【doc】人工组织神经移植物辅加神经再生素修复大鼠周围神经缺损的实验研究

【doc】人工组织神经移植物辅加神经再生素修复大鼠周围神经缺损的实验研究 人工组织神经移植物辅加神经再生素修复 大鼠周围神经缺损的实验研究 第33卷第2期 2002年4月 解剖 ACTAANATOMICAS1NICA VoI.33.Na.2 Avr002 人工组织神经移植物辅加神经再生素修复大鼠 周围神经缺损的实验研究 王晓冬'顾晓松张沛云'曹涌马红萍 -1南通医学院分子神经生物学江苏省重点宴验室:2南通医学院附院骨科;3生理学教研窒,南通Z2.6001) [摘要]目的用^工组织神经移植物辅加神经再对?素(NRF)桥接修复大鼠周围神经缺损.方法用壳聚 糖套管和聚乙醇酸纤维制戚人工组织神经移植物,辅加促神经生长的中药有救组分NBF,桥接大鼠坐骨神经缺损 l0mm术后作足迹试验;24周时对冉生神经进行电牛理学测试,形态学观察和计量学统计.结果术后24周 内,动物未见旋症及排斥反应丈验组的再生神经在足迹试验,电生理学,形态学及计量学上优于硅腔管桥接组. 结论人工组织神经移植物辅加NRF与局围神经组织具有良好的生物相容性;它对缺损的神经修复有较好的桥粱 和促进作J{j [关键词]人工组织神经移植物;壳聚糖套管;聚乙醇酸纤维;神经再生素;周围神经再生;大鼠 [中图分类号]R651.3[文献标识码]A[文章编号]05291356(2002)02-131 THEEXPERIMENTALSTUDY0lNTHEARTlFICIALNERVE TlSSUEGRAFT?TrHNERVEREGENERAT10NFACT0RIN REPAlRGPERIPHERALNERVEGAPINRAT WANGXiao-along~, GUXiao-songJ,ZHANGPei—yun',CAOYong2, MAHong-ping~ (ThePr~inclalKeyLaboratoryofMolecal~?,'eazobiotogy,2.脚?咖删0nS~g,-ry一 3rofPh~'siology,Nan~oag~dedbzalCollege,?,'among226001,China) 【Abstract]ObjectiveThisstudyinvesatedtheartificialetissuegraftwithilel~-12regenerationfactor(NRF)re— pairedperipheralnel~,egapinratMethodsIZeartificialnetissuetconsistedofehilo6antubeandpelyglycolieacidfiber addingNRI.'.acompenemfromChinesemed~clngpromotingnelvf-growth-andrepairedinthe10ramgapoftheperipheralnerve intheFunctionrecoveryoftheexperimentalratswasevaluatedbywalkingtr? kanalysls,eleetr~physinlzgi~testing,m.叩l? losieobse~'ationandstereologicalmeasIJreResultsThererioevidenceofboth~cu|eandchronicinflammationeet~onin theexperimentalratwithin24weeksaftertheoperationThetestingofelectr~physiology,morPh0l.盯andstereologyinegeI-er且. riveilelF,~ebridgedbythealtificialnetissuea竹 addingNBFwasbetterthancontrolgroupsexceptautogeafigroup.Ctm~uaoa Theseresultsindicatedthatthemwag(bioeompatibilitybetweentheartificialnemtissuegraftaddingNRFandthehostratin ?Yolaltheyhadthefunctlon~bridgingapromoting目ene伯u啪 1injuredperil~eralneqw~ 【Keywords]Artificialetissuegraft~ChitasantubelPolyglyealieacidi~ber;Nerveregenerationfactor;Peripheral eregeneration:Rat 周围神经长距离缺损后修复既需桥接物的桥梁 作用,又要有促神经再生的物质存在,这样才能在肌 肉等靶器官退变前轴索再生到达相应部位,完成修 收稿日期2001.07—20.修回日期2001.1l一30 c基盒项目]翻家自然科学基金贷助项目(30070255);江苏省 自然科学基金资助项目(BK99201) [作者简介】王晓冬(18一).男(汉族).江苏省南通市_凡.硬 士,副教授. 通讯作者(Towhomc肿re?p0口de~ce日benldbeaddre曲) 复并恢复功能而已研究的桥接物距临床应用尚有 较大距离,为此寻求非生物材料桥接物及促神经再 生物质日渐受到重视….我们先前的研究 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明,两 种生物可降解材料壳聚糖和聚乙醇酸与神经组织具 有良好生物相容性,且成管性,通透性和支架作用 均较好;从神经生长液"中提取的中药有效成分.神 经再生素(NRF)有较好的促神经生长作用.为 此,本实验采用壳聚糖套管(本实验室研制)和聚乙 醇酸纤维(南通华利康医疗用品有限公司)作为人工 组织神经移植物(中国专利申请公开号: l32解剖33卷,2期 CN1319379A),辅加NRF(本实验室研制,中国专利 申请公开号:CN1319423A),桥接大鼠坐骨神经缺 损,观察神经再生的情况. 材料和方法 1.动物分组及手术方法 雄性健康SD大鼠30只(南通医学院实验动物 中心提供),体重200,250g,随机分成实验组和对 照组;对照组又分实验对照组I,实验对照组?和正 常对照组.其中实验组动物l2只;每个对照组动物 6只.采用复合麻醉剂腹腔注射麻醉(03nd/100 g).于大鼠股后部正中切El,在手术显微镜下解剖 坐骨神经,自梨状肌下缘切除坐骨神经7mm,任其 两端回缩后,造成神经缺损达l0mm实验组用长 10?un的人工组织神经移植物辅加NRF(含NRF60 g),桥接于神经两断端问的缺损处,用9/0无损伤 缝合线缝合3针以自体神经或硅胶管桥接分别作 为实验对照组I或?,手术过程及神经缺损距离均 同实验组;另外设1组正常对照组术后各对照组 大鼠按常规饲养.实验组大鼠除术后2个月内,灌 服神经生长液(每只每天1m1),其他均同常规饲养. 2.检测项目和方法 2.1大体观察:术后每周观察各组动物的整体和 术侧足的情况;每月进行一次足迹试验,采用Bain 等的公式计算坐骨神经功能指数(SFI:以SFI:0 为正常,SFI=一100为神经完全损伤). 22电生理学测定:大鼠术后24周时被麻醉,于 原手术切El解剖桥接后的坐骨神经近,远侧端,用 I)95SuperLab电生理系统(江苏生物医学工程学会 医电研究所)记录神经对刺激的反应. 2.3}?【P示踪试验:各组随机抽取大鼠2只,于 桥接远端下4mm处的坐骨神经干注入30%HRP (RI30,中国科学院上海生物化学所生产)溶液l0 l,缝合好伤口,继续饲养72h. 24形态学观察及计量学分析:大鼠用多聚甲醛 灌注,取脊髓腰膨大段和L3,背根神经节,冰冻 切片.尼氏染色;HRP示踪试验鼠的上述标本用四 甲基联苯胺染色法,观察神经元胞体数及HRP标记 的情况.取桥接处的再生神经,石蜡包埋连续切片, 特殊三色染色;观察神经再生情况,计量学分析再 生神经近,远段的横断面积,有效面积率和轴索数. 取再生神经远段直接戊二醛和锇酸双重固定,环氧 树脂包埋和超薄切片;观察髓鞘形成情况,计算轴索 直径及髓鞘厚度. 25再生神经修复缺损动态观察:实验组中6只 大鼠分别于术后l2周,16周按常规灌注,取再生神 经冰冻纵向切片,S-103免疫组织化学染色,苏木素 复染,观察再生神经纤维贯穿桥接处情况. 结果 1.大体观察 术后1周内,大鼠除行动困难外,未见其他异 常2周时,对照组术侧均有不同程度的足底踝关 节后部皮肤红肿,溃疡;而实验组1只有溃疡,其余 仅为轻度红肿.4周各组术侧腿部肌肉均萎缩.2 月时,实验组和对照组I术侧足肿趋于消退,但肌肉 萎缩未恢复.至24周时,对照组?术侧足溃疡率为 67%.而实验组仍为1只并已减轻;实验组和对照组 I的萎缩肌肉有所恢复;出现轻微痛觉反应.各组 均未出现明显的全身排斥或炎症反应症状.不同时 间各组大鼠SFI结果见图1. 时间(月)Time(month) 图I不同时间的各组大鼠SFI结果 Ther~ultsofSF1aboutditte~ntgroupsat~ular1nkrs 2.再生神经电生理学测定 实验组神经干传导速度(s)(图2)为12.99? 6 4.69,对照组I为l0.82?7.76,对照组?为3.15? 5.33;实验组和对照组I比,无显着性差异,但它们 OOOOO0O00O__{吨 ?口==0u=_= 名u?簌蹉百}啦剖 王晓冬等.人工组织神经移植物辅加神经再生素修复大鼠周围神经缺损的实验研 究 和对照组?比均有显着性差异(P<0.05). V=-4883t,.v V:-3l738 V=200rn/s 【=l0oIlls StimulationWide:004msAmp—102V 围2实验组神经干动作电位 ,.2The~tionpotentialofthee~pefi~nta]g叫p 3.脊髓前角运动神经元形态学观察 实验组神经元数l8.7?06,对照组I18? 17,对照组?15.3?1.5,正常对照组l8.0?1.5;实 验组,对照组I与正常对照组比无显着性差异,而对 照组?和正常组间有显着性差异(P<0.01). 4.HRIP示踪试验 仅在实验组及对照组l的脊髓灰质前角或背根 神经节中能见到HRP标记的阳性神经元. 5.再生神经形态学观察及计量学分析 5.1肉眼观察:24周时,各组桥接物与神经连接 良好,表面有轻度组织粘连和丰富血管生长;未见病 理肿大及感染病灶;除对照组?因硅胶管腔小再生 神经较细外,其他组再生神经均接近或粗于正常神 经.实验组的再生神经肉眼观见图3. 52再生神经光镜观察及计数:实验组和对照组 I的再生神经干有完整外膜包裹,神经束的数量及 分布与近端神经相似,束膜较薄;到12周时,排列较 整齐,密集的再生轴索已贯通桥接物全长(图4);半 数以上的再生轴索出现较薄的红色髓鞘(图5);再 生神经的远段可见少量被包裹薄层髓鞘的轴索(图 6)对照组?的再生神经中,神经外膜较厚,内部为 较多增生结缔组织或施万细胞;神经干中再生轴索 分布不均.各组的桥接物及再生神经处白细胞计数 为0,10个/HF,无明显炎症反应灶.各组再生神经 近,远各段神经干截面积,有效面积率,轴索数见附 表. 5.3电镜观察:实验组和对照组I中再生轴索较 粗,施万细胞包裹形成较对照组?厚,排列规则且电 子密度高的髓鞘(图7).各组再生神经远段有髓神 经轴索直径及髓鞘厚度见附表. 附表各组再生神经计数比较(?s) TableComparisonOnregenerative]3elr~'eoHdifferent"p8(j?) 注:与正常对照组比.P<005:**P<001 o:Con~poxedwithnodaleoat,~lgroup.P<005:*P(001TMS…th[ckne~ofmyelinsh~th 讨论 神经再生缓慢,待再生神经至效应器时,肌肉已 发生不可逆变性;在长距离缺损时尤为明显,这是周 围神经再生困难的原因之一.如何加速神经再 生,使肌肉尽早重新获得神经支配,是需要解决的周 围神经长距离缺损后再生的问题之一.尽管NGF 等因子有不同程度促神经再生的作用,但外源性神 经营养因子的促神经再生作用仍有争议;此类因 子药源有限,价格昂贵,有副作用等问题尚未解决. 中草药已被证明有明显的促神经再生作用,它们 来源广泛,经济,具有自主知识产权,是不可多得的 植物源性促神经再生物质本课题组按中医学理论 和现代生物学技术,配伍成神经生长液,具有明显的 促神经生长作用;用色谱法从神经生长液中提取 到一组有效组分.甾酮类,体外对背根神经节的生存 和突起生长具有明显的分子生物学作用.研究 的神经长距离缺损时使用的非生物桥接材料种类多 达十几种,但效果仍不理想.因此,有必要继续就 此问题深入研究".作为桥接材料须有良好的生 134解剖33卷,2期 物相容性,极佳的渗透性,较好的管状和支槊作用及 在体内能降解等特点.我们选用了2种医用可降解 材料——壳聚糖和聚乙醇酸作为桥接的套管和支 架,组成人工组织神经移植物,并辅加NRF.(1)用 它桥接于缺损坐骨神经之间,6个月后SFI测试表明 缺损的坐骨神经已逐步恢复了对后肢的肌肉支配, 其恢复程度较对照组I略好,明显高于对照组1I;实 验组的腓肠肌虽有萎缩,但明显好于对照组l,?. (2)电生理学测定及HRP追踪试验说明损伤的神经 近端轴索已再生穿越过人工组织神经移植物.(3) 实验组脊髓前角运动神经元的保护较好,数量变化 不大,与给予NRF的推论吻合.(4)从桥接处的再 生神经组织形态及计量数据来看:a.壳聚糖和聚乙 醇酸已基本降解.b.各组再生神经中有丰富血管; c.除对照组?因硅胶管内空间小外,其他组的神经 干截面积达到或超过正常组;d.各组均无明显炎症 或排斥反应实验组的再生神经有大量结构较完 整的有髓神经纤维.实验结果表明,人工组织神经 移植物与周围神经组织具有良好的生物相容性,辅 加NRF对缺损的坐骨神经修复有较好的桥梁和促 进生长作用 参考文献 [I]HeathCA,RmkowskiGEThedevelopmentof0?ia[dts forped01teml-nm'eregene~tion[J]Tiht~h,1998,16(1):163—168 [2]王晓冬,顾晓橙,张沛云,等体卦培养的施万细胞在平面和聚乙 醇酸纤维网架上的迁移[J].解剖,2o0o,31(21157-159 [3孟凡迅,张沛云,镣济良,等"神经生长棱"台剂促进神经损伤修 复实验观察[J]时珍国医国药,1999,10(8):801—802 [4]丁裴,刘梅,顾晓橙神经再生索对背根神经节细胞GAPer3和 NF-L基因表达的影响[J]中国药科大学,2001,32(3】:231— 234 [5]刘梅.顾硗松,刘炎,等中药"神经再生索"促神经生长过程中基 因差异性表达的初步研究[J]神经解剖学杂志.200l,17(2): l05—116 [6]BainJH,MaekinnonSE.H删terRT.mnle诅【1]】【邛0f complement~iatie.pero~ed.andposteriort[hial…Ieinthe rn【JPlastR哪sTg.1989.83(I):129—136 .】MeyerR,c1…C42,OhsJ.Modifiedtr~~hromea1m髓hq 0fthenemmdetermineproximal…viabilitylJj‰ms.1995, 16(I):I29—132. 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