使用差示扫描量热仪测定抗冻蛋白热滞活性方法的研究

使用差示扫描量热仪测定抗冻蛋白热滞活性 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 的研究 使用差示扫描量热仪测定抗冻蛋白热滞活性方法的研 究 生物物理学报 第二十四卷 第六期 二 八年十二月 . . . 使用差示扫描量热仪测定抗冻蛋白热滞活性方法的研究 张 超 , 赵晓燕 , 马 越 , 张 晖, 姚惠源.北京市农林科学院蔬菜研究中心,北京; .江南大学食品科学与 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 国家重点实验室,无锡摘要:抗冻蛋白因具有独特的抗冻活性而被研究者广泛关注。但是,目前抗冻活性的检测没有一个标准的、 统一的检测方法,这严重制约了该方面的研究进展。作者详细研究了采用差示扫描量热仪测定样品热滞活性的方 法,并对该方法的稳定性、专一性和精密度进行评价。结果显示,采用差示扫描量热仪测定样品的热滞活性具有 较高的稳定性、重复性和精密度。因此,差示扫描量热仪法可以作为一种通用的方法进行抗冻蛋白热滞活性的 检测。 关键词:抗冻蛋白;热滞活性;热 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 ;差示扫描量热仪 中图分类号: ,的为 . ? .?,然引 言 而其它文献报道的各不相同, 使用 法测定 的,认为是与其浓 抗冻蛋白 丘 , 具有非 度有关的,在 ~ . ?之间,而等】使用 依数性降低体系冰点的作用,因此可以通过测定其 微量渗透压计测定其活性为 . ? 热滞活性 , 来反 浓度为 ,未详细介绍其它相关测定参数。 映的抗冻活性。目前,检测方法主要有 因此,深入研究测定方法和测定程序对样品 三种:显微镜观察法、微量渗透压计法和差示扫描 的影响,并建立一个有效测定热滞活性的标 量热仪毹 仃 , 准方法是十分必要的。 法 】。显微镜观察法是用肉眼进行观察,主观性 目前,已经有不少研究者使用法测定 强,很难确定统一的标准,即使同一个人测定,也 的【, 叫,但是都没有对其 进行深入的 会存在较大误差刚。微量渗透压计法是根据体系结 研究。本文以 为研究对象,使用法测 晶前后的渗透压变化,通过经验公式来计算, 定,对影响样品的因素进行全面考察, 它受体系溶液种类、浓度、冷台温度程序等影响, 以建立一个有效测定的标准方法。其中,主 是目前较常用的一种测定方法。在相同的测定环境 要研究样品浓度、升降温速率、冰晶含量等因素对 中,微量渗透压计法测定结果的精确度和重复性都 样品的影响,并考察了该方法的稳定性、重 较高,缺点在于无法精确控制和测定体系的冰晶含 复性和精确度。 量,不利于进一步揭示结晶过程中体系发生的变 化 】。法主要通过测定体系结晶过程中吸热 材料与方法 和放热的变化,检测体系发生的物理变化,确定真 实的结晶起始温度,进而获得,测定结果更 加准确客观,而且法可以精确测定体系的冰 .的纯化 晶含量 ,缺点在于检测花费的时间较长,需要高 参照 。】的方法从红萝 卜 非原质体中纯 精度的设备。 化 。 由于没有统一的、权威的测定方法,目 收稿日期: ? . 前使用不同的检测方法或不同的检测程序测定的 基金项目:国家十五攻关项目资助 结果各不相同,无法进行横向比较。比如, 通讯作者:张晖,电话: , 本文采用 法测定红萝 卜舢 ? :. 生 物 物 理 学 报年 . 品结晶的总放热焓。 ? 参照建立的不连续系统 一进行】,并进行一些改 良【】。按照 : 体积分 为了研究不同测定方法对最终的影响, 数 的比例将样品与样品缓冲液. / 本文主要研究了样品的蛋白浓度 . 、 . 、 . 、 . ,. , % 质量分数 , %甘 . 、 . 、 . 、 . 、升降温速率、 、 . 、 、 . 、 . ?/以及不同冰晶含量 油 体积分数 , %巯基乙醇 体积分数 混 合,沸水浴 。将样品注入样品池,分%~ %,质量分数 对的影响。 离胶和浓缩胶的浓度分别为 . % 质量分数 . 法测定样品的稳定性、专一性和 和 % 质量分数 。样品分别在 和 精密度的评价 恒压的条件下在凝胶中迁移 ? ? , 测定方法的稳定性是指采用相同检测方法,在., ,,总电泳 不同时间测定结果之间的差异性,相对差异越小, 则测定方法的稳定性越高。本文采用相同的测定程 时间大约 。电泳结束后,凝胶在 . % 质量 分数 的考马斯亮蓝染色液中染色 ,并在 % 序对同一个样品进行多次测定,测定的时间为每 体积分数 乙酸脱色液中脱色 。样品相对分 天测定一次,每次对样品测定 ~ 次,以 ? 子质量的确定参照标准分子量 低分子量表示结果,测定的升降温速率为 ?/ ,样 标准蛋白 ,华美生物技术有限公司,上海 品的蛋白浓度为 . 左右,体系的冰晶含量 的相对迁移率计算获得。 控制在 ? % 质量分数 ,比较测定结果之间 的差异,确定测定方法的稳定性。 . 测定样品的纯度 将样品 蛋白含量 ?/加入用 测定方法的专一性是指被分析物质在特定分析 洗脱液平衡的色谱柱 ? ,在 方法上产生响应值的稳定性】。本文采用法%~ % 体积分数 的乙腈 含体积分数为 测定样品的置信区间和相对标准偏差 . %的三氟乙酸 中洗脱 ,检测波长 , 来衡量其专一 珈 。 性。将样品平均分为 份,每天测定其中一份的 . 法测定样品 ,测定 次,升降温速率分别为 、 、 . 、 反映样品冰点和熔点之间的差别,要准 、 . 、 . ?/ ,连续测定 天,计算平 确测定,首先要解决的问题就是避免溶液发 均值的置信区间和 见公式 和 。 生过冷现象,采用. , 置信区间 一 ? ,导×?、/ , ,对样品进行退火处理, 可以有效避免过冷状态发生。将样品溶解于 相对标准偏差 × % / 磷酸盐缓冲液 . ,称取 式中: 为平均值, 一仅为置信度, 为标 密封于铝制坩埚中,放置在样品池中央,当设备稳 准偏差, 为样品数量。 定后,首先降温至一 ?,然后升温至 ?,再降 测定方法的精密度是指多次测量结果之间的吻 温至一 ?, 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 体系结晶热和样品熔点 合程度,是通过分析多次测定结果获得的相对标准。接着,缓慢升温至样品体系为固液混合物的 偏差。采用法测定样品的,测定的升 状态,称为保留温度,保留,再将温度 降温速率为 ?/ ,体系的冰晶含量控制在 从瓦降低至一 ?,重复上述过程,在不同的 % 质量分数 ,样品的蛋白浓度为 下停留 ,分别记录不同 下样品体系开始结 ./ 左右,确定其不同时间测定值的平均置 晶的温度,以及结晶热 ? 。以空白坩埚 信区间% 和。 作为对照。冰晶含量和分别按照公式 和 计算。 一结果与讨论 其中, 为样品中的冰晶含量;? 为保留温 .的纯化及其鉴定 度停留后继续降温过程中体系的放热焓;? 为样 首先采用? 确认样品的分子量,使第 6 期 使用 差 示 扫 描 量 热 仪测 定抗 冻 蛋 白热滞 活性方 法 的研 究 4 6 7 ? ? ? ? ? ? ? ? 一 一 ? ? . . ? R P H P L C R P H P L C 用 鉴 定样 品 的 纯 度 , 以确 认 样 品是 种 测 定 结 果 显 示 样 品 为 单 峰 , 纯 度 大 于 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? . 型 A F P 。 S D S P A G E 显 品 呈 9 9 . 9 % , 为 1 8 . 3 2 m i n l B 。 因 此 , 典 的 测 定 结 果 示 样 现 保 留 时 间 图 一 3 6 k D a , D c A F P 3 6 k D a 单 条 带 , 分 子 量 为 与 文 献 报 导 的 结 果 该 样 品 为 , 分 子 量 , 达 到 色 谱 纯 , 8 3 16 [ 3 , 1 全 , 1 A 。 D S C 法 T H A 。 完 相 符 并 达 到 电 泳 纯 程 度 图 可 以用 于 使 用 测 定 检 测方法 的研 究~ 一] f B lA ? ? ? 9 7 .4 k ? ? ? 6 6 .2 k ? ? 4 3 k 2 0 0 0 一 3 1 k 1 0 0 0 ? u 磊 0 ? v ? q J 0 《 k 2 0 . 1 【 n i ? 1 4 .4 k / O I O 1 0 0 2 0 3 T i m e m i n ? - - F i 1 S D P A G E a n R P H P L r o f i l e o f D c A F P . A D S P A G E r o f i l f D c A F P T h e l f t l n e i t h . S d C s S e o . e a s e g p p t n a r d r t i n m a r k r w i t h r a b i t h h o r l a B 4 D a i n e s r u a l b m i 6 2 a r s a d o e e b o s s e 9 7 . k b o v e m u n 6 . m a b b i t p p p g , , t i n h a r n h 1 k D a a c n 4 3 . 0 m a b o v i n e c a r b o n i c a d r a s e 3 1 .0 m t s i n i ib i t o r 2 0 . a n d h e n e w h i t e , y , y p g g - z m m f r o t o m r i i R P l s o e 14 . 4 a r e s e c t i v e l m t o b o s o . T h e h t l a n e s D c A F P . H P L C r o f i l e o f y , p , p B p y y g r D c A F P w i t h a b s o b a n c e a t 2 8 0 n m 2 2 T H A . 升 降温 速 率 对 的影 响 吸 热 和 放 热 的灵敏 程 度 该 设备 的最 低 升 降温 速 率 ~ D S C 法 T H A 0 . 1 C / r a i n , T H A 。 在 使 用 测 定 的 文 献 报 道 即 为 导致 未 检 出 “ n l 8 m 1】 z 1 ~ 0 . 1 T H A 中 , 升 降温 速 度各不 相 同 , 主 要 介 于 从升 降温 速 率 对 的 影 响 上 可 以 , 发现 当 5 . 0 ? / m i n 之 , 且 温 温 0 . 1 ? / m i n 1 ? / m i n , 间 而 文 献 中均 未讨 论 升 降 速 率 升 降 速 率 从 升 到 的过 程 中 一 H A 样 品 T 的 。 T H A 地 趋 , 温 对 影 响 缓 慢 向于 稳 定 而 当升 降 速 率进 步 T H A 1 0 ? / m i n T H A 本文 详 细 研 究 了 不 同升 降温 速 率 对 的影 增大 到 的过 程 中 , 迅 速 增 大 , 原 因 。 上 2 以 , 温 主 3 。 响 从热 流 图 图 可 发 现 当升 降 速 率 要 在 于 检 测 信 号 的 相 应 扩 大 图 因 此 , 一 1 / m n / m 为 0 ? i 时 , T H A 为 0 . 5 ? 左 右 , 而 随着 升 降 1 ? i n 是 为 适 的 温 速 , 个 较 当 升 降 率 与 一 1 【 习 i 2] , T HA H a n s e n L u 温 速 率 的 降低 也 随 之 降低 , 当升 降 温 速 率 等 和 等 研 究 的测 定 条件 致 。 0 . 1 ? / m i n , T H A 出 。 2 .3 T H A 为 时 未 检 导 致 该 现 象 的 原 原 料浓度 对 的影 响 , A F P 因在 于 在 较 高升 降温 速 率 的换热 过 程 中 , 体 系 吸 由 于 的 抗 冻 活 性 具 有 非 依 数 性 的特 点 , 和 , , 上 , T H A 。 热 放 热 时 间较短 未 充分换 热 在 宏 观 表 现 为 所 以 样 品 蛋 白浓 度 对 的 影 响 可 能 不 显 著 一 上 2 A H A 热 现 象 全 部被放 大 , 在 热 流 图 图 出 现 了 但 是 , 在测 定过 程 发 现 样 品 蛋 白浓 对 T 度 有 一 『 8] 1 5 ? 时 , 还 量 和 , , Z h a n 在 体 系 存 在 大 吸 热 结 晶 的现 象 定 的影 响 同时 等 也 曾观 察 到 当样 品 蛋 白 g ~ ? 反之 , 在 5 以上 , 还 有 大 量 放 热 和 熔 化 的现 象 。 浓 在 0 1 . 2 m / n ~ 区 , T H A 浓 度 间 是 度 依 赖 型 g 0 . 5 ? T H A 。 。 T H A 因此 , 左 右 的 应 该 也 是 被放 大 的结 果 的 实验 结 果 显 示 品 随 品 白浓 样 样 蛋 度 的升 温 , 1 ? / m i n , 随着 升 降 速 率 的 降低 当 到 达 时 图 高 而 缓 慢 升 高 而 当 样 品 蛋 白 的 浓 度 大 于 等 于 一 2 D / m L H A , 可 以发 现 体 的吸热 和 放 热 都 已 经 于 1 m , 品 T 基 上 系 位 个 时 样 的 本 保 持 稳 定 在 g ~ 一 3 0 . 5 ? T H A ? H A 正 常 的范 围内 , 此 时 的 保 持 在 0 . 1 左 右 图 4 , 样 品 的 T 品 浓 与样 蛋 白质 7 13 1 1 [ , , 6 , 9】 0 . 1 ? T H A 。 大约 , 与文 献报 道 的 相 近 当升 度 呈 现 出 对 数 函 数 的 变 化 趋 势 , 该 结 论 与 鱼 ~ 一 2 0 屹 2 4 [ 】 ~ , 1 C F 温 速 进 为 0 . 1 / m i n 时 , A P I 、 w i n t e r f l o u n d e r A F P 、 降 率 步 降低 体 系 的吸 热 类 类 似 物 2 2 6 [ t 1 一 T H A P s o m o n s r i n A F P H 和 放热过 程 变得十 分 明显 , 但 是 未检 出 , 推 e u d a s a e 重 组 ~ H P L C 6 y 体 等 g 一 主 , T H A 。 测其 要 原 因在 于 缓慢 的升 降温 速 率降低 了设 备 的 变化 规律 致 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?生 物 物 理 学 报年 一善邑 ? 昌 葛】 ? ?一 《墨 豫 ? ? ?? 萋 . .叩 ?一;曲 ? ; . ?;. ?; 印 . ?;. ??董 虢 . . . . ... . . ?一 伽一. . . ?? . ?一仃 邱 雎 ?? . 第 期 使用差示扫描量热仪测定抗冻蛋白热滞活性方法的研究关于在测定中存在蛋白阈值现象有多种 不是影响其阈值的主要因素,而其自身引起的 解释,根据 “吸附一抑制”模型,按照结合 效应应该是影响产生抗冻活性阈值的主要因 素。实验结果发现当样品蛋白的浓度大于位点的方法计算了产生的浓度阈值 ,但是, 由于对冰晶表面分子覆盖度的认识不够精确, 时,其趋向于稳定,可以认为当样品的蛋白 无法准确获得结合在冰晶表面的分子之间的 浓度大于等于 时, 效应即达到最 强。因此, 的蛋白浓度阈值为 空间尺度,所以理论计算结果与实验数据偏离较 左右。 大。随后, 等 提出了 ‘ 头压海绵”的模 型,该模型将分子比拟为 “石头”,冰晶表面 . 冰晶含量对的影响 比拟为 “海绵”,当分子结合到冰晶表面上 由于显微镜观察法和微渗透压计法都无法精确 时,就好像石头压在海绵上,使冰晶表面弯曲造成 测定样品中冰晶含量,因此,关于冰晶含量对样品 局部表面的曲率变化。该模型根据泊松方程计算了 影响的研究非常少。已有的研究结果认为冰 晶含量与 是密切相关的, 越接近熔化点,冰 冰晶表面结合的分子周围冰晶表面的曲率变 化,由效应计算获得热滞活性。晶含量越低,反之亦然。因此,选择什么样的 等】改进了的模型,重新估算了冰晶表面 可以使得测定结果的稳定性和重复性最好,是本部 曲率的变化,获得了鱼类的,结果与实 分的研究 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 。为了充分理解样品中冰晶含量对 验数据比较符合。该模型认为结合到冰晶表面的 的影响,我们将在不同升降温速度下,对同 一 样品中冰晶含量与的关系进行分析。结果 分子覆盖度反比于分子溶解度,并计算 显示,在结晶过程中冰晶含量对的影响不 出结合在冰晶表面的之间的尺度以及阈值。是一种亲水性虽【划、溶解性非 常好的蛋 大,其标准偏差小于数值的 % 图 。并 白质 具体的溶解度未测定 ,因此其溶解度应该 且,在不同的升降温速度下,的标准偏差均笆 一 善 . 耋 .. 咖,%咖,% . . .?重 . 害 . . .圈 圈 . .图 隧薹 . .圈叠豳 。 .。。 ,% 咖,% .. 一. 圈囤.囹囹囹,圜。 . 诅,%. 腩 . , , , 毹 . , . , . , . . ?~, 生 物 物 理 学 报年 ? 磐 器 ?小于其值的 %。同时实验主要检测了冰晶含量在 量 %~ % 质量分数 ,而 等【】 的研究主要在冰晶含量为 . %~ % 质量分%~ % 质量分数 的范围内,样品中冰晶 含量与其的关系。因为,当冰晶含量过低 数 的范围,对于 %~ %质量分数 的冰 晶含量范围,仅仅是根据拟合的曲线来推断其趋 时,在保留温度时,样品会溶解,导致无法测定其 ;而当冰晶含量过高时,在保留温度下,样 势。综合上述研究结果,样品中冰晶含量对 品会发生进一步结晶的问题,使退火处理失效,无 是有影响的,当冰晶含量低于 %质量分数 法正确测定其。而上述样品中冰晶含量与 时,呈幂指数函数的方式增长】,当冰晶含 量为质量分数 %~ %时,会呈现一个相 的研究结果显示当冰晶含量在 %~ % 对稳定的数值。 质量分数 的范围内,样品冰晶含量对的 影响可以忽略。但是,也有研究者认为冰晶含量或 实验证明,当保留温度接近熔点时,在 冰晶大小对是有影响的,并且认为与 温度保留过程中,冰晶会发生融化现象,而无法再 冰晶含量的对数具有线性关系,该结论在 次结晶,导致测定失败,所以在正常的检测过程 曲 钾血清中 中,冰晶含量应该保持在 %~ % 质量分 也得到验证 图 。】。 等将图 数 。此时,冰晶含量对的影响可以忽略。 的拟合线进一步外推,发现当冰晶含量趋近于 . 法检测稳定性的研究 时,为一 ?,该温度与水分子自由聚合的过 研究法检测的稳定性,试验中比较 冷冰点一 ?不谋而合。同时,该现象在 了同一样品在不同时间、采用相同测定程序的结果% ? 《即中也得至 了印证 。 图 。结果发现法在不同时问测定同一样 品时,其在统计学上无显著性差异,因此 法检测的稳定性较高。一 .目? 一 量. 咖“珊 . 法检测重复性的研究 图 显 示 了 曲“的与冰晶含量的关系『,比 我们比较了不同升降温速率下,样品在 较图 与图 可以发现,本实验测定范围为冰晶含%置信区间的测定结果,并计算其 表 。 诅《墨 第 期 使用差示扫描量热仪测定抗冻蛋白热滞活性方法的研究结果表明的均在 . %以下,最小值达 具有较高的稳定性、重复性和精密度, 到 . %,最大值仅为 %,证明使用 均在 . %以下。因此,如果按照相同的实验方 法,法可以有效地用于样品测定。 法测定样品在不同的升降温速率下具有比较 理想的重现性。 . 法检测精密度的研究 参考文献:印,, . 通过比较同一个样品经多次测定的结果 图锄. 搪,研究了法检测的精密度。可以发现 ,, : 使用相同方法测定同一个样品的,结果精密.丘 印 印 度高,为 . ? .? ,标准 ? 丘 .埘 哪 如 , , : 偏差为 . %,因此使用法检测的精 ~ 【 , . 腩 踟 仃 密度较高。 ,加 . ,,: . 】 帆,皿 , .? . , 如 , . ,,,: . 丁 ,甲 . 珊 . 一 、 『皿丘.. 叩 如珊 , , .:~ , ,, , , , .舶. 把呦 一, , ,: ~ .埘 , , . 艉 丘 丘 ?. ? 不埘 , , :~ 试验结果发现不同的检测方法或不同的检测程 , ,, ?, ., , 丘 丘序 都会导致最终检测结果的差异,因此,要使试验 .件印 胁耐 , 结果具有可比性,就必须保证整个实验过程的检测 , : ~方法和检测程 序完全相同。本文使用的法, 】, , , , , 在相同的试验程序下,结果的重复性和稳定性都比 ,, , . 盯 较高,与相关文献报导的数据均在同一数量级,值?? 印 . 得信赖。据 ,, : ~】, ? , .另一方面,衡量一个检测方法的可靠性除了 上 锄台 】,?一 述考察的内容外,还需要考察测定方法的准确度, ?善 . ,卸 , : 但是,同一个样品使用不同的检测方法或检测条件 ~ 会获得不同的,这其中还没有一种权威的方 ,. 厅 咖法可以精确反映样品的真实,而检测方法的 丘, ,哟. 上 曰泖 血 准确度反映的是单个测量值与真实值的接近程类 , : ~度旧。由于无法确定其真实值,所以,本文未对】 , ,,, , . 娲 方法检测的准确度进行评价。 枷 丘 ., 玎 咖 ? , ,:~ 结 论 【, . ?印 丘. ,, 本文详细地研究了使用法测定的检 ~ : ~测方法。研究结果表明采用法测定样品的 生 物 物 理 学 报年 【. , ,. ? 】 ,? 岍 ,,:、仔 】 印 . . ~ ? 】汪正范.色谱的定性与定量.北京:化学工业出版社, .如“仃 曰 ? 打 ,, 、 , ,,, :~, , , ?, . ,,, , 丘 .棚 .? “ , ,. 把 , , : ~~, ,, ,, ,, . 】 ,, , 啪 . . 【丘 . 不,加, , : ~ 曰 ,, :~ 】 . 腩舢 咖 仃 . ., 把 凡 厂 , . , 把 ,, : ~ , : ~, . ? ,,,. 舶 . 把瑙, ,: ?丘 , .丘咀玎 .疳 . , 。 , , 昌 , ,:~ , : ~ ,, 乜 】? ? 【 , , , . 蕾 印 ?? 硼 , 、, . 如 厂曰 , , :~. 』 讲 啪 , . 一 恤,:疗??? . 【 ,.血聊 砌一胁 , ? 日,, : ~咖 ?? 丹 彘 】’ . ? ? ?咖 . 口三 抛 ,, : ~丘印?? ,, .疗彘 .?,一 .如“ 曰 , , :~,: ~ 】 ,, . 一 , . 胁 ? 丘., , : 印 . .丘 】 . 丘 印 印? . 印丘? ,, : ~ .肘 百, ?,, ~ : ~