第10-11-12章讲义

第十章  克隆化DNA的体外突变 体外突变是用酶学 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 和化学方法切割或合成DNA，将突变导入到克隆的基因中，再将改变的基因重新送回到生物体中 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 该基因的功能变化的一项技术。 经典的遗传学方法从突变体的遗传表型来了解基因的结构与功能之间的关系，体外突变是从基因的顺序推导基因的功能，所以是一种反向遗传学的方法。 体外突变可分为随机突变及定点突变两大类。 第一 节  随机突变  随机突变是指目的基因发生突变的部位是随机的。它最常用于鉴定克隆的DNA中特定功能在基因中所处的位置及其与周围区域的关系。包括以下方法： 一、限制性内切酶法 基本步骤：先对克隆的DNA片段作限制性内切酶酶切图谱分析，选择仅在目的基因上（而不在载体中）出现的单一酶切位点进行酶切产生两个粘性末端，用DNA聚合酶或S1酶将粘端修平，再用连接酶将平头的线性质粒DNA连接成闭环DNA分子并转化大肠杆菌，挑单菌落筛选突变质粒。由于DNA聚合酶和S1酶的作用机制不同，前者产生的突变株是增加了几个核苷酸的突变，而后者产生的是缺失了几个核苷酸的突变。上述两种突变若是发生在蛋白质编码序列中，则会改变翻译的阅读框架，从而使对应的蛋白质发生结构和功能的改变。限制性内切酶法的优点是简单，缺点则是所要突变的基因部位常常没有合适的单一酶切位点，用这一方法就受到限制。 二、接头插入法 基本步骤：在线性DNA的平头之间插入一个合成的寡核苷酸“接头”，从而破坏基因的原有顺序，该接头通常含一个限制性内切酶识别位点，所以可以用该酶切割确定接头插入的位置。 研究细菌转座因子（跳跃基因）的功能区域采用了这一方法。具体操作：控制酶反应的条件，用核酸酶将克隆了跳跃基因的质粒切成线性分子，使每个质粒分子平均只被切开一个口子，然后把含EcoR I酶切位点的8个碱基接头与这些线性分子连成环状。接头插入到重组质粒中的位置是随机的，但一个质粒只插入一个接头。转化大肠杆菌后，用遗传筛选的方法检查这些质粒是否能跳跃，若接头插入的部位正好是转座子的关键部位，并且使蛋白质编码序列的框架发生改变，则能使转座子失去跳跃功能，再用酶切分析确定接头插入的位置，就可以推测转座子的功能区域。 三、系列缺失法 构建系列缺失突变有两种方法： 1．把研究的基因以A、B两个酶切位点克隆到质粒中，A为基因的5’端，B为基因的3’端。若要建立5’的系列缺失，则用限制内切酶A将质粒切成线性，用外切核酸酶III从两端消化DNA，控制反应时间、温度及用酶量，在不同时间取样终止反应，构建成长短不一的一系列线性分子，将末端修平后再在线性分子的两端上加含限制性内切酶识别位点C的“接头”，用C及B酶酶切线性分子，分离含基因部分顺序的系列片段，将其重新克隆到一个新的载体中，转化大肠杆菌后即构成右向系列缺失的突变体。同样，可以得到3’端系列缺失（左向系列缺失）的突变体。 用该法曾研究了5SrRNA的转录调控区位于+40与+80之间。该法的缺点是需要回收缺失的基因片段，再重新克隆到新的载体中，增加了工作的难度。 2．利用外切核酸酶III只切割3’凹端（即5’粘端）双链DNA而不切割3’端突出的单链DNA这一特点，分别用一种产生5’粘端和3’粘端的内切酶（如BamH I和Pst I）把质粒切成线性DNA，再用外切核酸酶从5’粘端开始处理DNA，控制反应条件，在不同时间取样终止反应，用S1酶将粘端修平，平端经连接后转化大肠杆菌，这样就构成了从一端开始的系列缺失的突变体。 四、局部随机掺和法 将待突变的靶基因克隆在一个载体质粒的特定位点上，其上游紧接着两个酶切位点RE1和RE2，它们分别能产生5’和3’突出的单链粘性末端。用大肠杆菌核酸外切酶III末端特异性降解经RE1和RE2双酶切开的重组质粒3’凹端，并通过酶解反应时间控制新生成的单链区域大小（单链区域越短，突变精度越高）。终止反应后，单链区域用Klenow酶补平，底物除四种正常的dNTP外，还包括一种特殊结构的脱氧核糖核苷酸类似物，在缺口填补过程中，该类似物掺入到DNA链的一处或多处。随后再用S1核酸酶处理单链末端，并以T4－DNA连接酶连接成环。重组分子转化大肠杆菌，在体内复制过程中，由于类似物的碱基配对非特异性，50%的扩增产物分子内部引入了错配碱基，并导致位点突变。由这种方法产生的突变体一般含有几对取代碱基，而突变的区域则取决于外切酶III末端降解的程度。 五、核苷酸随机取代法 这是一种在DNA分子的随机位置上进行单个核苷酸取代的方法。其基本策略就是用化学方法处理重组质粒DNA，再将其转化到大肠杆菌中，即产生一个突变质粒库。最常用的化学试剂有亚硫酸钠、肼（hydrazine）、甲酸等。亚硫酸钠使胞嘧啶脱氨变成尿嘧啶，使野生型的GC对变成AT对，而肼和甲酸等则能破坏或去除碱基，不能形成正常的碱基配对，任何核苷酸都能与“无碱基”位点配对，因为这一位点虽然没有碱基，但仍保留着脱氧核糖的骨架。 核苷酸随机取代的另一个方法是在非理想条件下合成DNA，如非适宜的离子条件，4种dNTP浓度不平衡等等，这样DNA聚合酶在合成时偶尔可产生碱基的错配。这一方法所用的DNA聚合酶不应具3'→5'外切酶的校正作用，否则会把错配的核苷酸切除。PCR反应中的耐热DNA聚合酶无这种外切活性，因此这对于正常DNA合成需要准确配对来说是一个缺陷。在随机突变中则成了非常行之有效的方法。这种方法也称为易错PCR。 第二节  定点突变 定点突变（site-directed mutagenesis）是在DNA水平上产生多肽编码顺序的特异改变称为基因的定点突变，是一种体外特异性地改变某个碱基的技术，这种改变可以是取代、插入或缺失DNA序列中的任何一个特定碱基。利用这项技术一方面可对某些天然蛋白质进行定位改造，另一方面还可以确定多肽链中某个氨基酸残基在蛋白质结构及功能上的作用，以收集有关氨基酸残基线性序列与其空间构象及生物活性之间的对应关系，为 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 制作新型的突变蛋白提供理论依据。由于它具有简单易行、重复性高等优点，已发展成为基因操作的一项基本技术。这种技术除了能够用于研究基因的结构与功能的关系之外，还能够通过使特异的氨基酸发生改变来获得突变体蛋白质，即所谓的蛋白质工程。目前已发展的定点突变方法主要有寡核苷酸引物诱导的定点突变法、盒式突变法、PCR突变法和全基因合成法等。 一、 寡核苷酸引物诱导的定点突变法 1．寡核苷酸引物诱变：应用合成的寡核苷酸短片段作为诱变剂，诱发基因或DNA片段中特定核苷酸发生取代的定点诱变技术。它能够高频率地诱发某一特定的核苷酸部位发生突变，而且所要求的突变是严格取决于作为诱变剂的寡核苷酸的序列结构。这种定点诱变技术所依据的原理是：使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段作引物，启动单链DNA分子进行复制，随后这段寡核苷酸引物便成为了新合成的DNA子链的一个组成部分。因此所产生出来的新链便具有已发生突变的碱基序列。为了使目的基因的特定位点发生突变，所设计的寡核苷酸引物的序列除了所需的突变碱基之外，其余的则与目的基因编码链的特定区段完全互补。 用作定点诱变之诱变剂的寡核苷酸片段的长度范围一般为8～18个核苷酸。这样长度的寡核苷酸分子，既可以用酶催方法产生，也可用化学方法合成。 2．寡核苷酸引物诱变的步骤： （1）将待突变的DNA片段克隆到某一载体，并分离到单链环状DNA。 （2）合成突变引物：用化学法合成含诱变碱基的寡核苷酸引物，突变位点位于引物中间。 （3）制备异源双链DNA分子：将诱变引物与单链模板DNA混合后退火，再以dNTP 为底物，在DNA聚合酶及连接酶作用下进行延伸连接反应，合成一闭环杂合双链。 （4）富集双链闭环DNA：可用琼脂糖凝胶电泳分离、CsCl密度梯度离心等方法获得。 （5）转化：将富集的双链DNA转化大肠杆菌，得到野生株及突变株两种菌体或噬菌斑。 （6）筛选及鉴定突变株：对突变部分的DNA作序列分析，确定需要的突变基因。 二、盒式诱变法 核酸内切限制酶的限制位点可以用来克隆外源的DNA片段。如果在待突变的位点上下游含有合适的限制性内切酶识别序列，尤其当多个待突变位点集中分布在该区域时，可考虑直接化学合成这一片段，在此过程中将欲突变的碱基设计进去，然后以此人工合成的寡聚核苷酸片段置换重组质粒上对应的待突变区域，即可完成基因的定点突变。所谓盒式诱变（cassette mutagenesis），就是利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段，即所谓的寡核苷酸盒（oligonucleotide cassette），取代野生型基因中的相应序列。盒式诱变法具有简单易行、突变效率高等优点，不便之处是在靶DNA区段的两侧需存在一对限制酶单切点。将合成的诱变的寡核苷酸盒插入到质粒载体分子上，便可以获得数量众多的突变体。这就恰如把各种不同的盒式磁带插入收录机一样，故称此类诱变为盒式诱变或寡苷酸诱变。 三、PCR定点诱变法 1． 重组PCR定点诱变法： 其实早在DNA扩增的PCR方法刚刚问世的时候，科学工作者就已经意识到它同样具备着应用于基因诱变的潜力。因为从原则上讲，PCR扩增引物与模板DNA之间错配的单碱基，经过扩增之后会参入到模板序列中去，最终产生出突变体的双链DNA分子。起初应用PCR定点诱变技术时，只是在引物的5'-端引入突变。后来于1988年，R．Higuchi等人提出了一种称为重组PCR（recombinant  PCR）的定点诱变法，可以在DNA区段的任何部位产生定点突变。它在头两轮PCR反应中，应用两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的内侧引物，扩增形成两条有一端可彼此重叠的双链DNA片段，两者在其重叠区段具有同样的突变。由于具有重叠的序列，所以在除去了未参入的多余引物之后，这两条双链DNA片段经变性和退火处理，便可能形成两种不同形式的异源双链分子。其中一种具5'凹陷末端的双链分子，不可能作为Taq DNA聚合酶的底物，会有效地从反应混合物中消除掉；另一种具3'凹陷末端的双链分子，可通过Taq DNA聚合酶的延伸作用，产生出具两重叠序列的双链DNA分子。这种DNA分子用两个外侧寡核苷酸引物进行第三轮PCR扩增，便可产生出一种突变位点远离片段末端的突变体DNA。 2．大引物诱变法 Higuchi等人使用的这种重组PCR定点诱变法，需要四种扩增引物，共进行三轮PCR反应。其中，头两轮分别扩增两条彼此重叠的DNA片段，第三轮PCR使这两条片段融合起来。显然，此法步骤相当烦琐。为此，后来有人提出了一种比较简单的PCR定点诱变法，称为大引物诱变法（megaprimer method of mutagenesis），其核心是以第一轮PCR扩增产物作为第二轮PCR 扩增的大引物。因此步骤有所简化，只需三种扩增引物进行两轮PCR反应，即可获得突变体DNA。 PCR定点诱变法的长处是，获得目的突变体的效率可达100%。但它亦有两个不足之处：其一是，PCR扩增产物通常需要连接到载体分子上，然后才能对突变的基因进行转录、转译等方面的研究；其二是：Taq DNA聚合酶拷贝DNA的保真性偏低。因此，PCR方法产生的DNA片段必须经过核苷酸序列测定，方可确证有无发生延伸突变。