促红细胞生成素对脑缺血再灌注大鼠血脑屏障通透性作用机制研究

促红细胞生成素对脑缺血再灌注大鼠血脑屏障通透性作用机制研究 促红细胞生成素对脑缺血再灌注大鼠血脑屏障通透性 作用机制研究 中国医科大学(辽宁) 博士学位 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 促红细胞生成素对脑缺血再灌注大鼠血脑屏障通透性作用机制 的研究 姓名:刘坤 申请学位级别:博士 专业:神经生物学 指导教师:薛一雪 2011-04?中文论著摘要? 促红细胞生成素对脑缺血再灌注大鼠血脑屏障 通透性作用机制的研究 .? 刖 昌 缺血性脑血管病以其高发病率和高死亡率而严重危害着人们的健康。迅速溶 栓进行再灌注是治疗的关键。但快速溶栓会引起脑组织继发性的损害,其主 要原 因是血脑屏障 ,通透性遭到破坏。破坏严重,会加重 脑水肿。因此应用一种能够降低缺血再灌注后通透性的药物,对于改善临床 脑缺血患者的预后是非常有益的。 促红细胞生成素,是一种主要由肾脏分泌的糖蛋白,其主要 作用是调节血液中红细胞的生成。最近研究发现,在正常人脑和缺血脑组织 的神经 胶质细胞、神经元和内皮细胞均有及其受体 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达。利用创伤性脑损伤及缺血 再灌注动物模型研究发现,具有神经保护作用,可以减小脑梗死体积,使 通透性下降,减轻脑水肿程度。目前,关于保护缺血再灌注后的作用机 制尚不清楚。 紧密连接,是保持完整性的重要结构和功能基础。相关 蛋白一、、一是目前研究的标志蛋白,他们的变化直接影晌 的状态,进而影响的通透性。研究已经证明,脑缺血时相关蛋白.、 、一表达均减少,完整性下降,细胞旁通透性增加,直接导致血 管源性脑水肿的发生。 泛素蛋白酶体途径? 是细胞内蛋白质选择 性降解的途径,蛋白酶体在这一降解通路中起重要作用。蛋白酶体由 核心蛋白酶和调节颗粒组成。又由个亚基和个亚基构成,其中【亚基主 要用于底物的识别,并促使底物进入水解中心。在受刺激的细胞中,核转录因 子一 ,.的抑制因子【亚基形成多聚泛素化并被降解,从而使?活性增强。肿瘤坏死 因子 ,.【是一种 前炎性细胞因子,与多种疾病的发生有关。同时也是.调节的物质之一,?使其 表达活性增强。近年研究发现,.具有调节相关蛋白表达和降解的作 用,因此可以改变通透性。 本研究应用脑缺血再灌注大鼠模型,腹腔注射,研究脑缺血再灌注后, 对通透性的影响及其可能的作用机制。 方 法 、大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的制备。 、应用激光多普勒血流仪检测血流变化。 、氯化三苯基四氮唑,, ,染色法检测 脑梗死体积百分比,观察脑组织损伤情况及的影响。 、伊文氏蓝 ,检测对脑缺血再灌注通透性的影响, 透射电镜观察脑微血管内皮细胞问的状态。 、法检测对缺血再灌注脑组织微血管段的相关蛋白.、 、.和一【表达的变化。 、免疫组织化学法检测对脑缺血再灌注后相关蛋白.、 和.分布和表达的作用。 、免疫组织化学方法和免疫组织荧光方法检测对脑缺血再灌注脑组织 中、分布和表达的作用。 、 法检测对脑缺血再灌注脑组织微血管段的相关蛋白 .、、一及和表达的调节作用。 、法检测对脑缺血再灌注脑组织微血管段的.浓度的影响。 结 果 、脑缺血再灌注、,使大鼠脑梗死体积显著降低。 、脑缺血再灌注、,缺血区脑组织微血管内皮细胞间不放, 通透性显著升高;基本恢复了的完整性,使通透性显著下降。 、脑缺血再灌注、,缺血区脑组织微血管段的相关蛋白一、 和一 及其蛋白表达显著下降,使三种蛋白表达显著升高,并沿脑微血管分柿 明显增多。 、脑缺血再灌注、,缺血区脑组织微血管段的.【表达上调 及浓度升高,显著下调. 表达水平并降低其浓度。 、脑缺血再灌注、,缺血区脑组织微血管段的蛋白表达和活性 显著升高,使的表达显著降低。 、脑缺血再灌注、,缺血区脑组织微血管段的蛋白表达显著降 低,显著抑制缺血再灌注引起的蛋白表达上调。 结论 、脑缺血再灌注后通透性呈现双峰时相变化,和分别是 通透性最高点,能够显著降低脑缺血再灌注后的通透性。 、脑缺血再灌注后脑微血管内皮细胞问开放,相关蛋白.、 和.的表达水平显著下调;能够诱导关闭,显著上调相关蛋白 ?、和.的表达水平。 、显著下调脑缺血再灌注后缺血区脑组织微血管段的蛋白表达; 显著上调蛋白的表达;显著下调.【的表达水平,显著降低 的蛋白浓度,提示/?/.【信号途径可能参与了对缺血再灌注后 的保护作用。 关键词 ,、霸丐, 促红细胞生成素:脑缺血;再灌注;血脑屏障;紧密连接;英文论著摘要 ’. . . ,. .,. , , ., , ,. , . . 一,,一. , . 一,,一 , , , .. ? . ... . . 【.,? ?, . ,. ,.??. .?. . . . ,, . . . . 一,,,一【 ?..一, . . , . ,,.,, . ?..仅 . ? . . ? . ,. .一一, ,?. .一【, ? . ,. . , .., ,?. . ? ,;?.. .. .; ? ; , ? /?/一【 .. ;? ;. ;;;英文缩略语 英文缩写 英文全称 中文全称血脑屏障紧密连接紧密连接相关蛋白 基质金属蛋白酶 蛋白激酶脑微血管内皮细胞 白细胞介素 肿瘤坏死因子 . 核转录因子.. 小胶质细胞伊文氏蓝氯化三苯基四氮唑 ,, 颈总动脉 颈内动脉 颈外动脉 大脑中动脉线栓法透射电子显微镜 磷酸盐缓冲液 ? 整合光密度值 三羟甲基氨基甲烷 .. . 缓冲盐溶液 , 二甲基联苯胺十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 硝酸纤维素膜增强化学发光 苯甲基磺酰氟?论文一? 促红细胞生成素对脑缺血再灌注大鼠血脑屏障紧密连 接的作用 .?上.?一 刖 罱 缺血性脑血管疾病发作时,及早溶栓进行再灌注是最有效的治疗方法,可以 减小缺血半暗带,减轻缺血造成的脑组织损害,但快速的再灌注会引起一系 列的 反应如血液动力学紊乱、炎症反应、自由基形成、血脑屏障. 破坏等等,这些变化均能导致脑组织继发性的损割?。如果破坏严重,脑水 肿加重,会导致脑疝、甚至死亡。因此寻找能够降低缺血再灌注后通透性, 对缺血再灌流早期的的完整性起保护作用的药物,对改善临床脑缺血患者的 预后是有益的。 促红细胞生成素,是一种主要由肾脏分泌的糖蛋白,其主 要作用是调节血液中红细胞的生成。最近研究发现,在正常人脑和缺血脑组 织的 神经胶质细胞、神经元和血管内皮细胞均有及其受体表达【,。利用创伤性 脑 损伤及缺血再灌注动物模型研究发现,具有神经保护作用,可以减小脑梗死 体积、使通透性下降,减轻水肿程度【’】。目前,关于对缺再灌注后 的作用途径及机制尚无报道。 紧密连接,是保持完整性的重要结构和功能基础。紧密连 接相关蛋.、、.是目前研究的标志蛋白,这些蛋白的结构 和功能的变化直接影响的状态【,进而影的通透性。有研究报道,脑缺 血时相关蛋白.、、一表达减少【】,完整性下降,细胞旁 。 通透性增加,直接导致血管源性脑水肿的发生 本研究首先制备脑缺血再灌注大鼠模型,腹腔注射,观察缺血侧脑组织 通透性的变化,脑微血管内皮细胞状念及:关蛋白.、、 .表达的变化等,探讨对脑缺血再灌注大鼠通透性的影响和机制。材料与方法 一、材料 一实验对象 健康雄性大鼠只,体重~,中国医科大学实验动物中心提供。 实验动物置于室温和光照可控的饲养室内?;每为光照、黑暗一循环;光 照从:开始,白由进食水。 实验试剂 重组人促红细胞生成素公司 兔抗多克隆抗体、小鼠抗.单克隆抗体 公司、兔 抗.多克隆抗体公司 山羊抗兔、山羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记的二抗北京中山生物技术公 司 试剂盒、显色剂迈新生物技术有限公司 总提取试剂盒公司 试剂盒公司 红四氮哇,,,,中国医药上海化学试剂公司 伊文氏蓝公司进口分装 三实验仪器 大鼠脑立体定位仪日本光电株式会社; 激光多普勒脑血流仪英国 公司 酶标仪美国 公司 透射电镜.,日本 正置显微镜同本公司 电子 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 天平公司 恒温震荡水浴一,哈尔滨市东联电子技术开发有限公司台式低温超速离心机 德国公司 通用电泳仪美国.公司 琼脂糖凝胶水平电泳仪 ,瑞典 扩增仪 ,德国 聚丙烯酞胺凝胶电泳装置,美国?公司 ,北京市六一仪器厂 转印仪 恒温冷冻切片机德国公司 一。深度冰箱日本公司 旋涡混合器型,上海医科大学仪器厂.扫描系统 .和 .分析系统 二、方法 备局灶性脑缺血/再灌注动物模型 ,南备局 参照大脑中动脉线栓法 灶性脑缺血再灌注动物模型【】。大鼠腹腔注射 %水合氯醛./,麻醉后, 将大鼠仰卧位固定在手术台上行颈部脱毛,常规消毒后在颈部正中切口,分 离皮 下组织,充分暴露右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉。在 与分叉处结扎,线栓采用直径为.涂有肝素的尼龙线,尼龙线经 进入约.,感觉有阻力时则为阻断入口,栓塞成功后固定 尼龙线,后拔出尼龙线进行再灌注。 二激光多普勒血流仪检测脑血流 麻醉大鼠俯卧位固定于脑立体定位仪,『中矢状切开皮肤,在冠状缝后 。 与矢状缝右交点处钻孑至硬脑膜,直径,该区域为缺血核心区域 将激光多普勒血流仪探头插入孑内,测量大鼠大脑中动脉血流变化。分别记 录『 常状态下脑血流基础值、缺血内以及再灌注不同时问点血流变化。要求 后脑流量迅速降到基础值的%以下,不符合此标准的动物剔除。三实验分组 大鼠先随机分为九组:假手术组,再灌注组、组、组、组、 组、组、组和组,每组大鼠只。渗透法检测再灌注后开 放的峰点,确定开放趋势呈现双峰变化时点后的实验均将动物分为五组,随 机分为假手术组、生理盐水再灌注组、生理盐水再灌注组、再灌注 组、再灌注组,每组大鼠只。假手术组手术操作与模型制备相同, 但不插尼龙线;组大鼠于手术同时腹腔注射/体重;生理盐水 组腹腔注射同剂量生理盐水。 四通透性的检测 向麻醉大鼠股静脉按/体重注入%伊文氏蓝 ,,后经 左心室灌注生理盐水直至流出清亮液体,断头取脑,按/脑组织加人甲 酰胺溶液,?水浴抽提,用酶标仪在波长测光密度值。作出标准曲 线,得到脑组织含量/脑重量。 五脑梗死体积测定 大鼠过量麻醉致死后迅速断头取脑,置于.。冰箱快速冷冻,从额极 开始由前向后每隔冠状切取脑组织片,置于%溶液中,。水浴避 .处理 光孵育,数码相机拍照。用图像分析软件 计算脑梗死体积百分比。 六透射电镜观察 麻醉大鼠%多聚甲醛灌流固定,取缺血区脑组织额顶叶皮质用.% 戊二醛浸泡固定,%四氧化锇后固定,梯度酒精脱水,环氧树脂包埋,超薄 切片经醋酸铀、枸椽酸铅双重染色后,在条件下用一型透射电 镜观察。 七法检测相关蛋白.、、. 表达水平变化 取各组的缺血区额顶叶脑组织。在?下进行微血管段的提取。将组织块放入 不含钙和钾的冷’液中,以纤维剪剪碎,匀浆后,转/离心。 沉淀物中加入含有%葡聚糖的冷,转/离心,去除上清液。 剩余沉淀物以冷洗两次后,转/离心。将含有微血管成分的 最终沉淀物搜集。向微血管段中加入 ,剪碎组织后匀浆,再 加入.氯仿,?离心。吸取含有的上层水相,加入异丙 醇,?离心,弃上清,管底胶状沉淀即为。加入.由处 理水配制的%乙醇,漂洗沉淀。应用. 处理水溶解沉淀,取 溶液进行%琼脂糖凝胶电泳检测总完整性。紫外分光光度计于和 测吸光度比值/和浓度。选择比值在...的溶液作 为含量和纯度合格的样品。样品放.?低温冰箱保存备用。之后,进行逆转录 和 反应。引物序列见表。产物在%的琼脂糖凝胶中电泳,应用 凝胶成像分析仪进行图像扫描,应用 .软件进行分析,获取目 的条带的积分光密度值作为表达强度,以.,和一的 值分别与的值的比值作为表达的相对强度进行比较。 表,.引物序列及其寡聚核苷酸长度、序列号和扩增温度 八免疫组织化学方法检测相关蛋白一、和 。的分布和表达水平变化 麻醉大鼠%多聚甲醛灌流固定,断头取脑额顶叶,蔗糖脱水,包埋, 冰冻切片机冠状连续切片厚,一抗:稀释,进行免疫组化染色法。 免疫组化结果用 .图像分析系统采集照片,并进行定量 分析。九法检测相关蛋白.、和. 表达水平变化 大鼠过量麻醉致死后,迅速断头,取各组的缺血区额顶叶脑组织,应用% 葡聚糖离心提取脑毛细血管微血管段具体方法同上。向各组微血管段中加入 , ,.%, ., 倍体积的裂解缓冲液 , .进行匀浆。匀浆后样品经,×离心分钟。吸出上 清液,弃去沉淀,应用考马斯亮蓝.法测定样品的蛋白质含量,之后各组样 品中加入样品缓冲液,置于沸水中加热分钟使蛋白质变性。将制备好的样品 保 存于。冰箱备用。等量的蛋白在聚丙烯酰胺%或%分离 胶,%浓缩胶中电泳。转印后,应用羊抗兔一、和兔抗小鼠. 抗体按:、:和:的比例杂交,漂洗后,应用辣根过氧 化物酶结合的羊抗兔和兔抗小鼠免疫球蛋白按:的比例杂交。增强化 . 学发光 ,反应后,使用 软件进行图像灰度扫描,使用 .软件进行分析,以目的条带的 值与的值的比值作为蛋白表达的相对强度进行比较。 十统计学分析 采用 .软件进行数据分析。所有数据以均数标准差士如表示, 两组间采用检验,多组间采用单因素方差分析和检验,.为差 异有统计学意义。 实验结果 一、大鼠大脑中动脉血流变化 激光多普勒血流仪检测大鼠大脑中动脉血流变化。大鼠脑血流降于基 础值%以下,被认为脑缺血模型成功,见图。后脑血流没有降于基 础值%以下大鼠有只,弃用。再灌注后脑血流升高,见图.。 .,。 ., 列。 釜一一?,、‘~一一~~?一~一?一,“ 一,? ; ; ?且 .。辇一、。一一~一~???~~?~一。 器 图,大鼠前后及再灌注后局部脑血流值变化图。.: 前大脑中动脉供血区脑血流值.基础值;时大脑中动脉供血区脑血流值; : 再灌注大脑中动脉供血区脑血流值; : : 再灌注大脑中动脉供血区脑血流值; 再灌注大脑中动脉供血区脑血流值。 二、显著降低脑缺血再灌注后的通透性 应用渗透性实验评估通透性变化。假手术组大鼠脑组织未见蓝染, 生理盐水组大鼠缺血侧大脑半球缺血区蓝染,脑切片可见缺血侧额顶部皮 质、尾 壳核外侧部及中部蓝染。统计结果显示再灌注后和缺血侧脑组织含量 最多,分别为.士./脑重量和.士.“‖脑重量,与其余各 组相比均有统计学意义氏.,见图。因此,再灌注后和时, 通透性最高,呈现双峰时相变化特征。生理盐水组与组大鼠再灌注和 时缺血侧脑组织含量与假手术组相比均显著升高,.;再灌注时, 组大鼠缺血侧脑组织含量与生理盐水组相比,.,再灌注时, 组大鼠缺血侧脑组织含量与生理盐水组相比,.,见图。 . . 赢 . 基 苫 . 当 叁 暑. 占 . 囱一 图,缺血再灌注不同时间点脑组织含量的变化。 .,再灌注各时间组与假手术组相比;., 槲.再灌注各时 间组与再灌注组相比;?.,再灌注各时问组与再灌注组相比。 母 岔 景 口 鲁 口 篙 苫 置 呈 芑 看 吝图,对再灌注、脑组织含量的影。 木.,与假手术组相比:“.,槲.,与同时问点生理盐水组相比。 三、对大鼠大脑中动脉供血区血流的影响 大鼠脑血流以基础值百分比表示。结果显示生理盐水组和组大鼠再灌注 和与时相比存在显著差异,.;但同时间点脑血流变化两组问 无显著差异,.,见图,图。~ “’鼬 “” 篷 ?。 ‘ ‘ 惫??一~一~~一’? ~??’” ~? ’。? 鬲磊????????百潺西?????焉蕊矿一 图,生理盐水组与组大鼠再灌注后和局部脑血流值变化图。 晕寄.事占盘?声? 蛐加胡舳轴号加虹? 图,生理盐水组与组大鼠脑缺血及再灌注后和大脑中动脉血流 变化。 木.,生理盐水组大鼠再灌注各时间点与时血流变化相比。 伙.,组大鼠再灌注各时间点与时血流变化相比。 四、显著降低脑梗死体积 脑组织经染色,实验结果显示:大脑中动脉缺血再灌注后,梗死灶位于 右侧额、顶、颞叶皮层及新纹状体外侧部。各组脑切片染色结果见图。下常 组 织为红色,梗死灶为白色。应用法计算梗死体积,结果显示再灌注 、生理盐水组脑梗死体积占全脑百分比分别为.士.%、.士.%, 使再灌注后、脑梗死体积明显减小,分别为.士.%、 .士.%,与同时间点生理盐水组相比,.。 团 乙?日篁暑芭?罄晨苫 图,对脑缺血再灌注、脑梗死体积的影响。 :染色典型的脑组织切片,正常组织为红色,梗死灶为白色。:脑梗 死体积百分比柱状图。木.,与同时问点生理盐水组相比。 五、对脑微血管内皮细胞问的影响通过透射电镜观察到,假手术组大鼠脑组 织微血管内皮细胞间结构完整, 呈现出一系列电子的致密带图,而缺血再灌注后生理盐水组大鼠脑组织 呈现出清晰的可以识别的细胞间裂隙图、,应胃基本恢复结构的完 整性,再次呈现致密带图、,提示能够改变的开放状态。 图,透射电镜观察对脑血管内皮细胞紧密连接的影响。 :假手术组×;:生理盐水再灌注组×;:再灌注 组×;:生理盐水再灌注组× ;:再灌注组。 箭头指向紧密连接。 六、增加相关蛋白.、和. 的表达结果显示,与假手术组相比,缺血再灌注后、, 缺血侧脑组 织微血管段中.、、.三种相关蛋白的表达均明显 降低., 组.、的表达水平于再灌注后与同时 间点生理盐水组相比,.,再灌注后与同时点生理盐水组相比,., . 表达水平于再灌注后、与同时间点生理盐水组相比均显著 降低,.,见图。 潞麓潮/豫姗 ? 一 ?一 . 日口口 址吣 々. 日口日 口口 “, 崔 :. 三 一×一一 。 ? 曼 :熹窿. 瑚 第力圆捌纫扑 ?南八二八八吲国妇 :吖易酋弘 带?朔昀砑朔幺 工朔搦孙 ;霸 :?崩圈妯 学,别朔溯翻 ;叨吲朔翻珀 ;胡 :南孙娜 桫上明翰沥朔翊。呐 图, 对脑缺血再灌注、 .、和. 表 达的作用。 :各组大鼠脑组织中.、、.的条带。.分别 为.、、.相对值。.,与假手术组相比;撑., 即.,与同时间点生理盐水组相比。 七、增加相关蛋白.、和.分布和 表达免疫组织化学法检测脑缺血再灌注、 相关蛋白.、和 .分布、表达变化以及处理后的作用。如图所见,.和 表达在微血管内皮细胞和胶质细胞,.主要表达在微血管内皮细胞,胶质 细胞上未见明显表达。在假手术组大鼠脑组织,三种相关蛋白沿脑微血管持 续 表达,呈连续分布状态。再灌注和时,缺血区脑组织三种相关蛋白沿 微血管表达均显著低于假手术组大鼠,.。组大鼠缺血区脑组织中三种 相关蛋白沿微血管分布和表达与同时间点生理盐水组大鼠相比均显著增加。 其 中,.蛋白表达在再灌注组与同时间点生理盐水组大鼠相比,., 再灌注组与同时间点生理盐水组大鼠相比,.;、.蛋白 表达在再灌注组、组与同时间点生理盐水组大鼠相比,.。 ? 鬻麓蒸 . 鬻瓣囊萋,蘩鬻 簦苍 酋琶蠹圈 襄圈 誊图酋遁萝.图趱旃薰图:遣植 ;;;『围一酋翅 黪曦聪糯赣赣秘穆;聱嚣圈玉筋日 匀口?魏麟黧瓣潜戮糯笺溆; 鬻翻豳器、芋隧东 潮麟麟獭冁蝴霸龋蘸瑟~瓢秘 嘲姆鞠鳞撩?嘲黪?懒?嘲纂劳 冒霉一。 茹囱塑 茹翰 羔蕊;;; 袭窃口三:. 匿薹 掌 篓睁 。穆 燮攀穆 撼黛謦 攀穆峥一 圜 幽 葛口岂岩‘、口三.’? ? 举霸孙 举翅 图, 对脑缺血再灌注、 .、和.表达的作 用。 :.蛋白表达条带;:蛋白表达条带;:.蛋白表达 条带;:.与蛋白的相对表达量比较;:与蛋白的 相对表达量比较;:.与蛋白的相对表达量比较。.,与假 手术组相比;恹.,与同时间点生理盐水组相比。 讨论 本研究结果显示,脑缺血再灌注大鼠于再灌注和,的通透性最高, 呈双峰时相变化;并且于再灌注和时,相关蛋白.、和 .表达显著降低,显著开放;同时缺血侧脑组织发生明显梗死。能 够显著降低缺血再灌引起的通透性的增加;增加再灌注后相关蛋白一、 和.的表达,诱导关闭,恢复脑微血管内皮细胞间的完整 性;显著减少再灌注后脑梗死体积。上述结果证明,可以通过上调相关蛋 白.、和.的表达,诱导关闭,进而降低脑缺血再灌注后 的通透性。 是一种主要由成人肾脏和胎儿肝脏分泌的细胞因子,其主要作用是调节 血液中红细胞的生成。研究发现,神经系统内脑微血管内皮细胞上有及其受 体表达,其表达受低氧因素的调节,低氧刺激引起及其受体表达增加,具有 保护缺血再灌注后神经组织的作用【】。等研究证明,全身给药能 够通过并明显减轻缺血动物模型的神经损伤,其有效作用剂量为//体重,有 效作用时间为缺血前至缺血后,因此本实验 在手术同时腹腔注射,给药剂量为/体重【。 我们通过测定缺血侧脑组织含量评价的通透性变化,结果显示脑缺 血再灌注后和,的通透性增加最显著,明显高于前后各时间点,呈双 峰时相特征,这与等研究结果一致【。能够显著降低脑缺血再灌注 后、 的通透性,这与和等研究结果一致。脑缺 血再灌注大鼠脑血流变化结果显示,与时相比,再灌注后和缺血 区脑血流显著增加,但并未恢复到基线水平,表明内的再灌注为持续低灌注 状态;同时我们研究发现,再灌注同时问点的生理盐水组和组的脑血流变化 无显著差异。染色结果显示显著减少了脑缺血再灌注后和的脑 梗死体积,这与等研究结果一致【。上述研究结果提示能够显 著降低缺血再灌注引起的通透性增加,减少脑梗死体积,对缺血再灌注脑组 织具有保护作用。有研究报道,再灌注后脑血流变化与的通透性之间存在密 切关系陋。再灌注早期,脑血流的急剧升高破坏脑血管内皮细胞,引起的 通透性增高出现第一高峰;之后持续低灌流继发的炎症反应引起的通透性出 现第二高掣。的破坏导致脑水肿发生,甚至出现脑出血,进而加重神经 组织的损伤。本研究结果显示,显著降低了再灌注后的通透性,但 对大鼠缺血再灌注后的血流未产生明显影响,提示降低再灌注后的通 透性与血流变化无关。 是由脑微血管内皮细胞及细胞间、基膜、周细胞和星形胶质细胞足突 共同组成,是存在于脑微血管与神经组织之间的一个动态的调节界面,能够 限制 激素、药物、神经活性及神经毒性物质自由通过,对于维持中枢神经系统内 环境 的稳定具有重要作用。是保持完整性的重要因素,构成了离子与分子通过 细胞旁途径转运的屏斟。脑缺血再灌注时,的破坏,经细胞旁途径转运 入脑的物质增加,造成脑组织损伤【。利用心肌缺血再灌注大鼠模型发现, 可以下调缺血诱导增加的核转录因子?的表达;也可以降低肺缺血再灌注 组织中一【的表达,?禾.旺均可调节相关蛋白的分稚与表达。 据此,我们推测,可能通过调节?币.【的表达影响脑缺血再灌注后的状态,调 节的通透性。本研究通过透射电镜观察发现,脑缺血再灌 注和时,脑微血管内皮细胞间明显开放,能诱导关闭。相关蛋白 .、、.是目前研究 的主要蛋白,它们的结构和功能变化 直接影响的状态【纠。是第一个被分离出的跨膜蛋白,直接参与脑微血 管内皮细胞间的形成。它是一种调节蛋白,能改变细胞间的通透性,的破 坏常伴随的表达缺失【。.也是一种跨膜蛋白,是脑微血管内皮细 胞中的特异性蛋白【】。通过体外培养大鼠脑毛细血管内皮细胞发现,. 的外源性表达可诱导的形成【】。.是形成的充要条件。一是 家族含有鸟苷酸激酶区域或结构域的一个家族成员之一,在连 接跨膜蛋白和细胞骨架蛋白之间起着重要作用,其下游连接细胞内相关信号 传导 酶类和细胞肌动蛋白,其表达水平下调和活性降低均能影响细胞间结构的稳 定 和细胞功能的完整性。鉴于三种蛋白对维持的结构和功能均起重要作用,我 们 同时分析三种蛋白的表达,能更有效说明对 的影响。本研究结果显示, 脑缺血再灌注后相关蛋白.、、.的和蛋白表达显著减 少,能使上述蛋白表达显著增加,说明可以通过上调.、矛 .的表达,保持的完整性,从而降低的通透性。 上述结果证明,能够通过上调关蛋白一、平.的表 达,保持的完整性,降低的细胞旁通透性,这可能是对缺血再灌注脑 组织起保护作用的机制之一。 论 结 、脑缺血再灌注后通透性呈现双峰时相变化,和分别是 通透性最高点,能够显著降低脑缺血再灌注后的通透性。 、脑缺血再灌注后脑微血管内皮细胞间不放,相关蛋白.、 和一的表达水平显著下调;能够诱导关闭,显著上调相关蛋白 一、和.的表达水平。?论文二? /./一伐信号途径在促红细胞生成素降低脑 缺血再灌注大鼠血脑屏障通透性中的作用 .上.工一 刖 吾 缺血性脑血管病以其高发病率、高致残率和高死亡率而严重危害着人们的健 康。迅速溶栓是治疗的关键。但快速溶栓会引起破坏严重。本研究前一部分 的结果显示,能够通过上调相关蛋白.、、.的 及蛋白表达水平,使开放程度减轻,显著降低脑缺血再灌注大鼠的通透 性,使脑梗死体积明显减小,从而发挥保护缺血再灌注后脑组织的作用。但 如何调节相关蛋白的信号途径还不清楚。 ,是细胞内蛋白质 泛素.蛋白酶体途径. 选择性降解的途径,泛素,分子主要通过泛素活化酶 ,和泛素一蛋白连接酶 ,、泛素结合酶. ,与靶蛋白结合成一条多泛素链,最后被蛋白酶体识别 和降解。在脑缺血再灌注时,这一途径活性发生改变。在这一蛋白降解通路 中, 蛋白酶体发挥非常重要的作用。蛋白酶体由核心蛋白酶和调节 颗粒组成。又由个【亚基和个亚基构成,其中【亚基主要用于底物的 识别,并促使底物进入水解中心,亚基则负责底物的降解,具有多种水解酶的 。 活性【 泛素.蛋白酶体系统对核转录因子?具有重要的调控作用。在受刺 激的细胞中,?的抑制因子亚基形成多聚泛素化并被降解,从而 使?活性增加,相关基因表达增强【引。一【是一种前炎性细胞因子,与多 种疾病的发生有关。同时也是?调节的物质之一,.使其表达活性增强 【】。近年研究发现,?具有调节相关蛋白表达及降解作用,因此可以改变 通透性【。 本研究应用脑缺血再灌注大鼠模型,腹腔注射,检测缺血区脑组织微血管内 皮细胞的、伐蛋白表达变化,.表达改变及其在缺血组织 中浓度的变化。探讨/?./?信号途径在保护缺血再灌注大鼠 中的作用。 材料与方法 一、材料 一实验对象 健康大鼠只,雄性、。中国医科大学实验动物中 心提供,实验动物置于室温和光照可控的饲养室为。;每为光照、黑暗一 循环;光照从:开始,自由进食水。 二主要试剂 重组人促红细胞生成素公司 :海生工公司 兔抗?多克隆抗体、小鼠抗.【多克隆抗体公司 山羊抗兔、山羊抗小鼠辣根过氧化物酶标记的二抗北京中山生物技术公 司 试剂盒、显色剂迈新生物技术有限公司 .【试剂盒上海恒远生物技术有限公司 总提取试剂盒公司 试剂盒公司 驴抗兔北京中山生物技术公司 一兔抗小鼠北京中山生物技术公司 三实验仪器 大鼠脑立体定位仪同本光电株式会社; 激光多普勒脑血流仪英国 公司 酶标仪美国 公司 『置显微镜本公司电子分析天平公司 恒温震荡水浴.,哈尔滨市东联电子技术开发有限公司 台式低温超速离心机德国公司 通用电泳仪美国.公司 聚丙烯酞胺凝胶电泳装置,美国。公司 转印仪 ,北京市六一仪器厂 恒温冷冻切片机德国公司 .?深度冰箱日本公司 旋涡混合器型,上海医科大学仪器厂.扫描系统.和 .分析系统 二、方法 一制备局灶性脑缺血/再灌注动物模型 参照大脑中动脉线栓法 ,常各局 灶性脑缺血再灌注动物模型 。大鼠腹腔注射 %水合氯醛./,麻醉后, 将大鼠仰卧位固定在手术台上行颈部脱毛,常规消毒后在颈部正中切口,分 离皮 下组织,充分暴露右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉。在 与分叉处结扎,线栓采用直径为.涂有肝素的尼龙线,尼龙线经 进入约,感觉有阻力时则为阻断入口,栓塞成功后固定尼 龙线,后拔出尼龙线进行再灌注。 二激光多普勒血流仪检测脑血流 麻醉大鼠俯卧位固定于脑立体定位仪,『中矢状切开皮肤,在冠状缝后 。 与矢状缝右交点处钻至硬脑膜,直径,该区域为缺血核心区域【 将激光多普勒血流仪探头插入孔内,测量大鼠大脑大脑中动脉血流变化。分 别记 录『常状念下脑血流基础值、缺血内以及再灌注不同时问点血流变化。要求 后脑流量迅速降到基础值的%【”,不符合此标准的动物剔除。三实验分组 大鼠随机分为五组,假手术组、生理盐水再灌注组、生理盐水再灌注 组、再灌注组、再灌注组。假手术组手术操作与模型制备相同, 但不插尼龙线;组大鼠于手术同时腹腔注射/体重;生理盐水 组腹腔注射同剂量生理盐水。每组大鼠只。 四免疫组织化学方法检测和的分布和表达变化 麻醉大鼠%多聚甲醛灌流固定,断头取脑额顶叶,蔗糖脱水,包埋, 冰冻切片机冠状连续切片厚,一抗:稀释,进行免疫组化染色法。 免疫组化结果用 .图像分析系统采集照片,并进行定量 分析。 五免疫组织荧光法观察和的分布和表达变化 将分组处理后的大鼠脑组织连续冰冻切片,.。冰箱中取出。室温干 燥 ,.% 处理以阻断内源性过氧化物酶活性,正常兔免疫血清孵育 ,封闭非特异位点。加.稀释好的一抗各稀释为:,湿盒内? 过夜。滴加.驴抗兔:和.兔抗小鼠:室温下暗盒内孵 育. 。暗室内%缓冲甘油封片,荧光显微镜下照相,观察.【和. 蛋白表达。 六法检测和仪蛋白表达水平变化 % 大鼠过量麻醉致死后,迅速断头,提取缺血区脑额顶叶组织蛋白,应用 葡聚糖离心提取脑毛细血管微血管段方法同论文一。向各组微血管段中加 入, ,.%, ., 倍体积的裂解缓冲液 , .进行匀浆。匀浆后样品经,×离心分钟。吸出上 清液,弃去沉淀,应用考马斯亮蓝.法测定样品的蛋白质含量,之后各组样 品中加入样品缓冲液,置于沸水中加热分钟使蛋白质变性。将制备好的样品 保 存于.。冰箱备用。等量的蛋白在.聚丙烯酰胺%分离胶,% 浓缩胶中电泳。转印到硝酸纤维素膜上后;.:稀释、.:稀释, . ?孵育过夜;相应二抗室温孵育;发光,采用 软件扫描胶片, .图像分析仪对条带积分光密度进行定量分析,以目 的条带的值与的值的比值作为蛋白表达的相对强度进行比较。 七法检测.【表达水平变化 取各组的缺血区额顶叶脑组织,应用%葡聚糖离心提取脑毛细血管微血管 段方法同论文一。向脑组织中加入 ,剪碎组织后匀浆, 再加入.氯仿,?离心。吸取含有的上层水相,加入异 丙醇,离心,弃上清,管底胶状沉淀即为。加入.由 处理水配制的%乙醇,漂洗沉淀。应用处理水溶解沉淀,取 溶液进行%琼脂糖凝胶电泳检测总完整性。紫外分光光度计于和 测吸光度比值/和浓度。选择比值在..的溶液作 为含量和纯度合格的样品。样品放一?低温冰箱保存备用。之后,进行逆转 录和 反应。引物序列见表。产物在%的琼脂糖凝胶中电泳,应用 凝胶成像分析仪进行图像扫描,应用 .软件进行分析,获取目 的条带的积分光密度值作为表达强度,以.的值与,的 值的比值作为表达的相对强度进行比较。 表,.引物序列及其寡聚核苷酸长度、序列号和扩增温度 八法检测一【浓度变化 取缺血侧额顶叶脑组织.,应用%葡聚糖离心提取脑毛细血管微血管段 方法同论文一。向微血管段中加入 ,离心,收集上 清。分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液,余孔加标 准品或待测样品,轻轻晃动混匀,。反应。加工作液,。 反应。弃去孔内液体,洗板次。加工作液,,?反应。弃 去孑内液体,洗板次。加底物溶液,。避光显色。依次每孔加终止液,终止反 应。酶标仪在波长测量各孔的光密度值。 九统计学分析 采用 .软件进行数据分析。所有数据以均数士标准差表示,两 组间采用检验,多组问采用单因素方差分析和检验,.为差异 有统计学意义。 实验结果 一、改变缺血区脑组织微血管段和分布和表达 免疫组织化学法和免疫组织荧光法检测脑缺血再灌注、后缺血区脑组织 微血管段和 蛋白的分布、表达变化以及应用后的作用。如图、 图所见,在假手术组脑组织,两种蛋白均沿脑微血管持续表达,呈连续分布状 态。 与假手术组大鼠相比,生理盐水组及组大鼠再灌注、缺血区脑组织 蛋白沿微血管表达显著增加,.;应用后,表达与同时问点生理盐 水组大鼠相比显著减少,.,见图。再灌注、,生理盐水组组 大鼠缺血区脑组织 蛋白表达显著低于假手术组大鼠,.;与同时间点生 理盐水组大鼠相比,使 蛋白表达显著增加,.,见图。 ? 奠淄 奠 . 舅. 木 鼍. 宝. 喜. . . . . 雌?慨?阱七?融胁九 棠历场豹孔 棠嗣 图, 对脑缺血再灌注不同时间点和 分布和表达的作用 ×;。 :为和 蛋白表达分布;:表达平均光密度值;: 表达平均光密度值。尸.,与假手术组相比;恢.,与同时间点生理盐水组 相比。图, 对脑缺血再灌注不同时问点和 分布和表达的作用 ;。 图显示脑缺血再灌注、,缺血区脑组织微血管段和 蛋白表达 的变化与应用后的作用。再灌注、,蛋白表达与假手术组大鼠相比 均显著增高,.。组与再灌注同时间点生理盐水组大鼠相比,蛋白 表达水平显著降低,.。 蛋白表达在再灌注、与假手术组大鼠相 比显著降低,.,组与同再灌注时间点生理盐水组大鼠相比, 蛋白 表达显著增加,.。 蚺”妣麓璐飘:。。;勰 怎正 删脚擗铡嗍睽糊黼静镧嘲黪嘲懒静 ‰:。嘲国势?参谰嗡泽嘲?黟嘲鳓黼 工 蓦;直《 虺 .笠强竺”四恐“一徽 镩嘲懒蝴蝴?脚嘲??雌滞黼《懒静 茹艇搏?嘲?降嘲嘲黛势嘲嘲鳓势卅嘲黼姆礴黼群 玑玑玑玑 雪茸毒兰。吝 屯讣一蘑 玑仉玑 ? 幽 图, 对脑缺血再灌注不同时间点表达的作用。 : 蛋白表达条带;:蛋白表达条带; :与蛋白 的相对表达量比较;:与蛋白的相对表达量比较。率氏.,与假手 术组相比;愀.,与同时间点生理盐水组相比。 二、下调缺血区微血管段.仅表达水平 法检测脑缺血再灌注、,缺血区脑组织微血管段.【 表达水平与应用后的作用,结果见图。与假手术组相比,缺血再灌注、, 脑组织中.【表达水平显著升高,.。再灌注同时问点,组与 生理盐水组大鼠相比,.【表达水平均显著降低,.。 曩? 莹 . 圈 . 四 . : 口 :. . 至. ?毗 . 鹚 移举刃珍钐钐么 术赡 . 图, 对脑缺血再灌注不同时间点.【表达的作用。 :.的条带;.的值。木.,与假手术组相比; 栉.,与同时间点生理盐水组相比。 三、降低缺血区脑组织微血管段.蛋白浓度 法检测脑缺血再灌注、,缺血区脑组织微血管段?蛋白浓度 的变化与应用后的作用,结果见图。与假手术组相比,缺血再灌注、, 缺血区脑组织微血管段.蛋白浓度显著升高.。再灌注同时问点, 组与生理盐水组大鼠相比.【蛋白表达水平均显著降低氏.。 【.暑苫?,亨。 图, 对脑缺血再灌注不同时间点?蛋白浓度的变化。 霉.,与假手术组相比;“.,与同时问点生理盐水组相比。讨 论 我们的研究结果证明,脑缺血再灌注后缺血区脑组织微血管段蛋白表达 显著增加,【蛋白表达显著减少,一【表达显著上调及其浓度显著增 高。可显著下调蛋白表达水平,显著上调蛋白表达水平,显著下 调一【表达水平,显著降低其浓度。结果表明,可能通过阻断, 使降解减少,.活性降低,.【表达减少,进而调节相关蛋白的 表达和降解。/./.信号途径可能参与了对脑缺血再灌注 的保护作用。 是广泛存在于真核细胞中一种非常重要的、依赖的非溶酶体蛋白降 解途径,参与细胞凋亡、抗原呈递、细胞周期及细胞内信号转导等多种细胞 活动 过程。包括、、和、蛋白酶体。其降解蛋白的过程:在、 、酶的作用下,将泛素标记到靶蛋白上,泛素化的底物被蛋白酶体识别 并被降解彤】。蛋白酶体是一个依赖型蛋白水解复合体,由核心蛋 白酶 ,和调节颗粒 ,构成。是 蛋白酶体的水解核心,其催化核心有个环叠成圆筒状结构,其中两侧外环 由【亚单位组成,两个内环由亚单位组成,个环的中央形成一个狭窄的孔【】。 亚单位促使底物移位进入中央孔隙水解中心,并使复合体和调节复合 体之间发生构象改变。研究证明,给与蛋白酶体抑制剂阻断,可使脑缺 血再灌注引起的脑梗死体积减小,产生神经保护作用 。由此可见,脑缺血再 灌 注可导致活性增强。我们的研究结果显示,脑缺血再灌注和时,微 血管段蛋白表达显著增加,能够显著降低其表达水平,表明可能 起到阻断的作用。 核转录因子.可以转录调节多种炎症相关因子的表达,是脑缺血后炎症 级联反应中重要的调控因子之一【。脑缺血时?活性增强,促进脑梗死发生。 .基因敲除的小鼠在局灶性脑缺血后引起的神经组织损伤明显减轻,提 示抑制.的激活可能是治疗脑缺血性发作的一条有效途径。细胞在未受刺激 时,.存在于胞浆中,与 【, 和 相互作用,覆盖. 的核定位序列,而使.呈无活性状斜。】。当细胞受刺激时,被其激酶 ,磷酸化,继而被泛素化,并被蛋白酶体识别降解,从而使 .与分离,.即可获得活性并进入细胞核内,与特异性序 、一、. 列结合,调节相应靶基因的转录,上调、、.、. 和基质金属蛋白酶.的表达水平,上述物质均可由脑缺血诱导产生,并加重缺 血 损伤】。.的激活依赖于蛋白的降解以及.由胞浆到胞核的转 移。我们的研究结果发现,脑缺血再灌注后缺血脑组织中微血管段蛋白表达 显著减少,使其表达显著增加,提示可以减少蛋白的降解,降低 了.的活性。 .【是一种前炎性细胞因子,主要来源于免疫细胞,如单核细胞、巨噬细 胞,也可由其他细胞产生,包括血管内皮细胞,神经胶质细胞,其表达受. 的调节。越来越多的证据表明,.【能够通过调节相关蛋白的分布和表达, 改变的状态。等研究证明,.能够引起蛋白表达减少,破坏 的完整性,从而使通透性增加,导致血管源性水肿【。等研究表 明,一【可以降低相关蛋白一和一的表达水平并改变它 们的细胞定位,使视网膜内皮细胞的通透性增加【。此外,一?还能够上调基 质金属蛋白酶和 ,表达水平,使 和蛋白表达增加。和具有降解.和的作 用【。,并诱导.从血管内皮细胞转移到周围的胶质细胞【。因此,.伐 可以通过调节.、和.的表达水平及其降解水平,导致的 完整性发生改变,影响的通透性。另有研究报道,.【对.的调节依 赖于.的激活【。当细胞受刺激时,.【使发生磷酸化而激活, 进一步磷酸化,使其被泛素化、降解,.激活。激活的.可能通过 以下机制调节一的表达:?与。结合的序列位于.启动子上或 其附近,使.蛋白表达下调;??诱导特定靶基因的转录和翻译,进而引 起.蛋白表达受到抑制;?.可能通过激活蛋白酶导致?降解加速。 总之,.仅的表达和作用与.活性之间具有相互促进的作用。我们的研究 结果显示,脑缺血再灌注后脑组织微血管段中.【表达显著增加, .的浓度显著升高,显著下调一【的表达水平,显著降低其浓度,这可能与诱导 相关蛋白增加有关。 综上所述,本研究结果证明,可能通过阻断,使脑缺血再灌注后脑 组织微血管段蛋白降解减少,.活性减弱,?【表达减少而增加 相关蛋白.、和.的表达,减少其降解,恢复的结构完整 性,从而实现降低脑缺血再灌注后通透性的作用。 结 论 显著下调脑缺血再灌注缺血区脑组织大鼠微血管段的蛋白表达; 显著上调蛋白的表达;显著下调? 的表达水平,显著降低 的蛋白浓度,提示/./?信号途径可能参与了对缺血再灌注后 的保护作用。?本研究创新性的自我评价? 本研究首次证明了如下内容: 、显著减轻缺血再灌注后 的开放程度,上调相关蛋白.、 和.的表达。 、对脑缺血再灌注后的调节作用可能与表达减少,降解 减少,.的活性减弱,.表达减少有关,即与/?/信号调 节途径有关。 本研究初步阐明了对脑缺血再灌注大鼠通透性影响的作用机制, 为的临床应用提供了重要的理论依据。