HBV细胞毒性T细胞抗原表位单链三聚体在真核细胞中的表达及其腺病毒载体的构建

HBV细胞毒性T细胞抗原 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 位单链三聚体在真核细胞中的表达及其腺病毒载体的构建 HBV细胞毒性T细胞抗原表位单链三聚体在真核细胞中的表达及其腺病毒载体的构 建 中西医结合痘苤圭!生笙!鲞笠 HBV细胞毒性T细胞抗原表位单链三聚体在真核细胞中的 表达及其腺病毒载体的构建 周伯平张红梅陈心春黄瑛LybargerLonnie 李美忠聂广乐晓华王火生袁静 1.深圳市东湖医院(广东深圳,518020)2.DepartmentofCellularBiology,UniVersityofArizona, 1501.N.Campbell,Tucson,AZ,85724 摘要目的:构建乙型肝炎病毒表面抗原细胞毒性T细胞抗原表位单链三聚体(HBsAg.SCT)真核表达载体, 在真核细胞293T中表达,并构建合HBsAg.SCT的腺病毒载体.方法:合成H-2L限制的HBsAg细胞毒性T细胞表位 寡核苷酸,与H一2La分子融合,构建含HBsAg—SCT的真核表达载体,并转染293T细胞,采用流式细胞技术观察HB— sAg-SCT在细胞表面的表达.将HBsAg—SCT亚克隆到腺病毒载体,转染293A细胞,包装产生携带HBsAg.SCT的重组 腺病毒.结果:成功构建了HBsAg.SCT真核表达载体,并在真核细胞 中表达.利用重组腺病毒载体制备出高滴度的 重组腺病毒.结论:合HBsAg—SCT的真核表达载体能够在真核细胞 表面有效表达,获得合HBsAg-SCT的重组腺病毒, 为研究HBsAg—SCT免疫治疗HBV感染打下基础. 关键词乙型肝炎病毒表面抗原;细胞毒性T细胞表位;单链三聚体;重 组腺病毒 EukaryoticexpressionofHBVCTLepitopesinglechaintrimergeneandcon- structionofHBsAg.SCTrecombinantadenovirusvector chun,eta1.ShenzhenD ZHOUBo-ping.ZHANGHong—mei,CHENXin— onghuHospital(ShenzhenGuangdong,518020) China AbstractObjective:ToconstructaneukaryoticexpressionvectoroftheHBVCTLantigenepitopesinglechaintrimer (HBsAg—SCT)gene,andexpressin293Tcell,atthesametime,constructtheadenoviralexpressionvector.Methods:An oligonucleotideofHBVCTLepitopewassynthesizedandfusedwithH一 2LDNAmoleculetoconstructtheeukaryoticexpression vectorcarryingtheHBsAg—SCTgene,thentherecombinantplasmidwastransfectedinto293Tcells,theexpressionwasdetected byflowcytometry.TheHBsAg—SCTgenewassubclonedintoanadenoviral expressionvector,thentransfectedinto293Acells forpackagingandamplificationofrecombinantadenovirus.Results:Theeuk aryoticexpressionvectorcarryingHBsAg-SCTgene wasconstructedsuccessfully,andtheexpressionin293Tcellwasproved.Thehightiterrecombinantadenoviruswasgenerated utilizingtherecombinantadenovirusvector.Conclusion:TherecombinanteukaryoticexpressionvectorexpressedHBsAg—SCT effectively,therecombinantadenoviruscanbeusedinfurtherstudyoftheimmunitytherapyforchronicHBV. KeyWordshepatitisBsurfaceantigen:cytolyticTlymphocyteepitode;singlechaintrimer;recombinantadenovims 单链三聚体(SCT)是应用分子生物学技术将MHCI类 分子重链L,Bm链,细胞毒性T细胞(CTL)表位肽用寡核 苷酸肽链连接起来的复合物.SCT在诱导细胞免疫时,可以 避开复杂的抗原肽处理和递呈过程,使抗原表位可以稳固地 结合在MHC分子的抗原槽内,而不至于被其他抗原肽竞争而 从MHC分子表面脱离,从而增加对特异性T细胞受体 (TCR)的激活活性.单链三聚体技术目前已在肿瘤疫苗的应 用研究中取得令人鼓舞的结果0J. HBV抗原表位肽$28-39(IPQSLDSWWTSL)能够高效, ? 19? 特异地诱导CTL产生,结合于IJd的HBsAg肽$28.39与CTL 上的TCR有很高的亲和力,能高效诱导CTL产生一. 因此,本研究选择HBV抗原表位肽$28.39与MHCI类 分子重链L,Bm链连接,构建真核表达载体在293T中表达, 并构建含单链三聚体基因的腺病毒载体,为进一步研究将 HBsAg-SCT作为慢性乙型肝炎治疗性疫苗打下基础. 1材料与方法 1.1实验材料含有H-2IJd的真核表达载体(plRES.L)由 LybargerLonnie实验室保存.编码HBV抗原表位肽$28.39 ? 20? (IPQSLDSWWTSL)寡核苷酸由亚利桑那大学合成.抗天然结 构的H一2L重链的抗体(克隆$30—5—7)由LybargerLonnie实 验室制备.pENTR/D.TOPO克隆试剂盒,腺病毒表达载体 pAd/CMV/V5一DEST,DNA转染试剂盒Lipofectamine2000均购 于invitrogen公司;高保真DNA聚合酶,限制性内切酶,质粒 提取试剂盒与琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自Takara公司;快 速腺病毒感染性滴度(TCID50)检测试剂盒购自北京本元正 阳基因技术股份有限公司,测序仪为ABI3100;电转仪为宁波 新芝生物公司产品. 12HBsAg—SCT基因片段的获取按文献报道的方法,人 工合成两端分别带--4’段DNA接头的HBV表面抗原CTL抗 原表位肽($29—38)的寡核苷酸片段,与两端带接头的p:m 寡核苷酸片段混合变性后自然冷却至室温使其发生退火,其 后将混合物与pIRES—L进行连接,形成HBsAg$28—39?13:m ? IJd单链三聚体复合物(HBsAg—SCT),命名为pHBsAg—SCT, 并测序鉴定HBsAg—SCT的正确性. 13重组质粒pHBsAg.SCT转染293T细胞以含10%小牛 血清的DMEM培养基培养293T细胞,转染前24小时,以胰 酶?肖化细胞,按5×10细胞/:E接种于6孑L板中,于细胞 50%一80%融合时,分别取1,2lxg质粒pHBsAg—SCT和20lxl 脂质体溶于100~1和80l无血清培养基中,合并两种溶液, }昆匀,室温放置l5分钟,加800~1无血清DMEM培养基,混 匀后将此}昆合液加至用无血清DMEM培养基轻洗过的细胞 中.继续培养过夜,弃去转染液,加2ml完全培养基继续培 养,24小时后用抗天然结构的H一2L重链的抗体经流式细胞 技术检测HBsAg—SCT在293T细胞膜表面的表达.采用同样方 法用不含HBsAg的IJd质粒和含其他抗原表位(QL9)的质粒 转染细胞,流式细胞技术检测进行对照. 1.4HBsAg—SCT基因亚克隆至入门载体pENTR/D—TOPO设 计引物,在上游引物5’端加上接头CACC与载体进行连接, 上下游引物序列分别为5’-CACCATGGCTCGCTCGGTGACCCTG 一 3’和5’-TCACGCqqTACAATCTCGGAG一3’,由TaKaRa大连宝生 物工程有限公司合成.以质粒pIRESneo—HBsAg?L为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 , 扩增HBsAg?L(1515bp)片段.PCR反应体系为DNA 05Ixl,1U/lpfu酶0.5Ixl,10mmol/LdNTP2.5Ixl,上游引物 1Ixl,下游引物1l,10×缓冲液2.5l,灭菌水17l,共 25l.反应条件为95oC2分钟,94?50秒,65?50秒, 72oC1分钟,30个循环,最后72?延伸l0分钟. 纯化回收PCR扩增产物,按pENTR/D—TOPO克隆试剂盒 说明 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 操作与入门载体pENTR/D—TOPO进行连接,取连接液 转化TOP10感受态细胞,在含卡那霉素的SOC固体培养基上 37~C培养过夜,对筛选出的阳性菌落扩大培养,抽提质粒采 用酶切鉴定有无插入片段,最后对酶切电泳鉴定正确的重组 质粒中的HBsAg—SCT基因片段进行测序鉴定. 15重组pAd/HBsAg—SCT腺病毒的构建将入门载体pEN一 sgS与腺病毒载体pAd/CM~/~5及TEbuffer,LR Clonase11enzyme}昆合,25qc孵育1小时后.加入蛋白酶 医结合肝病杂志!生笠!!鲞笠! K37~C温育10分钟.取2—31xl反应混合物采用电击法转化 DH50【感受态细胞.电击条件为:2mm电击杯,C25IxF,R 20011.U2.5KV.经氨苄青毒素筛选,提取质粒进行酶切和 测序鉴定. 1.6重组pAd/HBsAg—SCT腺病毒的包装,扩增和滴度测 定大量制备重组腺病毒质粒pAd/HBsAg—SCT,经PacI线 性化后,按Lipofeetamine2000试剂盒操作说明转染293A细 胞,1013天后待约80%被转染细胞出现细胞病变效应时, 收集细胞,将细胞及培养上清液转移至一无菌离心管,一 80~C/37~C反复冻融3次,室温3000rpm离心15分钟,收集 含重组腺病毒颗粒的上清液,一80~C保存. 取收集病毒上清液再次感染80%一90%融合的293A细胞 扩增腺病毒,感染2,3天后,待出现80%一90%的细胞聚 集,脱落时,收集细胞和培养上清液,一80~C/37~C反复冻融 3次,离心收集病毒粗制液.将腺病毒粗制液进行l0一l0 倍稀释,分别以不同的稀释倍数感染293A细胞,68小时后 检测病毒滴度,按快速腺病毒感染性滴度(TCID50)检测试 剂盒说明书进行操作,显色液显色,计算半数组织培养感染 量结果. 2结果 2.1含HBsAg.SCT的真核表达载体在293T细胞表面的表 达经特异性抗体流式细胞技术检测显示,与空白对照及不 含HBsAg的IJd片段相比,连接了HBsAgCTL表位的L片段 HBsAg—SCT在293T细胞表面的表达显着增高,含其他抗原表 位(QL9)的SCT也能在细胞表面表达,但表达效果不如 HBsAg—SCT,如图1. ,: 霜 皇 十 t 图1HBsAg—SCT在293T细胞表面的表达 -7)hHBsAg?L a.dL(mAbd30-5 cLd.QL9?L d 2.2HBsAg—SCT基因的亚克隆及pAd/HBsAg—SCT腺病毒载 体的构建HBsAg—SCT片段的扩增产物为大小约l500bp的片 段,将其亚克隆至入门载体pENTR/D.TOPO后,采用BamH I和Pst1分别酶切鉴定,重组成功的质粒pENTR/HBsAg— SCT应分别出现,4lOObp的l条DNA条带和一250bp,, 600bp,一3400bp大小的3条DNA条带,如图2,其序列测 定结果与插入片段完全一致. 医结合肝蠢2生筮!Z鲞1 6:肆3b霉 ?00 脚 ,.bp 图2pENTR/HBsAg-SCT的鉴定 aDL2000DNAMarkerb.k-Hind11IdigestMarker C.BamHI酶切重组质粒d.PstI酶切重组质粒 重组质粒与腺病毒骨架质粒进行同源重组后,分别采用 BamHI和EcoRI酶切重组质粒pAd/HBsAg.SCT鉴定.用 EcoRI酶切时,重组成功的质粒pAd/HBsAg.SCT应出现大小 为526bp,1323bp,1994bp,6772bp25403bp的条带;采 用BamHI酶切时,重组成功的质粒应出现大小为516bp, 1462bp,14529bp,19512bp的条带(图3).对重组质粒 pAd/HBsAg—SCT的测序结果显示与插入片段完全一致,5’端 接头处序列无误. l孵抽 ? l撕 图3pAd/HBsAg-SCT的鉴定 ak-EcoT14IdigestMarkerb.DL2000DNAMarker C.EcoRI酶切重组质粒d.BamHI酶切重组质粒 2.3重组腺病毒在293A细胞中的制备及其滴度的确定用 快速腺病毒感染性滴度检测试剂盒检测,通过抗5型腺病毒 外壳蛋白的单抗与感染了腺病毒供试样品的细胞结合,再用 辣根过氧化物酶标记的二抗与一抗结合,显色液显色,被感 染的细胞显示出明显的棕色.图4中为不同滴度腺病毒感染 细胞的免疫显色结果(见封三). 3讨论 目前慢性乙型病毒性肝炎(慢乙肝)的发病 机制 综治信访维稳工作机制反恐怖工作机制企业员工晋升机制公司员工晋升机制员工晋升机制图 仍未彻 底明了,但一致认为慢乙肝的发病主要是机体对乙型肝炎病 毒(HBV)免疫耐受的结果.多种机制可以导致免疫耐受的 形成,其中抗原递呈细胞表面病毒特异性抗原表位的表达强 ? 21? 度是影响有效免疫产生的重要环节.很多病毒如CMV, EBV等干扰抗原处理和递呈过程中的多个环节,从而抑制或 减弱病毒抗原在APC表面的表达.HBV也存在同样的免疫抑 制机制,而且,HBV变异株的抗原表位肽可以竞争性拮抗野 毒株抗原表位在MHC分子的表达,从而抑制细胞免疫的产 生.如何诱导机体产生有效的针对HBV特异性免疫,主要 是细胞免疫,是控制慢乙肝的关键. 体内多克隆特异性CTL应答的产生受MHCI类分子提呈 到细胞表面的抗原肽的免疫原性限制,抗原肽与MHCI类分 子重链肽结合槽间的相互作用可影响其稳定结合.通过基因 工程将CTL抗原表位肽一MHC重链.pnl轻链融合形成SCT结 构,表达的抗原表位肽通过寡聚核苷酸肽链与MHC分子连在 一 起,MHCI类分子重链由抗原肽C端延伸的连接方式可显 着增强抗原表位在MHC分子重链肽结合槽内结合的稳固性, 而不被其他非特异性和自身抗原肽竞争替换,或从MHC分子 脱离,从而增加对特异性TCR的激活活性;pin促进抗原肽 与细胞表面的结合,增加抗原肽的有效提呈J.抗原肽可 在细胞表面稳定表达,且可以避开复杂的抗原处理和递呈过 程,从旁路促使MHCI类分子将抗原肽提呈给专职APC(如 DC)表面. 本实验构建的HBsAg—SCT真核表达载体可以在293T细胞 表面有效表达,表达的分子具有天然的结构,能够被天然H. 2的特异性抗体识别.表面HBV抗原表位肽$28.39 (IPQSLDSWWTSL)不但能够正确的递呈在H-2L表面,还显 着增加了H一2La在细胞表面表达的强度,这与文献报道的 IPQSLDSWWTSL具备显着表达特点一致.实验中还成功构建 了含HBsAg?SCT重组腺病毒,并在293A细胞中制备出高滴 度的重组腺病毒,为研究HBsAg—SCT免疫治疗HBV感染打下 了基础. 参考文献 1HuangCH,PengS,HeL,eta1.CancerimmunotherapyusingaDNA vaccineencodingasingle—chaintrimerofMHCclassIlinkedtoall HPV-16E6immunodominantCTLepitope.GeneTher , 2005,12 (15):1180.1186 2HungCF,CalizoR,TsaiYC, eta1.ADNAvaccineencodingasin. gle.chaintrimerofHAL-A2linkedtohumanmesothelinpeptidegener. atesanti.tumoreffectsagainsthumanmesothelin-expressingtumors. Vaccine,2007,25(1):127.135 3lshikawaT,KonoD,FowlerP,eta1.Polyclonalityandmuhispecifici. tyoftheCTLresponsetoasingleviralepitope.Jlmmunol,1998,161 (11):5842-5850 4SchirmbeckR,StoberD,E1-KholyS,eta1.Theimmunod0minant. Ld_restrictedTcellresponsetohepatitisBsurfaceantigen(HBsAg)ef- ficientlysuppressesTcellprimingtomultipleDd一 , Kd一.andKb.re. strictedHBsAgepitopes.Jlmmunol,2002,168(12):6253-6262 5YikY.L.Y,NetuschilN ,LybargerL,eta1.CuttingEdge:Sin. gle.ChainTrimersofMHCClass1MoleculesFormStableStmctruesthat potentlystimulateAntigen-SpecificTcellsandBCells. TheJournal0f Immunology,2002.168:3145-3149 ? 22? 6ChuCM.Liaw,YF.NaturalhistoryofchronichepatitisBvirusinfec’ ti0n:animmun.path0l0gicalstudy.JGastroenterolHepatol,1997,12 10):s218—222 (9— 7HosonoS,TaiPC,WangW,eta1.Coreantigenmutationsofhuman hepatitisBvirusinhepatomasaccumulateinMHCclass?一restrictedT cellepitopes.Virology,1995,212(1)151-162 医结合肝病杂志27生箜!Z鲞箜 8StoberD.TrobonjacaZ,Reimannj,eta1.Dendriticceilspulsedwith exogenoushepatitisBsurfaceantigenparticlesefficientlypresentepitopes t0MHCcInssI.restrictedcytotoxicTcells.EurJImmunol,2002,32 (4):1099一l108 (收稿日期:2006—12—12编辑:彭萌) 酒精性肝硬化失代偿期合并急性原发性闭角型青光眼1例 杨阳韩丽红杨龙 武警上海市总队医院传染科(上海,201103) 1病史摘要 患者男性,60岁,2006年8月8日因反复乏力,纳差, 尿黄1年,加重并伴视物模糊2天入院.于1年前开始出现 轻度乏力,纳差症状,并伴有尿色加深,未行任何检查及治 疗.2天前上述症状明显加重并伴有头痛,眼胀及视物模糊, 至外院眼科就诊,诊断为急性原发性闭角型青光眼.予1%毛 果芸香碱滴眼液治疗,同时发现患者巩膜明显黄染.查肝功 能提示ALT70U/L,TBil851J,mol/L,AST150U/L,DBil 521,tmol/L,Alb23ec’L,GGT210U/L,凝血酶原时间l9秒, 为进一步检查治疗住入我科.患者有近40年的饮酒史,近4 年来因家庭关系不和睦,饮酒量较前明显增多,折合酒精> 65g/d.既往多次单位体健肝功能ALT波动在200U/L左右, B超提示慢性肝损害,患者未予注意.近一年出现不适症状 以来仍大量饮酒.30年前因胃溃疡穿孔出血行胃大部切除术, 否认输血史,血吸虫疫水接触史及其他病史.查体可见神清, 精神萎,慢性肝病面容,面部毛细血管明显扩张,皮肤巩膜 中度黄染,肝掌明显,未见出血点及蜘蛛痣.心肺无明显阳 性体征,腹平,全腹软,无压痛,反跳痛,肝肋弓下1指, 质硬,脾肋弓下未及,肝区无叩痛,移动性浊音阳性,双下 肢胫前凹陷性水肿.入院诊断:?酒精性肝硬化失代偿期; ?急性原发性闭角型青光眼.入院后尿常规发现胆红素2+, 凝血酶原时间23秒,电解质血钾3.2mmol/L,余血常规,粪 常规,大便隐血,肾功能,空腹血糖,血脂,肿瘤指标,自 身免疫性抗体及肝炎病毒甲,乙,丙,戊型血清标志物等实 验室检查未见明显异常.查腹部超声示肝硬化,轻度脾肿大, 腹水,胆囊壁毛糙.嘱患者戒酒,予保肝,利尿,改善低蛋 白血症,肝性脑病及其他维持水,电解质及酸碱平衡等治疗, 同时患者每日仍使用毛果芸香碱滴眼液,症状明显时加用甘 露醇静滴降低眼内压.此后患者电解质紊乱纠正,低蛋白血 症改善,复查肝功能逐渐好转,腹水量减少,期间复查3次 眼内压为15mmHg,18mmHg,16mmHg.入院45天后复查肝 ? 病例报告? 功能提示ALT28U/L,TBil18.5p.mol/L,AST35U/L,DBil 6I,tmol/L,Alb36s/L,腹部B超未见腹水,凝血酶原时间 14.3秒,准予出院. 2讨论 急性原发性闭角型青光眼的发生一般认为须具备两个因 素:眼球解剖结构的异常以及促进发生机制的存在.促发因 素临床上最多见的是情绪波动,其余的有过度疲劳,近距离 用眼过度,暗室环境等.其形成机制可能与上述刺激直接或 间接引起眼部自主神经功能的紊乱,交感一副交感神经系统 失衡,使得瞳孔扩大并增加瞳孔阻滞;或睫状肌调节痉挛, 顶椎根部虹膜向前等共同导致了狭窄的房角堵塞关闭,促使 青光眼发病…. 该患者入院前经眼科专科检查已证实其闭角型青光眼的 解剖结构存在,加之长期酗酒,情绪时有波动,已经具备了 原发性闭角型青光眼的发病条件,但多年来患者未感觉眼部 不适.本次人院前2天患者乏力,纳差症状较前明显加重, 同时出现视物模糊,即肝硬化病情加重的同时出现急性青光 眼的症状,故考虑本次患者青光眼的急性发病与患者肝功能 的急剧恶化有关.患者肝硬化出现门静脉高压,严重低蛋白 血症等一些与肝硬化腹水产生机制相似的因素,使房水生成 大量增加.中医认为原发性青光眼的病因病机系肝所为,因 “目为肝之窍”,目为肝之外候,由于忧思郁怒,肝气郁结. 气郁化火,上攻于目,或肝郁困睥,睥湿生痰,痰火上扰. 导致目络受阻,或竭思劳神,真阴暗耗,阴虚阳亢或肝胃虚 寒,饮邪上犯,致使目中气机郁闭,气血失畅,玄府闭塞, 神水淤积而成病. 参考文献 1葛坚,崔浩,眼科学.北京:人民卫生出版社,2002.114 2陈艳蕾,王学昌,陆惠,原发性青光眼从肝论治5O例.安徽中医 临床杂志,2003,15(3):22 (收稿日期:2006—11一叭编辑:朱清静) 清胆滋肾汤对妊娠期肝内胆汁淤积症大鼠肝脏 ICAM一1及胎盘ER的影响(正文见31页) 吴献群等(湖北省中医院妇产科,湖北武汉430061) 图1正常组大鼠肝脏lCAM,1阳性细胞低表达 SABC免疫组化法,DAB显色(X200) 图4正常组大鼠胎盘ER免疫组化阳-性细胞低表达 SABC免疫组化法,DAB显色(X200) 图2模型组大鼠肝脏lCAM,1阳性细胞高表达 SABC免疫组化法,DAB显色(X200) 图5模型组大鼠胎盘ER免疫组化阳性细胞高表达 SABC免疫组化法,DAB显色(X200) 图3#/1~J量组大鼠肝脏lCAM,1阳-性细胞低表达 SABC免疫组化法,DAB显色(X200) 图6#/1~J量组大鼠胎盘ER免疫组化阳-性细胞低 表达SABC免疫组化法,DAB显色(X200) HBV细胞毒性T细胞抗原表位单链三聚体在真核细胞中的 表达及其腺病毒载体的构建(正文见2顶) 周伯平等(深圳市东湖医院,广东深圳518020) a C 图4重组腺病毒的扩增和病毒滴度测定(免疫显色结果) .腺病毒稀释1O’倍b腺病毒稀释1O倍c腺病毒稀释1Os倍d未感染病毒的 293A细胞 b d