PCR检测时对实验室DNA污染的清除

紫外线照射清除HBV－DNA作用研究 刘军权 【摘要】 目的 观察紫外线对PCR外源性HBV－DNA污染的作用。方法 用紫外线对不同浓度的HBV－DNA阳性血清标本和HBV阳性参控品进行固相和液相状态紫外线照射。结果 三种干燥后的标本随着紫外线照射时间的延长，HBV－DNA清除率明显增加。HBV阳性参控品与相同HBV－DNA拷贝数的血清标本置紫外线照射后，每相同的照射时间HBV－DNA下降率前者均显著高于后者。血清标本和HBV阳性参控品经1∶1万倍稀释、紫外线照射2小时后，前者HBV－DNA下降33.3倍，后者下降6250倍。结论 紫外线消毒法对阳性血清标本造成的实验室污染不能清除；阳性模板经紫外线消照射后HBV－DNA含量明显降低；紫外线照射对清除物体 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面较低含量阳性HBV－DNA模板或HBV－DNA引起的气溶胶可能有效。 【要害词】 紫外线 消毒 聚合酶链反应 乙型肝炎病毒 Study on Cleared effect of Ultraviolet radiation in induced contamination of HBV－DNA LIU Junquan , ZHOU Zhonghai, YAN Weimin. Department of Central Laboratory, 97th hospital of PLA, Xuzhou 221004, P. R China 【Abstract】Objective To observe the effects of Ultraviolet radiation on contamination of external HBV－DNA. Methods HBV－DNA positive serum samples and HBV positive control serum samples with different concentration were disinfected by Ultraviolet radiation in solid state and liquid state. Result The cleared rate of HBV－DNA in three kinds of dry samples increased markedly along with prolonged disinfectant time of Ultraviolet radiation. After HBV positive control samples and serum samples with same copies have been irradiated by Ultraviolet radiation, it showed that the cleared rate of HBV－DNA of the former was remarkably higher than that of the latter. HBV－DNA of serum samples reduced 33.3-fold and that of HBV positive control samples reduced 6250-fold after they were diluted to 1:10000 and disinfected 2 hours by Ultraviolet radiation. Conclusion The positive serum samples induced contamination in laboratory could not been cleared away by Ultraviolet radiation; Been disinfected, the concentration of HBV－DNA of positive serum samples reduced obviously; Ultraviolet radiation may have effects in clearing away the low concentration of HBV－DNA of positive serum samples or aerosol induced by DNA on surface of objects. 【Key words】Ultraviolet radiation; disinfect; Polymerase chain reaction; Hepatitis B virus 紫外线照射是聚合酶链反应（PCR）测定的实验室常用消毒方法，对控制外源性DNA污染引起的假阳性较其他消毒方法更为有效。但是紫外线照射对不同的污染环境和污染物的消毒效果报导不一[1-3]。为了观察紫外线对HBV－DNA消除情况，我们用紫外线对不同浓度的HBV－DNA阳性血清标本和HBV阳性参控品进行固相和液相状态紫外线照射比较，现将结果报告如下。 1 材料和方法 1.1 材料 Roche lightcycler 荧光PCR 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 仪（德国罗氏公司产品）；乙肝病毒核酸扩增PCR荧光检测试剂盒（深圳匹基生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 股份有限公司产品）；石英紫外线杀菌灯(30W，1米处辐射强度为105μW／cm2由江苏省启东市荧光厂生产)。 1.2 方法 1.2.1 污染标本的制作 将高浓度（5×107/ml copies）与低浓度（5×103/ml copies）HBV－DNA阳性血清标本和HBV阳性参控品（5×107/ml copies）按1∶1～1∶1万倍比例稀释加入96孔细胞培养板中，每孔0.1ml。将检测标本分为2组；A组：置4℃冰箱自然干燥后用紫外线消毒；B组：直接置紫外线灯下照射。 1.2.2 紫外线照射时间的选择 将A和B组标本分别置于紫外线灯下照射30、60、120分钟后A组标本用亚沸蒸馏水恢复原体积，收集于0.5ml尖低离心管中备用；B组吸取标本，置于0.5ml尖低离心管中备用。 1.2.3 乙肝病毒核酸扩增PCR荧光检测 按试剂盒说明 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 要求进行 血清标本先进行DNA提取，然后加入核酸扩增试剂（含PCR反应液、Taq酶和UNG酶）中，HBV阳性参控品直接加入核酸扩增试剂内，用Roche lightcycler 荧光PCR检测仪实时监控检测HBV－DNA copies／ml。 2 结果 2.1 A组经紫外线照射后HBV－DNA含量变化见表1 三种干燥后的标本随着紫外线照射时间的延长，HBV－DNA的清除率明显增加。HBV阳性参控品与相同HBV－DNA拷贝数的血清标本置紫外线照射后，每相同的照射时间HBV－DNA下降率前者均显著高于后者。血清标本经紫外线照射2小时后HBV－DNA 1∶1～100倍稀释的标本下降1～5.6倍，1∶100～1万倍稀释下降5.6～33.3倍；而HBV阳性参控品经1～1∶100倍稀释下降17.9～108.7倍，100～1万倍稀释下降108.7～6250倍。 表1 A组经紫外线消毒后HBV－DNA含量变化 浓度 血清标本（5×103/ml copies） 血清标本（5×107/ml copies） HBV阳性参控品（5×107/ml copies） （稀释倍数） 照射时间（分钟） 照射时间（分钟） 照射时间（分钟） 30 60 120 30 60 120 30 60 120 1：1 4.6×103 4.9×103 5.3×103 5.4×107 4.9×107 4.7×107 2.5×107 1.1×107 2.8×106 1：10 4.5×102 4.0×102 1.5×102 3.1×106 2.0×106 3.0×106 1.2×106 9.5×105 7.3×104 1：100 4.0×10 3.5×10 1×10 2.1×105 1.3×105 7.7×104 1.3×105 3.4×104 4.6×102 1：1000 4.5 4.0 3 4.0×104 3.5×104 9.4×103 1.5×104 1.9×103 8.0 1：10000 0 0 0 3.5×103 8.5×102 1.1×102 1.7×103 4.1×102 0 1：100000 0 0 0 2.0×102 1×102 1.5×10 9.0×10 1.0×10 0 2.2 B组经紫外线照射后HBV－DNA 三种标本在液相状态下，紫外线照射对HBV－DNA降解作用较低，但HBV阳性参控品下降率仍显著高于血清标本，含量变化见表2。 表2 B组经紫外线消毒后HBV－DNA含量变化 浓度 血清标本（5×103/ml copies） 血清标本（5×107/ml copies） HBV阳性参控品（5×107/ml copies） （稀释倍数） 照射时间（分钟） 照射时间（分钟） 照射时间（分钟） 30 60 120 30 60 120 30 60 120 1：1 6.1×103 5.1×103 5.5×103 4.3×107 4.7×107 4.3×107 3.3×107 5.0×107 2.1×106 1：10 4.3×102 3.0×102 3.6×102 4.5×106 5.6×106 5.1×106 4.5×106 1.1×106 1.9×105 1：100 2.8×10 2.2×10 1.5×10 4.9×105 5.1×105 3.7×105 2.1×105 7.7×104 1.1×104 1：1000 6.0 4.0 0 5.6×104 4.4×104 2.5×104 2.2×104 9.7×103 1.8×103 1：10000 0 0 0 3.8×103 2.1×103 1.3×103 9.5×102 1.6×102 7.9×10 1：100000 0 0 0 3.5×10 2.4×10 1.1×10 3.0×10 1.5×10 7.0 3 讨论 PCR测定出现假阳性结果通常是由外源性DNA污染所致，病人标本中的病毒颗粒、阳性对照均是造成实验室严重污染的主要因素。紫外线可以降解DNA或使DNA发生突变、失活和破坏DNA结构、阻断DNA的复制。所以经紫外线照射后DNA难以扩增。紫外线照射方便易行，消毒面广，对室内仪器设备影响较小。因此被广泛应用于各实验室消毒。但是紫外线消毒效果受灯管的辐射强度、照射时间、微生物的种类、有机物的含量、温度和湿度的影响[1,4]。 为了解紫外线消毒状况和有效范围，选择正确的消毒方法和时间，以减少实验室PCR检测外源性DNA污染，我们将HBV－DNA阳性标本进行了相关试验。结果显示，HBV－DNA阳性血清标本和HBV阳性参控品经低温干燥后，用紫外线照射2小时，HBV－DNA高拷贝数的血清标本下降比例高于低拷贝数的血清标本，同样拷贝数的HBV阳性参控品显著高于血清标本；各种标本随着稀释倍数的增加，经紫外线照射后HBV－DNA的下降比例明显增加，说明标本中有机物如蛋白质等含量的高低直接影响到紫外线的照射效果。HBV－DNA阳性血清标本和HBV阳性参控品在液相状态，经紫外线照射2小时后HBV－DNA下降比例不明显。这一结果表明，紫外线对HBV－DNA阳性的液态标本照射无实际价值。 以上实验结果表明，紫外线对阳性血清标本造成的实验室污染不能清除；阳性模板经紫外线消照射后可以降低其含量，对清除物体表面较低含量阳性DNA模板或DNA引起的气溶胶可能有效。因此，在进行PCR实验室操作时，必须严格按PCR实验操作规程试验，在操作中应尽量减少各种标本外溢和溅出，以免引起实验室污染，每次实验完毕需认真清洗实验操作台和实验室环境。在进行下一次实验前，实验环境应用紫外线照射2小时以上。一旦造成实验室DNA污染，将直接／或可能是不可逆转地影响今后的实验室试验结果。 参考文献 1 刘怀田，李荣芬。紫外线表面消毒应用研究的进展。中国消毒学杂志，1994；11（1）：37-38 2 王占科，祝仲珍。紫外线照射消除PCR技术外源性DNA污染。人民军医，1997；5：286－297 3 宋维汉，苏学今，张新秀，等。三种物理方法对乙型肝炎病毒消毒效果的观察。白求恩医科大学学报，1998；1：105－107 4 居喜娟，薛广波，卞雪莲，等。紫外线空气消毒器除菌效果的研究。中国消毒学杂志,1994；11（4）：233-236 防止PCR外源性HBV-DNA污染的实验研究 摘要 目的 选择一种消除实验室DNA污染的最佳消毒方法。方法 用压力蒸汽消毒、紫外线消毒、84消毒液、过氧乙酸消毒液、次氯酸钠溶液和2％戊二醛消毒液，按常规方法对高浓度（5×107copies/ml ）与低浓度（5×103copies/ml ）HBV－DNA阳性血清标本和HBV阳性参控品进行消毒处理，然后用PCR检测技术检测HBV－DNA浓度的变化。结果 HBV－DNA阳性血清标本经84消毒液消毒后不能检出HBV－DNA；过氧乙酸、次氯酸钠和戊二醛消毒液及紫外线照射消毒法消毒后HBV－DNA含量减少；压力蒸汽消毒法对血清标本中的HBV－DNA无作用。结论 84消毒液能完全清除阳性血清标本中的HBV-DNA；高压蒸汽、过氧乙酸、次氯酸钠和2％戊二醛及紫外线照射消毒法不能完全清除阳性血清标本中的HBV－DNA。 要害词：乙型肝炎病毒；消毒；方法；聚合酶链反应 中图分类号： 文献标识码： 文章编号： The Study on the Prevention of External HBV-DNA Contamination LIU Jun-quan, CHENG Fu-xing, ZHOU Zhong-hai, ZHANG Yu-xi ( Department of Central Laboratory, 97 th hospital of PLA, Xuzhou 221004, Jiangsu Province, China) Abstract: OBJECTIVE To select an optima antisepis to avoid DNA contamination during polymerase chain reaction experiments. METHODS Hepatitis virus B(HBV)DNA from serum samples and control samples were antisepsised by six methods, including pressche steam; ultraviolet radiation,84-disinfector, peroxide acetic acid, hypochlirite mareium and 2% glutara ldehyde disinfector. RESULTS HBV-DNA couldn’t be detected after being dealed with 84-disinfector, while pressure steam antisipsis had no effects on decreasing DNA contamination. Other four methods had lower efficiency. CONCLUSIONS 84-disinfector is able to clear all the HBV-DNA of positive serum samples, while other five methods are not able to. Key words: Hepatitis B virus; disinfect; methods; Polymerase chain reaction 检测乙肝病毒（HBV-DNA）在我国常被用来间接评价消毒剂杀病毒的效果。用聚合酶链反应（PCR）检测HBV-DNA具有操作简便、灵敏度高和特异性强等优点。但也常因微量污染而产生假阳性结果。近年来，人们采用了许多方法消毒处理不同的污染环境和污染物[1-4]，但消毒效果报导不一。为选择一种消除实验室DNA污染的最佳消毒方法，我们选用六种传统的消毒法进行对比研究。现将结果报告如下。 1 材料和方法 1.1 材料 Roche lightcycler 荧光PCR检测仪（德国罗氏公司产品）；乙肝病毒核酸扩增PCR荧光检测试剂盒（深圳匹基生物工程股份有限公司产品）；石英紫外线杀菌灯(30W，1米处辐射强度为105μW／cm2由江苏省启东市荧光厂生产)；XMG－1?2脉动真空蒸汽灭菌器（连云港千婴医疗设备有限公司）；84消毒液（南京江南消毒剂厂产品）；过氧乙酸（江苏双氧水厂产品）；戊二醛消毒剂（Merck产品）；次氯酸钠（上海试剂一厂综合经营公司产品）；甘氨酸和硫代硫酸钠（中国医药上海化学试剂公司）。 1.2 方法 1.2.1 乙肝病毒核酸扩增PCR荧光检测 按试剂盒说明书要求进行 取标本0.1ml先进行DNA提取，然后加入核酸扩增试剂（含PCR反应液、Taq酶和UNG酶）中，HBV阳性参控品直接加入核酸扩增试剂内，用Roche lightcycler 荧光PCR检测仪实时监控检测HBV－DNA。 1.2.2 中和剂的选择 84消毒液、过氧乙酸和次氯酸钠用2.0%硫代硫酸钠；戊二醛用1％甘氨酸。 1.2.3 紫外线消毒法 将高浓度（5×107copies/ml ）与低浓度（5×103copies/ml ）HBV－DNA阳性血清标本和HBV阳性参控品（5×107copies/ml ）按1∶1～1∶1万倍比例稀释加入96孔细胞培养板中，每孔0.1ml；置4℃冰箱自然干燥后，将标本分别置于紫外线灯下照射30、60、120分 钟；用亚沸蒸馏水恢复原体积，收集于0.5ml尖低离心管中及时进行PCR测定。 1.2.4 压力蒸汽消毒法 将浓度为5×107copies/ml 的阳性血清标本置试管中，放入高压灭菌器内进行123℃,20min和135℃,10min加热消毒后及时进行PCR测定。 1.2.5 四种化学消毒剂对标本的消毒处理 吸取浓度为5×107copies/ml 的阳性血清标本20微升，分别加入经1∶20稀释的84消毒液、1：100稀释过氧乙酸消毒液、含氯量为2000mg/L的次氯酸钠溶液和2％戊二醛消毒液各80微升于塑料尖底离心管中；在20℃环境下，标本在84和过氧乙酸消毒液中作用2h，戊二醛和次氯酸钠消毒剂中作用30min，立即加入相应的中和剂中和，然后及时进行PCR测定。 1.2.6 对照试验 PCR扩增产物经4种化学消毒剂作用相应时间和加入中和剂后，再分别每管加入阳性血清标本（5×107copies/ml) 20微升，混匀后及时进行PCR测定。 2 结 果 2.1 经紫外线照射后HBV-DNA含量见表1 三种标本随着紫外线照射时间的延长，HBV-DNA的清除率明显增加。HBV阳性参控品与相同HBV-DNA拷贝数的血清标本置紫外线照射后，每相同的照射时间HBV-DNA下降率前者均显著高于后者。血清标本经紫外线照射2小时后，1∶1～100倍稀释的标本，HBV-DNA下降1～5.6倍；1∶100～1万倍稀释，HBV-DNA下降5.6～33.3倍；而HBV阳性参控品经1～1∶100倍稀释时，下降17.9～108.7倍，1∶100～1万倍稀释下降108.7～6250倍。 表1 经紫外线消毒后HBV-DNA含量变化 浓度 血清标本（5×103copies/ml ） 血清标本（5×107copies/ml ） HBV阳性参控品（5×107copies/ml） （稀释倍数） 照射时间（分钟） 照射时间（分钟） 照射时间（分钟） 30 60 120 30* 60* 120* 30 60 120 1：1 4.6×103 4.9×103 5.3×103 5.4×107 4.9×107 4.7×107** 2.5×107 1.1×107 2.8×106 1：10 4.5×102 4.0×102 1.5×102 3.1×106 2.0×106 3.0×106** 1.2×106 9.5×105 7.3×104 1：100 4.0×10 3.5×10 1×10 2.1×105 1.3×105 7.7×104** 1.3×105 3.4×104 4.6×102 1：1000 4.5 4.0 3 4.0×104 3.5×104 9.4×103** 1.5×104 1.9×103 8.0 1：10000 0 0 0 3.5×103 8.5×102 1.1×102** 1.7×103 4.1×102 0 1：100000 0 0 0 2.0×102 1×102 1.5×10** 9.0×10 1.0×10 0 注：*与相应照射时间的HBV阳性参控品结果比较， p＜0.05；** 与相同稀释倍数的HBV阳性参控品结果比较，p＜0.01. 2.2 五种消毒法对HBV－DNA阳性血清标本的影响 标本经不同消毒方法处理后，84消毒液能完全清除HBV－DNA阳性血清标本中的病毒颗粒，使HBV－DNA不能检出；过氧乙酸消毒液、次氯酸钠消毒液和戊二醛消毒液及紫外线照射消毒可以减低DNA含量；压力蒸汽消毒法对HBV－DNA无作用，结果见表2。 表2 HBV－DNA阳性血清标消毒前后DNA含量变化 (copies/ml) 消毒方法 消毒前 消毒后 对照试验 HBV-DNA减少倍数 压力蒸汽消毒 123℃、20min 5×107 3.3×107 － 1.5 压力蒸汽消毒 135℃、10min 5×107 9.1×107 － －1.8 84消毒液 5×106 0 3.1×106 5×106 过氧乙酸消毒液 5×106 7.3×105 2.7×106 6.8 戊二醛消毒液 5×106 2.5×106 2.5×105 2.0 次氯酸钠消毒液 5×106 1.7×105 4.7×105 29.4 3 讨 论 PCR测定出现假阳性结果通常是由外源性DNA污染所致，病人标本中的病毒颗粒、阳性对照等均是造成实验室严重污染的主要因素。由于HBV－DNA是最常见检测项目之一，因此，本文选择该项检测作为消毒效果观察指标。 临床常用的化学消毒方法有含氯消毒剂、过氧化物类消毒剂、醇类消毒剂及季胺盐类消毒剂、醛类消毒剂等。含氯消毒剂、过氧化物类消毒剂因化学性质不稳定，腐蚀性大，易挥发，其消毒作用受到所消毒的器械材料和工作环境限制。戊二醛消毒液是广谱、高效、快速、刺激和腐蚀性小、低毒安全、水溶液稳定性好的优质消毒液。文献报道，用1％～3％戊二醛可在几分钟内灭活乙肝病毒[4-7]。 紫外线照射方便易行，消毒面广，对室内仪器设备影响较小，可以降解DNA或使DNA发生突变和失活，破坏DNA结构、阻断DNA的复制等作用而被广泛应用于各实验室消毒。但是紫外线消毒效果受灯管的辐射强度、照射时间、微生物的种类、有机物的含量，以及温度和湿度的影响[1,2]；因此，对外源性DNA造成的污染，消毒作用并不明显。 压力蒸汽消毒是常规微生物灭活的最佳方法，即使高浓度的HBV－DNA在112℃,15min可以部分灭活，30min完全灭活[3]。但是，我们在试验中发现，HBV－DNA阳性血清标本经123℃,20min或者135℃,10min加热消毒，均不能减少HBV－DNA含量。可能原因是高压消毒仅能使蛋白质变性，而不能打断DNA与引物的配对。 我们实验结果表明，84消毒液可以根据各实验器材的不同要求，首选作为清除实验室外源性DNA污染的消毒剂；紫外线照射不能清除由阳性血清标本造成的实验室污染，但对清除物体表面较低含量阳性DNA模板或DNA引起的气溶胶可能有效；高压蒸汽消毒、过氧乙酸消毒液、次氯酸钠溶液和2％戊二醛消毒液不可作为常规清除实验室外源性DNA污染方法。另外，需要非凡注重的是，各种消毒剂应在产品有效期内使用；对不同物品消毒时间和使用浓度应按产品说明要求进行。同时，在进行PCR实验室操作时，必须严格按PCR实验操作规程试验，在操作中应尽量减少各种标本外溢和溅出，以免引起实验室污染。每次实验完毕需用84消毒液或2％戊二醛消毒液认真清洗实验操作台和实验室环境。在进行下一次实验前，实验环境应用紫外线照射2小时以上，以防止DNA气溶胶造成的实验室外源性DNA污染。