正交试验优化ELISA检测中TMB_HRP显色体系的研究

较一致．与张卉等１ ２研究结粜荆似；Ｅ撤道ＥＬＩＳＡ的ｉ敏度 （１０’一１０６    ｃｆｕ／ｍＬ）对ｒ鉴定娃症柚株Ｌ∞病朦细菌自☆样性 ｍ】，与Ｐｅｔｃｂ砌…Ｔｈ 培养甚上的蒴落是足够的”，两种抗体∞Ｒ救度均为１０’ｔ：ｆｕ／ ｍ日ｌ'。Ⅲａｐｏｒｔ“等相同．Ⅱ满Ｅ病害幢测的     需求，但由于本试验采坩白勺是多克降抗傩．ｍ ＥＬＩＳＡ的ｉ敏度 和特异性与抗悼的纯度相Ｘ，要捉岛抗体的纯度．可使用单克 隆抗体．“提高ＥＬＩＳＡ拴测的灵敏崖刺特异性 机原｛同＃＃旅《Ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｏｆ¨\u65356Xｉｇｅｎ 目ｓ    ｗ＃＃＃Ａ敏ｌ■≈ ＊Ｈ自＊镕‰ⅢＭ镕∞“＊ｍ＊ｍ＾§\u33258XＭ＊∞Ｍ“ Ｆｉｇ ｇ    １ｋｔ一¨\u65287XａＩ…＿＿ｎｆ……ｖｔｖ    ｏｎｌｗｏ．．．．ｔｉ［Ｒ Ｍｌｉｅ＾ Ｎｏｔｅ：Ｈ    ｉｓ    ａｔｌｔ＿｜ｂｏｄｙ    ｐｒｅｐ哦ｄ ｗｉｔｈ    Ｐ¨\u8546X忡ｍ“…ａｎｌ。＃ｅｎ．ｍ…ｍ ＆：‰ｍ镕Ⅸｌ一８ＨｍⅨ∞：Ｉ（Ｐ Ｎｍｃ．ＦｒｏｍＩ…８ｌｉｆ－：Ｃｏｎｃ…ｎｏｎ ｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ＊１０。１０７，１０６．１０５．１０‘． １０’１０２    ａｎｄＩＯ ｃｆｕ／ｍｌ    Ａｌ…ＢＨ    ａｎｄ    Ｂｌｉｎｅｉｓ    Ｐ２ ｝｝女ｍ： ‘１：“Ｋｍ．《＊＊，＊＆ｍ∞ｍ目＊％ｈ＃自ｃｕ    ＰＶ∞自镕《２ Ⅱ１６Ｓ    ｒ１）ＮＡ＃“Ｈ＊［】】ｍｍ女ｎ★｛｛ｍ．２００８．３９（６）：６８２一 Ｍ５ ７２≈ｗ％．｝￡，ｍ＊＃．＃≈《＃％ＰｅＲ☆＆ⅫｐｉⅢⅫ自＃＊ｍ 自ｆ Ｊ女ｑＬｍ自＆｝｝ｍ．２００６，１４《６）：９４６    ９５Ｉ ３ｌｉ＊．ⅢｌｔＲⅫ＊ｔ＃ｔ＊日目＃＃｛自＊＆＆Ｄｍ—ＥＬＩＳＡ ＆Ⅻ研Ⅱ『Ｊ］ｍ｛自￥№Ｈ    ２０９８    ３５（２）．２３０圳 『４    Ｍ女《．Ⅻ＊，ｆｉＨ＃＆自ＤＡｓ    Ｄｏｔ    ＥＬＩＳＡ＃＊日ｍｍ自 ｎ＊斑‰自ｆｊ】ｍｔ＃々ｍｍ    ２０ｌｏ    ３７（１０）：１５５Ｉ    １５５６ ｆ５］＊＆ｍ．※＃＃．ＦⅢ≈¨\u65321XＳＡⅡ女目＊％ＨＲ＆Ｍ＊∞Ⅻ自Ｋ 目ｇ自＊∞＾＆№＃【Ｊ］ｎ＃＆《．２０∞，２２ｆ ５）：２７５—２７８ 『６ Ｊ＊＆Ⅱ．自ｍ＊ｎ＃Ⅱ＃崭Ｈ目目∞＆ｇ自《２＃￥【Ｊ】月ｎ女 －№＃学，２００９．１２（８）：３０—３２ ［７ ７＊☆日．＃＃，＊＾＊，＊“片｛ⅨⅢＰＣＲ    ＤＨＰＩ＿ｃ＃￥＆Ｍ＾＃ Ⅲ＊性＃＃自＊∞Ⅲ％。Ｊ］＊自目ａ｛Ⅷ２０１０    ４０｛５）４４９    ４５５ ［８］Ｍ‰４．镕＊＊，目☆§\u65357X＆々＃￥Ａ＃＃毛，｛十∞＆月Ｍ］“ ｍ十Ｊ日《ｎ＾｛‘ｉ．ｍ＃，１９９８“５７ ｜９］ⅫｉⅨ，※＊Ｘ，Ｊ目ｗ＃ｒｂ镕ｍ＆Ｋ＊±\u65298X＆ｍ镕自±\u8240X自∞Ｗ ％『Ｊ］女ｎ±\u65290X＃￥￥ｍ，１９９６．４（４）：３５４    ３５８ ［Ｉ。】＊∞＃＊ｚ｝９％¨\u65290X＂＊ｎｍ镕ｍ镕¨\u65290X《８自＊☆＆ ＃＊＊女Ⅻ＃∞《＾＆ｎ“＃｝＆＆±\u8734X＆Ⅲ［Ｊ Ｊ￥自Ａｎ＾＃｛ ｍ    １瑚．ＪＩｆ２】：９    １５ ［１１ｊＩ'ｅｌｃｈ岫１    ｎ ｎ＿¨\u65343X盯¨\u65321X｝ｒ。ｕ”Ｉ—ｐｌ＂Ｓｉｎｌｈｏｒ    Ｉ№ｓ—ｓⅡ曲啦ｌ阻ｒ 日ⅢｄｂｅａＥｅｉｎ ｃｕｃｕｒｂ№＂ＥＬＩＳＡ岫ｈ“ｑ”｝Ｍ］Ｋ｝ⅢＫＨ㈨（ｍｌ“ １洲ｊ）２００２：３６１—３７５ 【１２］ｍ＊ＩＭＳ—ｆｔＲ＃＊＊＃自＊№ｍ＾￥＃ｆ＊＊Ⅲ％［ｎ￡ ｎ女¨\u9733X｛２０９３：４ ｆ１３］ｍＩⅣ－““ｔ‘｝”ｇ“《ｇ＃≈ⅫＲⅫ＆￥∞＂￥ⅢＥ【Ｊ】 ｍ＃☆４＃ｍ    １９８７    １７（４）．２２    ２４ Ｌ１４］＊＃＊ｎ＊《自Ｉ）～Ｅｌ『ｓ＾＆Ⅻ＾＆∞＆Ⅱ々ｍ…ｆ１’Ｊ    Ｍ Ｊ￡女ｎ女｝２０１０：４ １５ ＪⅫ｛《ｉｉ＊ｍ∞￥ＭⅫ自＆ｗＷ日＊目｛ｏ＊々☆『Ｊ］自 ｂｏｄｙ Ｐ”ｌｃ…。”“ ＃Ⅲ女２００９ ７ｆ３—４）２ＩＩ    ２１７ 正交试验优化ＥＬＩＳＡ检测中ＴＭＢ／ＨＲＰ显色体系的研究 桑延霞，周天鸿，琼莫，邱戋兰，蒋德旗，王从峰，冉艳红，李弘剑１ （口南大学牛命科学与技术学院，１'东广州５ｉ０６３２） 摘要目的建口ＥＬＩＳＡ Ｒ也体系∞优化ｎ法．优化Ｉ'ＭＢ／ＨＰＲⅡ色§\u32479X∞Ⅱ■錾敬 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 前先采Ｉ｝】单目隶Ｅ骑研究Ｈ色 体幕巾的缓冲溶液ｐＨ    ＴＭＢ浓度、Ｈ，帆浓度ⅢＩ锄ｔ问ⅧｎＪⅡ¨\u8545XＥ∞蟛响，ｎ此基ｍ Ｊ。，Ｐ｝进行５ ｗ紊４水平白勺¨\u65318X盘试骑：结 ￥：ＴＭＩＩ／ｌＩＲＩ，体系的最佳Ｉ怍条件缓冲涟ｐｔＩ＊５ ｏＩ'ＭＢ澉《～２ ５ｌＵ∥ｍｌ，¨\u65321XＯ？浓崖☆０ ０３％（Ｖ／ｖ），匣应温度为３０一 ５０℃．Ⅱ脯时目～１０ｍｉｎ，结论优化的ＴＭＢ／ＨＲＩ’Ｒ什Ⅱ应条件，ｒⅡ“槽址啦Ⅱ臆的站求．所建立的Ｉ'ＭⅣＨＲＩ’体系的优化方 万方数据 ２０１１年２ｌ（２） 法也适用于其它ＥＬＩＳＡ显色系统的优化。ｌ， 关键词：ＥＬＩＳＡ；正交试验；ＴＭＢ；ＨＲＰ 生物技术 ， ． 中图分类号：Ｑ５０３    文献标识码：Ａ    ｄｏｉ：１０．３９（，９／ｊ．ｉｍａ．１００４－３１ＩＸ．２０１１．０２．０５０ Ｏｐｔｍｉｚｉｎｇ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ    Ｃｏｎｄｉｃｔｉｏｎｓ ｏｆ    ＴＭＢ／ＨＲＰ    Ｓｙｓｔｅｍ ｂｙ    Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ    Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ 、 ＳＡＮＧ Ｙａｈ—ｘｉａ，ＺＨＯＵ Ｔｉａｎ—ｈｏｎｇ，ＣＨＥＮＧ    Ｙｉｎｇ，ＱＩＵ    Ｍｅｉ—ｌａｎ，ＪＩＡＮＧ    Ｄｂ—ｑｉ，ＷＡＮＧ    Ｃｏｎｇ—ｆｅｎｇ，． ＲＡＮ    Ｙａｈ—ｈｏｎｇ。Ｕ Ｈｏｎｇ—ｊｉａｎ‘ （Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。Ｇｕａｎ曲ｏｕ ５１０６３２．Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｄｉｖｅ，．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ８１１    ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｅ ｓｕｂ６ｔｒａｔｅ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ ＥＬＩＳＡ    ｔｏ    ｏｒ，ｔｉｍｉ舱ｔｈｅ    ｒｅａｅｔｉｏｒｉ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＴＭＢ／ＨＲＰ ｅｈｒｏｍｏｇｅｎｉｅ ｓｕｉ皓ｔｒａｔｅ    ｓｙｓｔｅｍ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ｓｅｖｅｒａｌ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ    ｗｅｒｅ    ａｐｐｌｉｅｄ    Ｉｏ    ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｅｆｌ'ｅｅｔｓ ｏｆ ｃｏｎｃｅｌｒｌ－ ｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＭＢ ａｎｄ Ｈ２０２，ｐＩ－Ｉ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｉｍｅ    ０１１    ｅｈｒｏｍｏｇｅｎｉｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｂａ艘ｘｌ Ｏｎ    ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔｓ，ｔｈｅ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ ｍｅｔｈｏｄ    ＷａＳ    ｕ８ｅ ｔｏ ｆｕｒｔｈｅｒ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐａｒａｍｅｔｅｒ８．Ｒｅｓｕｌｔ?Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ    ＷｅｌｒＣ    ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ—ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ ｂｕｆｆｅｒ ｏｆ ｐＨ    ５．０，２．５ｍｅ／ｍｌ ＴＭＢ。０．０３％（ｖ／Ｖ）Ｈ２ ０２，３０—５０℃ｏｆ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｌＯｍｉｎ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｃｏｎｄｎｓｉｏｌｍ：‘Ｔｈｅ ｏｐ－ ｔｉｘｉｕｄ    ｒｅａ６Ｃｔｉｏｎ ｐａｚａｍｅｔｅｒ８ ｏｆ ＴＮＢ／ＨＲＰ ｓｙｓｔｅｍ    Ｗｅｌ'ｅ    ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ    ＷａＳ    ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｔｈｅｒ ｅｈｒｏｍｏｇｅｎｉｅ ｓｕｂ－ ‘ ‘ ｓｔｒａｔｅ    ｓｙｓｔｅｍｓ ｏｆ ＥＬＩＳＡ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＥＬＩＳＡ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ    ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ；ＴＭＢ；Ｉｔｌｉｐ ＥＬＩＳＡ试验中的显色过程是决定试验成败的关键，在 ＴＭＢ／ＨＲＰ显色体系中，ＴＭＢ和Ｈ２０２的浓度，显色缓冲溶液 １．２    方法 １．２．１显色液的配制 ‘‘ 的ｐＨ及显色的温度和时间是影响显色的重要因素。ＴＭＢ或 Ｈ２０２浓度过低，不能使反应充分进行；而ＴＭＢ或Ｈ：０：浓度 过高，则容易导致非特异性显色或抑制Ｈ１１Ｐ酶的活性。此外， 显色缓冲溶液的ｐＨ值对ＴＭＢ的溶解度及ＨＲＰ的活性也有 一定的影响，因此提高ＴＭＢ溶解度，控制Ｈ：０：浓度和ｐＨ值， 精确称取ＴＭＢ溶于ＤＭＳＯ中配成５ｍｇ，'ｍｌ的储备液，置于 ４０Ｃ保存。显色时。在醋酸钠一柠檬酸缓冲溶液中（ｐＨ    ５．５， ｏ．１ｍｏｌ／Ｌ醋酸钠，０．０１３ｒｍｌ／Ｌ柠檬酸，０．５ｎｎｏｉ／Ｌ ＥＤＴＡ。５％（Ｖ／ Ｖ）甘油）加入ＴＭＢ储备液和心０２，配制成显色液，现用现配ｏ‘ １．２．２间接ＥＵＳＡ法 是ＥＬＩＳＡ显色的关键，同时反应时间和反应温度也是不可忽 略的因素。由于涉及商业机密，显色液的配方极少公开，有关 间接ＥＬＩＳＡ的方法步骤见参考文献［１］。 １．２．３正交试验 。 一 ＴＭＢ／ＨＲＰ显色参数的报道也非常有限，不能满足实际需要。 因此，本文通过单因素试验，初步探讨了ＴＭＢ／ＩｔＰＲ显色体系 中主要因素对显色反应的影响，并在此基础上，应用正交试验 对各因素的反应参数进行了系统的优化，优选出最佳反应条 件。这一方法也适用于其它的ＥＬＩＳＡ显色体统的优化。 ｌ材料与方法 １．１材料 １．１．１实验材料 短肽修饰后的胰高血糖素样肽一ｌ（Ｇｌｕｅａｇｏｎ—ｌｉｋｅ    ｐｅｐｔｉｄｅ —１）ｓＣ为抗原。Ｓｃ抗原、抗ｓＣ的多克隆抗体及阴性血清均由 作者实验室制备；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔ＩｇＧ购自Ｐｒｏ－ ｔｅｉｎ＂ｌ'ｅｃｈ公司ｏ １．１．２试剂 ＴＭＢ购自Ｓｉｇｍａ公司；氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钾、十二 水合磷酸二氢钠、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸、双氧水、吐温２０均 为市售分析纯。 收稿日期：２０１０—１２一１６；修回日期：２０ｌｌ一０２—２ｌ 作者简介：桑延霞（１９７７一），女，博士生，研究方向：幕因工程药物。发 表论文４篇．Ｅｎｕｉｌ：ｙｒａｍｇ＠１６３．ｃ：ＯＩＩＩ。周天鸿，男，教授，博士生导师． 从事医学分子遗传学和人巨细胞病毒研究，发表论文８０多篇。?通 讯作者：李弘剑（１９６６一）。女，教授，博士生导师，从事基因工程药物及 人巨细胞病毒研究，发表论文５０余篇，Ｅｍａｉｌ：ｔｌｉｈｉ＠ｊ咖．ｅｄｕ．∞。 万方数据 以ＴＭＢ浓度、Ｉｔ：０：浓度、ｐｉｔ值和反应时间和温度为考察 因素。根据单因素试验的结果，选取４个水平，做５因素４水平