维生素c含量测定
抗坏血酸(维生素C)的测定
方法
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(1)
在测定维生素C的国标方法中，荧光法为测定食物中维生素C含量的第一标准方法，2、4,二硝基苯肼法作为第二法。 一、荧光法 1(原理
样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化成脱氢型抗坏血酸后，与邻苯二胺(OPDA)反应生成具有荧光的喹喔啉(quinoxaline),其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。 脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应，以此排除样品中荧光杂质所产生的干扰。本方法的最小检出限为0.022 g/ml。 2(适用范围
GB12392-90 本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定 3(仪器 3(1(
实验室
17025实验室iso17025实验室认可实验室检查项目微生物实验室标识重点实验室计划
常用设备。 3(2(荧光分光光度计或具有350nm及430nm波长的荧光计。 3(3(打碎机。 4(试剂
本实验用水均为蒸馏水，试剂不加说明均为分析纯试剂。 (1)偏磷酸,乙酸液:称取15g偏磷酸，加入40ml冰乙酸及250ml水，搅拌，放置过夜使之逐渐溶解，加水至500ml。4?冰箱可保存7,10天。 (2)0.15 mol/L硫酸:取10ml硫酸，小心加入水中，再加水稀释至1200ml。 (3)偏磷酸,乙酸,硫酸液:以0.15mol/L硫酸液为稀释液，其余同4.1.配制。 (4)50, 乙酸钠溶液:称取500g乙酸钠(CH3COONa?3H2O)，加水至1000ml。 (5)硼酸-乙酸钠溶液:称取3g硼酸，溶于100ml乙酸钠溶液(4.4)中。临用前配制。 (6) 邻苯二胺溶液:称取20mg邻苯二胺，于临用前用水稀释至100ml。 (7) 0.04%百里酚蓝指示剂溶液:称取0.1g百里酚蓝，加0.02mol/L氢氧化钠溶液，在玻璃研钵中研磨至溶解，氢氧化钠的用量约为10.75ml，磨溶后用水稀释至250ml。 变色范围:pH=1.2 红色 pH=2.8 黄色 pH,4.0 兰色 (8) 活性炭的活化:加200g炭粉于1L 1+9盐酸中，加热回流1~2h，过滤，用水洗至滤液中无铁离子为止，置于110~120?烘箱中干燥，备用。 (9)标准
抗坏血酸标准溶液(1mg/ml):准确称取50mg抗坏血酸，用溶液(4.1)溶于50ml容量瓶中，并稀释至刻度。
抗坏血酸标准使用液(100μg/ml): 取10ml抗坏血酸标准液，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml。定容前试pH值，如其pH,2.2时，则应用溶液(4.3)稀释。
标准曲线的制备:取下述"标准"溶液(抗坏血酸含量10μg/ml)0.5、1.0、1.5和2.0ml标准系列，取双份分别置于10ml带盖试管中，再用水补充至2.0ml。
5.操作步骤 5.1 样品制备
全部实验过程应避光。
称取100g鲜样，加100g偏磷酸-乙酸溶液，倒入打碎机内打成匀浆，用百里酚蓝指示剂调试匀浆酸碱度。如呈红色，即可用偏磷酸-乙酸溶液稀释，若呈黄色或兰色，则用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释，使其pH为1.2。匀浆的取量需根据样品中抗坏血酸的含量而定。当样品液含量在40~100μg/ml之间，一般取20g匀浆，用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100ml，过滤，滤液备用。 5.2 氧化处理:分别取样品滤液及标准使用液各100ml于带盖三角瓶中，加2g活性炭，用力振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液，分别收集其余全部滤液，即样品氧化液和标准氧化液，待测定。 5.3 各取5ml标准氧化液于2个50ml容量瓶中，分别标明"标准"及"标准空白"。 5.4 各取5ml样品氧化液于2个50ml容量瓶中，分别标明"样品"及"样品空白"。 5.5 于"标准空白"及"样品空白"溶液中各加5ml硼酸-乙酸钠溶液，混合摇动15min，用水稀释至50ml，在4?冰箱中放置2h，取出备用。 5.6 于"样品"及"标准"溶液中各加入5ml50%乙酸钠溶液，用水稀释至50ml，备用。 5.7 荧光反应
取"标准空白"溶液，"样品空白"溶液及(5.6)中"样品"溶液各2ml，分别置于10ml带盖试管中。在暗室中迅速向各管中加入5ml邻苯二胺，振摇混合，在室温下反应35min，用激发光波长338nm、发射光波长420nm测定荧光强度。标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标，对应的抗坏血酸含量为横坐标，绘制标准曲线或进行相关计算，其直线回归方程供计算时使用。 6. 计算
X=(c×V/m)×F×(100/1000) 式中:X-----样品中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量，mg/100g; c------由标准曲线查得或由回归方程算得样品溶液浓度，μg/ml; m-----试样质量，g; F------样品溶液的稀释倍数; V------荧光反应所用试样体积，ml。 例: 测定每一制备溶液的荧光强度。用标准溶液每ml含2.5μg、5.0μg、7.5μg及10.0μg，各标准浓度管读数减去相应的标准空白读数的各平均值做标准曲线。 由样品液读数减去样品液空白读数之值，从标准曲线上查得相应的抗坏血酸(μg/ml)，按取样量及稀释率计算样品中抗坏血酸的含量。 如:取制备好的辣椒样品2.138g，稀释到100ml，氧化后分别取10ml滤液稀释到50ml 样品读数为23.34，样品空白读数为3.188，样品读数减去样品空白读数为20.152，查荧光标准曲线相当标准抗坏血酸的2.23μg。 2.23×100× 50× 100 ---------------- --------= 52(mg/100g) 2.138× 10 ×1000 7. 注意事项 7.1 大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶，因此，抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用偏磷酸-醋酸提取液将样品制成匀浆以保存维生素C。 7.2 某些果胶含量高的样品不易过滤，可采用抽滤的方法，也可先离心，再取上清液过滤。 7.3活性炭可将抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，但它也有吸附抗坏血酸的作用，故活性炭用量应适当与准确，所以，应用天平称量。我们的实验结果证明，用2g活性炭能使测定样品中还原型抗坏血酸完全氧化为脱氢型，其吸附影响不明显。
注意事项 7.1 大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶，因此，抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用2%草酸溶液制成匀浆以保存维生素C。
7.2 若溶液中含有糖，硫酸加得太快，溶解热会使溶液变黑。
7.3 试管自冰水中取出后，颜色会继续变深，所以，加入硫酸后30分钟应准时比色。
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