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恩拉霉素含量测定方法的改进.doc

恩拉霉素含量测定方法的改进

两个人的天空11
2017-11-13 0人阅读 举报 0 0 暂无简介

简介:本文档为《恩拉霉素含量测定方法的改进doc》,可适用于高等教育领域

恩拉霉素含量测定方法的改进摘要:针对《进口兽药质量标准》年版收录的恩拉霉素预混剂含量测定方法中部分检测条件进行了适当的改进将pH醋酸盐缓冲液改为pH的磷酸盐缓冲液检验用菌株改为金黄色葡萄球菌培养基改为号pH的培养基终浓度由,UmL改为,UmL由振摇min改为超声提取min。优化了检验条件使检验结果更精准可靠。关键词:恩拉霉素效价测定微生物检定法中图分类号:S文献标识码:B文章编号:X()恩拉霉素(Enramycin)是由放线菌(Streptomycesfungicidicus)发酵而得其包括个不同种类的个氨基酸分子和脂肪酸分子所组成的有机碱。其中氨基酸分子构成环状多肽结构脂肪酸位于多肽结构末端据其末端脂肪酸种类不同分为恩拉霉素A(CHClNO)和恩拉霉素B(CHClNO)。恩拉霉素对革兰氏阳性菌有很强的抑制作用如梭状芽孢杆菌、链球菌、葡萄球菌、肺炎双球菌等革兰氏阳性菌均具有很强的抑制作用。尤其是对梭状芽孢杆菌(Clostridium)作用更加显著。恩拉霉素不同于其他抗生素的是长期使用后不容易产生耐药性并能促进猪、鸡增重和提高饲料转化率。目前国内兽药恩拉霉素含量测定方法的依据为中国农业部发布的年版《进口兽药质量标准》。依据恩拉霉素的药理学特点在实际检测工作中对样品提取、缓冲液及终浓度等检测条件进行优化建立新的检测方法使得检测条件更合理结果更精准。材料与方法试验材料()试剂及培养基。冰醋酸、醋酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、丙酮、盐酸等试剂均为分析纯。试验用水为蒸馏水。pH醋酸盐缓冲液按照年版《进口兽药质量标准》提供方法配制pH的磷酸盐缓冲液按照版的《中国兽药典》一部附录抗生素微生物检定法配制。抗生素检定培养基号pH、号pH均购于北京海淀中海动物保健科技公司。()菌种及标准品。枯草芽孢杆菌CMCC(B)金黄色葡萄球菌CMCC(B)来源于中国兽医药品监察所。标准品由武汉兴鼎生物科技公司提供标示效价为Umg。()样品的恩拉霉素预混剂由兴鼎生物科技公司提供。()仪器设备。TOMYES高压灭菌器干燥箱恒温水浴培养箱ZYIV多功能微生物自动测量分析仪移液枪(最大量程μL)。试验方法()按文献分别制备pH培养基铺加枯草芽孢杆菌CMCC(B)菌悬液和pH培养基铺加金黄色葡萄球菌CMCC(B)菌悬液的双碟备用。()精密称取标准品适量按文献加提取液(丙酮:moll盐酸:水=::)制成含UmL的备用液再分别用pH的缓冲液与pH的磷酸缓冲液制成浓度分别为、UmL与、UmL的两组高低剂量溶液备用。取制备好的()中两种双碟分别滴加这两组高低剂量的溶液同时滴加上述两种缓冲液做空白对照()培养。()按文献取本品适量精密称定样品g加提取液(丙酮:moll盐酸:水=::)制成含恩拉霉素UmL的溶液充分振摇min取上清液用醋酸盐缓冲液(pH)稀释成终浓度分别为UmL和UmL的溶液按文献测定批样品的含量。()精密称定样品g加提取液(丙酮:moll盐酸:水=::)约mL水浴超声min冷至室温加提取液制成含恩拉霉素UmL的溶液用磷酸盐缓冲液(pH)稀释成终浓度分别为、UmL与、UmL的两组溶液菌悬液菌株为金黄色葡萄球菌〔CMCC(B)〕培养基为号pH其他检测条件不变按文献方法测定批样品的含量。()在()基础上将样品超声提取时间分别设定为、、、、min终浓度为和UmL的溶液其他检测条件不变按文献方法测定批样品的含量。结果与分析()按文献所载方法在pH培养基铺加枯草芽孢杆菌菌悬液的双碟上滴加醋酸盐缓冲液(pH)做为试验空白对照培养结果产生明显的抑菌圈。滴加的标准溶液高、低浓度形成的抑菌圈平均差值小于剂间差异不明显。按改进方法的pH培养基铺加金黄色葡萄球菌CMCC(B)菌悬液的双碟上滴加pH的磷酸缓冲液为空白的双碟培养结果无抑菌圈。剂间高低浓度为UmL和UmL的溶液形成的抑菌圈与文献方法相比稍好但大小抑菌圈平均差值小于。剂间浓度为UmL和UmL的溶液形成的抑菌圈大小圈差值大于且小于剂间差异较明显(表)。()按文献和改进方法测样品含量由表可见文献所载方法由于剂间差异不显著所得抑菌圈数据不符合兽药检验操作规程检测结果无效。方法改进后可得到较为准确的检验结果。()方法改进后所使用的超声提取时间对结果的影响见表。由表可见剂间浓度为UmL和UmL经过超声提取超声时间对检测结果也有一定的影响超声提取时间在,min期间超声时间越长检测结果越高说明延长超声时间可以充分提取样品。但超声时间超过min后特别是到min时提取结果反而下降说明超声min就可完全提取样品。讨论()原方法中所用醋酸盐缓冲液(pH)在一定程度上抑制方法中枯草芽孢杆菌的生长使得空白醋酸盐缓冲液(pH)也能产生抑菌圈。而抗生素微生物检定管碟法的原理是在铺加一定量菌悬液的琼脂平板上利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小以测定供试品效价的一种方法。由于抑菌圈的大小与检测结果相关本法所用的稀释液、缓冲液不能有抑菌或杀灭病菌的作用。而文献所载检测方法使用的醋酸盐缓冲液(pH)影响了恩拉霉素正常的抑菌圈的大小掩盖了其真实的抑菌作用使检测结果有误此方法不适用于检测恩拉霉素的效价。而改进后的方法避免了此类问题所用菌株对恩(下转第页)(上接第页)拉霉素敏感缓冲液对菌株无抑制或杀灭作用。()文献所载检测方法中振摇提取min在实际检测中发现超声更利于提取且超声时间对其结果有一定的影响在超声min时就可完全提取主药成分因此采用超声提取要比振摇更能得到真实准确的检测结果。()文献所载检测方法上碟浓度范围为UmL和UmL。改进后的方法上碟浓度范围改为UmL和UmL用原方法检测发现使用该浓度范围即使加菌量减小所形成的抑菌圈依然偏小达不到文献规定的标准品高浓度抑菌圈直径范围应在,mm的要求影响结果的准确性。而改进后标准品高浓度抑菌圈直径范围在,mm之间且大小圈差异明显符合文献要求使得检测结果更精准。参考文献:中华人民共和国农业部《进口兽药质量标准》(年版)S中国兽药典委员会中华人民共和国兽药典(年版一部)M北京:中国农业出版社

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