[最新]细胞总蛋白提取方法
细胞总蛋白提取方法
一、溶液配制
1. 100mM NaF (NaF MW=41.99) 10ml
称取NaF 41.99mg，超纯水8ml溶解后定容至10ml。 2. 100 mM PMSF
3. RIPA溶液 100ml
成分 分子量 终浓度
Tris 121.14 0.6 g 5.0 mM (pH 7.4)
NaCl 58.44 0.87 g 150 mM
EDTA 372.24 37.22 mg 1 mM
NP-40 1 ml 1%
SDS 0.1 g 0.1%
脱氧胆酸钠 0.5 g 0.5% 溶解于80 ml超纯水中，待溶解后加入HCl调pH值至7.4，定容至100 ml。
※使用前加入
成分 储存浓度 加入量 终浓度
PMSF 100 mM 10μl/1ml 1 mM
NaF 100 mM 10μl/1ml 1 mM
Aprotinin 10μg/μl 0.2μl/1ml 2μg/μl
Leupetin 10μg/μl 0.2μl/1ml 2μg/μl
二、方法
1. 细胞收取
1) 细胞传代至60mm培养皿中，待细胞融合约100%，收集细胞
2) 弃培养基，加入PBS 2ml清洗培养皿一次，弃PBS。
3) 加入0.05%胰酶2ml，37?温育1min。 分两次将细
胞收至一个
管中
4) 待细胞变形后，将细胞吹下转移至一个1.5ml
ependorf 管中，10,000rpm×3min，4? 5) 弃上清，1ml预冷的PBS清洗沉淀，10,000rpm×3min，4?
6) 重复PBS清洗一次
7) 弃上清，-80?冻存待裂解
2. 蛋白提取
1) 向细胞沉淀中加入200μl RIPA缓冲液(含1mM PMS、
加入缓冲液前先将
细胞沉淀敲散～加
1mM NaF、2μg/ml Aprotinin、2μg/ml Leupetin)，混匀入后吹打细胞沉淀
使其松散
后冰上放置40mins
2) 10,000rpm×15min，4?
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