 Takeuchi等人曾运用配位萃取拆分技术以N-烷基化-L-脯氨酸(或N-烷基化-L-羟脯氨酸)与Cu2+的配合物作萃取剂,以正丁醇等有机试剂作稀释剂萃取拆分亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸等中性氨基酸;又以N-十二烷基-L-羟脯氨酸的Cu2+配合物作萃取剂,正丁醇作稀释剂,多级逆流连续萃取拆分外消旋缬氨酸,得到的两对映体的光学纯度达到99.5%以上。赵平等人应用手性溶剂萃体的分配行为。考察了在含有配位金属离子和N-n-烷基化氨基酸的两相系统中被拆分后苯丙氨酸对映体的分配行为。结果显示:温度和浓度对萃取拆分的影响不大,而有机溶剂和配位离子对萃取拆分效果的影响较大。 1.7 膜拆分法 龙远德等人将氨基取代的β-CD分子共价键合于聚乙烯醇上,制得带有β-CD基团的聚合物膜,并用此膜拆分了某些消旋氨基酸,发现色氨酸、酪氨酸的分离规律为D-异构体的量大于L-异构体的量,苯丙氨酸的则与之相反。手性冠醚通过液体膜可作为氨基酸及胺类对映体选择性的中间媒介。几乎所有的氨基酸都可通过它们的对映体形式分离,其中大空间位阻基团的氨基酸会有较高的光学拆分率。龙远德等人制备了一种新型光学分离膜即带有L-脯氨酸手性选择了的交联聚乙烯醇膜,并用于DL-氨基酸的拆分,考察了DL-酪氨酸、DL-苯丙氨酸和DL-色氨酸通过膜的对映体选择渗透性能。发现L-氨基酸优先透过膜,消旋氨基酸的机理,在DL-氨基酸的对映体选择性膜透过中,对映体选择吸附起着重要的作用。由此可见,拆分取得了良好的效果。 1.8 色谱法 1.8.1手性毛细管色谱法林丙承使用手性的Chirasie-Val固定相对丙氨酸及其二肽、三肽的对映体进行气相色谱分离。翟翠萍等人使用OV-225-t-丁基酸胺手性固定相分离了硒蛋氨酸对映体。阮宗琴等人将负电性磺丁基-β-环糊精手性添加剂应用于毛细管电泳(毛细管电动色谱)氨基酸对映体的拆分研究中,对8种氨基酸对映体与9-芴甲基氧基甲酰氯(FMDC-C1)生成的衍生物进行 了分离,其中成功地拆分了DL-去甲亮氨酸)、DL-去甲缬氨酸、DL-亮氨酸、DL -异亮氨酸和DL-苏氨酸。 1.8.2 高效液相色谱法王亚丽等人在纤维素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)手性柱上,以正己烷.醇为流动相,对缬氨酸、丙氨酸和半胱氨酸等3种外消旋氨基酸衍生物(苯乙内酰脲)在正相模式下进行了拆分,发现利用三元流动相体系可达到最佳拆分效果。申贵隽等利用表面活性剂胶束在水系洗脱液中会形成具有疏水内腔的螺旋状结构和分布均匀的静电作用点,使用不同空间结构的消旋混合物产生色谱保留差别,以混合表面活性剂涂敷烷基键合硅胶(ODS)作为手性识别固定相,以水为洗脱液分离了D,L-赖氨酸和D,L-谷氨酸等外消旋混合物,得到D-赖氨酸、L-赖氨酸、D-谷氨酸、L-谷氨酸。该方法不需要柱前衍生化处理即可直接进行分析,不仅具有方法简单可靠,重复性好、无污染、容易制备等优点,而且有效地降低了手性分离柱的成本,将为色谱纯旋光活性化合物的制备提供一条保护环境的有效途径。 1.8.3 手性配体交换色谱法手性配体交换色谱是拆分化合物特别是氨基酸对映体的一种有效方法,其选择性高,无需进行柱前衍生化。在配体交换色谱中,手性配体(CL)与金属离子(M)形成配合物([CL]nM)并与对映体(CS)发生交换作用,对映体D-和L-型与手性配体固定相所形成的配合物稳定性不同(K1≠K2),决定了它们在洗脱液作用下的保留时间或保留体积也不同。越稳定者,其保留时间越长,后洗脱,因而可以进行DL对映体的拆分。祝馨怡等在反相条件下,以L-脯氨酸一Si—CSP作固定相,在不同流动相、流速、柱温等条件下进行了DL-天冬氨酸、DL-天冬氨酸、DL-丝氨酸、DL-酪氨酸和DL-色氨酸等一系列DL-氨基酸对映异构体的手性拆分,得到了满意的结果。王群标等人用两种新型涂渍手性配体交换色谱固定相,拆分了DL-去甲缬氨酸、DL-缬氨酸、DL-脯氨酸、DL-亮氨酸、DL-酪氨酸、DL一苯甘氨酸和DL-组氨酸。祝馨怡等人用两种不同键合量的L广脯氨酸硅胶键合手性配体交换固定相,装柱后利用配体交换色谱法分离了一系列的a一氨基酸。当选择键合量较大的长色谱柱进行分离时拆分了DL-天冬氨酸、DL-天冬酰胺、DL-丝氨酸、DL-甲硫氨酸、DL-苏氨酸和DL-缬氨酸。当选择键合量较小的短色谱柱进行分离时,拆分了DL-酪氨酸、DL-色氨酸、DL-苯丙氨酸和DL-异亮氨酸。 1.8.4 手性柱色谱法手性柱色谱法是发展较快的一种方法,不需要特殊的技术和特别的装置,也不需要补充手性试剂就能拆分。吕海涛等人利用脲衍生物型手性色谱柱成功地拆分了DL-缬氨酸、DL-苯丙氨酸、DL-苏氨酸和DL-丝氨酸。结果表明,正相色谱法手性分离效果明显优于反相色谱法,适宜的流动相组成的体积比为正己烷:二氯乙烷:乙醇=75:18:7,在拆分过程中,起主要作用的是固定相(R)一1一(a一萘基)乙胺基部分的手性碳原子,另一个手性碳原子在分离过程中起辅助作用。 1.8.5 薄层色谱法朱全红等人用3,5一二硝基苯甲酰基取代的β一环糊精薄层色谱固定相,以乙腈一1%(φ)乙酸三乙胺一乙酸为展开系统,8对丹磺酰化氨基酸对映体(DNS-Ala、DNS—Leu、DNS—lle、DNS-Phe、DNS—Glu、DNS-Asp、DNS—Ser、DNS—Lys)得到完全分离,对映异构体之间的相对比移值a为1.18—1.63。 2 手性氨基酸化合物的生物活性作用 蛋氨酸是必须氨基酸,对人体有很大的营养价值,在食品及医药方面有突出作用。大部分的蛋氨酸是作为饲料添加剂,用来补充必须氨基酸,提高饲料效率,它对发展畜牧业有举足轻重的作用。蛋氨酸金属盐可以提高金属离子(包括Zn, Cr,Mn,Fe)在动物体内的生物利用。L型属氨基酸类药能释放活性甲基,促进胆碱合成。胆碱与积存在肝内的脂肪作用,变为易吸收的卵磷脂,故可防治脂肪在肝中的蓄积。在医疗中常用于肝炎、肝硬变、脂肪肝、酒精和磺胺等中毒,还可作为利胆药,用于调节尿的pH值,减少脂肪积聚。蛋氨酸作为氨基酸输液时,是复合氨基酸的主要组分之一。利用其具有抗脂肪肝的作用,医药上常用作保肝制剂,蛋氨酸在动物体内几乎都被用作蛋白质的合成。 L-对羟基苯甘氨酸是生产治疗缺血性心脏病、心力衰竭、糖尿病药物的重要原料。含类似苯丙氨酸的非天然芳香性氨基酸的新型内皮素受体,肽类拮抗剂因其在防治心血管疾病的巨大潜在意义,成为活性多肽研究的热点之一。 含“氨基酸希夫碱一金属”手性配合物具有良好的生物、生理活性,近年来其抗菌、抗癌活性以及催化氨基转移和外消旋化的作用引起了人们更大的兴趣。 3展望 有人预测,到2005年全球约有60%的上市新药为光学纯药物。含氨基酸的手性化合物的制取方法将来的方向必定是不对称合成(又称手性合成)和酶法转化。国外已将不对称合成法作为未来的主攻方向。我们在研究与开发不对称技术时可在探索不对称水解、氧化、还原等反应条件,寻找手性催化剂及开发手性骨架、手性中间体等方面作为重点研究内容,应寻找成本低廉,技术上可行,原材料能立足于国内的不对称合成方法,要能在大规模工业生产中得以推广。我们应将开发有工业生产实用价值的不对称合成工艺作为研究目标。酶法转化始终是制备含氨基酸的手性化合物最主要的方法之一。与其他方法相比,其优点是转化率高,无需高温、高压冷冻,通常在自然环境中运作;不用强酸、强碱,腐蚀性小,污染小。除生产收率不如化学合成法外,其他方面均为化学合成法所不及。对手性氨基酸药物除了要研究它与对映体药物的不同药理活性外,还要考虑它们在吸收、分布、代谢和排泄中的差异,以及研究其结构和构型与生物活性、药效、代谢和毒性的相关性。我们有理由相信,21世纪将是包括手性氨基酸在内的手性药物大发展的世纪。