B7CD28和ICAM-1LFA-1共刺激信号对T及B细胞功能影响的研究.

B7/CD28和ICAM-1/LFA-1共刺激信号 对T及B细胞功能影响的研究 【摘要】　目的　研究共刺激途径B7/CD28和ICAM-1/LFA-1对T细胞活化以及B细胞效应的作用。方法　在体外建立APC:T:B细胞反应系统,用B7-1单抗和ICAM-1单抗分别阻断B7/CD28和ICAM-1/LFA-1共刺激途径,利用3H-TdR法 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 T细胞增殖,ELISA法测定B细胞分泌的抗体,用RT-PCR法检测细胞因子基因的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达。结果　B7-1单抗和ICAM-1单抗均可抑制T细胞增殖及IL-2的产生。B7-1单抗可下调B细胞抗体的产生(P<0.05),而ICAM-1单抗未见明显的抑制(P>0.05)。B7-1单抗和CsA联用能阻断T细胞增殖活性及B细胞的效应,而ICAM-1单抗和CsA联用则无此作用。B7-1单抗能下调IL-2和IFN-γ mRNA表达,B7-1单抗和CsA联用则阻断IL-2和IFN-γ mRNA表达,IL-4和IL-10　mRNA仍可表达。结论　B7/CD28和ICAM-1/LFA-1共刺激途径在T细胞活化中具有不同的作用,B7-1单抗和CsA联用可导致T细胞功能失活即无能。 【主题词】　B7/CD28  ICAM-1/LFA-1  T淋巴细胞  B淋巴细胞  细胞因子基因 Study of effects of costimulatory signal B7/CD28 and ICAM-1/LFA-1 on T and B cell function FAN Zusen, MA Baoli, WANG Li. Shanghai Institute of Immunology, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025 【Abstract】　Objective　To investigate the role of costimulation B7/CD28 and ICAM-1/LFA-1 in T cell activation and B cell function. Methods　APC∶T∶B cell experimental system was established in vitro. T cell proliferation and cytokine secretion were analyzed in the blockade of B7/CD28 and ICAM-1/LFA-1 with B7-1 McAb and ICAM-1 McAb. Cytokine gene was examined with RT-PCR, and B cell antibody production were assayed with ABC-ELISA. Results　B7-1 McAb and ICAM-1 McAb inhibited T cell proliferation and IL-2 production. B7-1 McAb down-regulated antibody secretion of B cells, but ICAM-1 McAb had no such action. The combination of B7-1 McAb and CsA blocked T cell proliferation and IL-2 production as well as IL-2 and IFN-γ mRNA expression. IL-4 mRNA expression was down-regulated weakly, and IL-10 mRNA expressed normally. Conclusions　B7/CD28 and ICAM-1/LFA-1 costimulation pathways exert different roles in T cell activation. The combination of B7-1 McAb and CsA can lead to a state of unresponsiveness termed anergy. 【Subject words】　B7/CD28  ICAM-1/LFA-1　T-lymphocytes  B-lymphocytes  Cytokine gene TCR识别MHC-抗原肽信号后,必须接受APC提供的共刺激信号(costimulatory signal),T细胞才能活化〔1,2〕。新近已发现的共刺激分子对包括B7/CD28、ICAM-1(CD54)/LFA-1(CD11a/CD18)、CD2/LFA-3(CD58)、CD40/CD40L、CD24/CD24等〔2,3〕。这些配-受体对的相互作用系促进APC及T细胞间的粘附并提供协同刺激信号。有报道B7/CD28途径是T细胞活化的主要共刺激信号,阻断该途径可诱致T细胞无能〔4,5〕。而对ICAM-1/LFA-1对T细胞活化与无能诱导的作用尚未见报道。本研究在体外建立了APC:T:B细胞反应系统,利用抗B7-1单抗或抗ICAM-1单抗阻断B7:CD28和ICAM-1:LFA-1共刺激途径,研究了共刺激信号对T、B细胞活化及效应功能的影响。 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 材料：健康人外周血；购自上海市血液中心;CTLL细胞株由本室保存。 主要试剂：淋巴细胞分层液，上海试剂二厂产品;破伤风类毒素（TT），中科院上海细胞生物学研究所叶敏教授惠赠;结核杆菌纯蛋白衍生物（PPD），购自中国药品生物制品检定所;抗B7-1单抗(BB1单抗)、抗ICAM-1单抗、抗CD3单抗(G19-4)，由美国华盛顿大学EA Clark教授惠赠；CsA，瑞士Sandoz Pharmaceuticals公司产品;SET、丝裂霉素C(mito-C)、PHA-P、PMA、A23187，均为Sigma公司产品;IL-2，华新生物工程公司产品；生物素标记的Ig、酶标亲和素、FITC-羊抗鼠Ig，均购自华美公司；IL-4检测试剂盒，购自深圳晶美公司；细胞总RNA提取试剂盒Trizol、RT-PCR试剂盒购自Gibcol公司。 APC及T细胞的分离：采用AET法。取新鲜SRBC洗涤后,用0.14mol/L AET处理（SRBC与AET的比例为5∶1～10∶1),37℃ 15分钟,离心,经洗涤后配成2%的SRBC悬液。新鲜分离的PBMC,加入等量的2% SRBC悬液,冰浴1小时,上淋巴细胞分层液分离,上层为APC,沉于管底的为T细胞和SRBC,用ACK溶解液溶解SRBC,即为T细胞。采用抗CD3单抗经FACS鉴定，纯度为90%左右,台盼蓝染色活力大于90%。 特异性抗原诱导T细胞增殖反应的测定：APC经mito-C处理后,再与TT(10μg/ml)或PPD(15μg/ml)培养过夜,洗涤3次。于96孔板中加入APC(2×104/孔)和T细胞(5×104/孔),再加入抗B7-1单抗(10μg/ml)、抗ICAM-1单抗(10μg/ml)和(或)CsA(500ng/ml)联用,培养7天,用3H-TdR掺入法检测T细胞的增殖反应。 单向混合淋巴细胞反应(MLR)：用mito-C处理PBMC作为刺激细胞,加入96孔板(105/孔),加入抗B7-1单抗(10μg/ml)、抗ICAM-1单抗(10μg/ml)和(或)CsA(500ng/ml),作用2小时,再加入同种异体的PBMC(105/孔),培养6天,其余同上。 B细胞分泌抗体的测定：B细胞、CD4+ T细胞的制备采用本实验室的方法,TT、PPD抗原处理APC同上述,APC∶CD4+T∶B按1∶3∶3的比例混合,再加入抗B7-1单抗、抗ICAM-1单抗和(或)CsA,剂量同前,培养12天,收集上清,采用ABC-ELISA法检测特异性抗体的分泌水平。 IL-2与IL-4的测定：IL-2采用生物活性检测法;IL-4采用ABC-ELISA法,按试剂盒说明进行。 细胞因子mRNA表达的检测：采用RT-PCR法。取不同调节剂处理24小时的T细胞,总RNA提取及随机引物逆转录按Gibco公司提供的试剂盒说明 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 进行。细胞因子的引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 如下: IL-2：5’-ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT-3’ 3’-GTCAGTGTTGATGAGATCTGGCTTT-5’ IFN-γ：5’-ATGAAATATACAAGTTATATCTGGCTTT-3’ 3’-GTCAGTGTTGAGATGAGATGATGATTTGA-5’ IL-4：5’-ATGGGTCTCACCTCCCAACTGCT-3’ 3’-TACTCTCTCTTTATAAGTTTCACAAGC-5’ IL-10：5’-AGAGCCGGAGATCCGATTTT-3’ 3’-CTCAAGTGTACGCGGAACTA-5’ β-actin：5’-TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA-3’ 3’-CTAGAAGCATTGCGGTGGACGATGGAGGG-5’。 PCR条件:94℃变性3分钟,94℃ 1分钟,60℃ 1分钟,72℃ 1分钟,循环35次,72℃ 7分钟,同时扩增β-actin为内参照。 结果 1.阻断B7:CD28和ICAM-1:LFA-1共刺激途径对特异性抗原诱导的T细胞增殖的影响：APC提呈TT或PPD抗原后,分别用抗B7-1单抗和抗ICAM-1单抗封闭,再诱导T细胞增殖,结果发现两者均能抑制T细胞的增殖反应(P<0.05),CsA亦有抑制作用(1)。 1　抗B7-1单抗和抗ICAM-1单抗对抗原特异性诱导的T细胞增殖的影响Fig 1. Effect of B7-1 McAb and ICAM-1 McAb on T cell proliferation induced by TT or PPD antigenA：control+； B：Anti-B7-1； C：Anti-ICAM-1; D:CsA; E:T cell control 2.阻断B7:CD28和ICAM-1:LFA-1共刺激途径对MLR的作用：抗B7-1单抗和抗ICAM-1单抗均可抑制MLR(P<0.05),抗B7-1单抗和CsA联用可阻断这一反应,而抗ICAM-1单抗和CsA联用未出现阻断作用(2)。 2　抗B7-单抗和抗ICAM-1单抗对MLR的作用Fig 2. Effect of B7-1 McAb and ICAM-1 McAb on MLRA:control+;B:Anti-B7-1;C:Anti-ICAM-1;D:CsA,E:Anti-B7-1+CsA,F:Anti-ICAM-1+CsA;G:Cell control 3.阻断B7:CD28和ICAM-1∶LFA-1共刺激途径对特异性抗原诱导的T细胞增殖与分泌IL-2和IL-4的影响：阻断B7:CD28和ICAM-1:LFA-1共刺激途径均可抑制T细胞增殖,B7-1单抗与CsA联用能阻断T细胞的增殖,而ICAM-1单抗与CsA联用却不能完全阻断(3)。并检测了上清中IL-2和IL-4的分泌水平,发现IL-2的分泌水平与T细胞的增殖程度一致,IL-4则不同。B7-1单抗与CsA联用处理T细胞后,IL-2不能产生,而IL-4仍可分泌(表1)。   3　抗B7-1单抗和抗ICAM-1单抗与CsA联用对特异性抗原诱导的T细胞增殖的抑制作用Fig 3. Inhibitory effect of combination of B7-1 McAb and ICAM-1 McAb with CsA on T cell proliferation induced by specific antigensA:Control;B:Anti-B7-1+CsA;C:Anti-ICAM-1+CsA;D:T cell control 表1　B7-1单抗和ICAM-1单抗处理APC后对TT诱导的T细胞产生IL-2和IL-4的影响Table 1. Effects of B7-1 McAb and ICAM-1 McAb on IL-2 and IL-4 production in T cells induced by TT antigen   Group IL-2(U/ml) IL-4(ng/ml) TT control 77±29 317±34 B7-1 McAb 36±11** 246±31 ICAM-1 McAb 63±17* 323±42 CsA 31±12** 257±23 B7-1 McAb+CsA 0 149±19* ICAM-1 McAb+CsA 35±9** 233±28 T cell control 17±7 207±22       *P<0.05；　**P<0.01 compared with TT control 4. 阻断B7:CD28和ICAM-1:LFA-1共刺激途径对B细胞效应功能的影响：APC处理TT或PPD后,用B7-1单抗或ICAM-1单抗和(或)CsA处理,利用ABC-ELISA法检测上清中B细胞分泌抗TT或抗PPD抗体的水平,结果发现抗B7-1单抗能抑制B细胞特异性抗体的分泌(P<0.05),抗B7-1单抗和CsA具有协同抑制作用(P<0.01),而抗ICAM-1单抗未见明显的抑制作用(P>0.05，4)。亦检测了IgG的分泌情况,与特异性抗体的水平一致(结果未显示)。   4　抗B7-1单抗和抗ICAM-1单抗和(或)CsA联用对B细胞效应功能的影响Fig 4. Effect of B7-1 McAb and ICAM-1 McAb with/without CsA on specific antibody production by B cellsA:control; B:PWM; C:Anti-B7-1; D:Anti-ICAM-1； E:CsA; F:Anti-B7-1+CsA 5. 阻断B7:CD28和ICAM-1:LFA-1共刺激途径对T细胞细胞因子基因格局的改变：用B7-1单抗和ICAM-1单抗阻断B7:CD28和ICAM-1:LFA-1共刺激途径,检测了T细胞细胞因子基因表达的水平,发现B7-1单抗可抑制IL-2、IFN-γ mRNA的表达,B7-1单抗与CsA联用能够阻断IL-2和IFN-γ mRNA表达,但IL-4和IL-10 mRNA仍可表达;ICAM-1单抗对细胞因子基因格局未见明显的影响,ICAM-1单抗与CsA联用不能阻断IL-2和IFN-γ mRNA的表达(5)。 5　阻断共刺激途径B7∶CD28或ICAM-1∶LFA-1对T细胞细胞因子基因格局的改变Fig 5. Alteration of cytokine gene pattern of T cells after blockade of costimulation B7∶CD28 or ICAM-1∶LFA-11：TT-induced T cell control; 2:CsA; 3:B7-1 McAb; 4:B7-1+CsA; 5:ICAM-1 McAb; 6:ICAM-1+CsA 讨论 T细胞活化和耐受是免疫学研究的活跃领域。大量实验证实了T细胞活化的双信号学说,T细胞活化需要两个信号的参与，MHC-抗原肽信号和共刺激信号。如缺乏共刺激分子提供的共刺激信号,T细胞便不能活化,而处于无能状态〔5〕。新近业已发现多对共刺激分子,包括B7/CD28、ICAM-1(CD54)/LFA-1(CD11a/CD18)、CD2/LFA-3(CD58)、CD40/CD40L、CD24/CD24等。这些配-受体对的相互作用在T细胞活化中的作用尚未完全阐明。对B细胞效应功能的研究尚未见报道。本研究在体外建立了APC:T:B细胞反应系统,探讨了B7:CD28和ICAM-1:LFA-1共刺激途径对T细胞与B细胞功能的影响。   本研究发现，B7-1单抗和ICAM-1单抗均可抑制特异性抗原诱导的T细胞增殖,B7-1单抗与CsA联用能完全阻断T细胞增殖,T细胞即处于无能状态,这与Van Gool等〔6,7〕报道一致。而ICAM-1与CsA联用则无阻断作用。进一步研究发现，B7-1单抗和CsA联用亦可阻断MLR。CsA具有很强的抑制作用,其作用机理是与其受体形成复合体,作用于靶分子蛋白磷脂酶calcineurin, calcineurin是Ca++/钙调蛋白依赖的Ser/Ther磷脂酶,系异源二聚体分子,由催化亚基和调节亚基组成。是T细胞活化中的Ca++介导信号传导的限制酶。TCR介导的信号传导主要通过calcineurin和ras起作用,该途径可被CsA所抑制,提示CsA可抑制抗原信号。B7:CD28介导的共刺激信号则依赖于JNK激酶的活化与IkB激酶的磷酸化,是Ca++非依赖性的,不被CsA所抑制〔8〕。上述研究发现,B7-1单抗封闭B7?CD28共刺激途径均不能完全阻断抗原特异性的T细胞增殖,表明B7-1:CD28之间的相互作用不是唯一的共刺激途径,T细胞活化尚需要其它的共刺激信号。B7-1单抗与CsA联用可完全阻断T细胞活化,而ICAM-1与CsA联用则不能,提示B7:CD28共刺激途径系T细胞活化的主要共刺激途径。实验发现，IL-2与T细胞增殖一致,T细胞增殖被阻断,IL-2即不能分泌,而IL-4仍可产生。又进一步检测了阻断这两条途径对T细胞细胞因子基因格局的影响,B7-1单抗与CsA联用可阻断IL-2和IFN-γ mRNA的表达,IL-4mRNA可部分抑制,但仍可表达,IL-10则未受影响。有报道，无能T细胞不能表达IL-2 mRNA,而能检测到IL-4 mRNA的表达〔9,10〕,这与我们的研究结果一致。但我们深入探讨了细胞因子基因格局的改变,发现T细胞无能以TH1样细胞因子阻断为主,TH2样细胞因子基因仍开放。Gajewski等〔11〕发现了分泌IL-2和IL-4的TH0细胞克隆,该克隆无能后IL-2不能产生,IL-4基因仍开放,推断TH0无能可导致其向TH2样细胞偏离。我们证实了无能T细胞,TH2细胞因子基因是开放的,这些细胞因子在无能的维持中可能发挥着重要作用。推断T细胞无能不是由单一IL-2基因调控的结果。本研究利用体外建立的APC:T:B细胞反应系统，探讨了这两条共刺激途径对B细胞效应功能的影响。发现抗B7-1单抗和CsA能协同抑制B细胞的效应功能,抗ICAM-1单抗未见明显的抑制作用。表明B7:CD28共刺激途径亦能影响B细胞的功能。有报道无能T细胞不能表达CD40L〔9〕，而B细胞活化则需要CD40:CD40L相互作用提供的协同刺激信号〔12,13〕，这可能是无能T细胞影响B细胞活化的机制。综上结果,B7:CD28和ICAM-1:LFA-1共刺激途径在T细胞活化和耐受的诱导中发挥着不同作用,为在体内诱导抗原特异性的免疫耐受提供了重要的理论依据。 本研究受上海市科技发展基金资助(批准号: 94JC 14005)作者单位: 200025 上海第二医科大学 上海市免疫学研究所〔范祖森(现通讯地址:200031 上海，中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室406组)，马宝骊，王利〕 参考文献 1　Liu Y, Linsley PS. Costimulation of T cell growth. Curr Opin Immunol，1992,4∶625-633.2　Wingren AG, Parra E, Varga M, et al. T cell activation pathways: B7, LFA-3 and ICAM-1 shape unique T cell profiles. Crit Rev Immunol, 1995,15∶235-253.3　Chgambers CA, Allison JP. Costimulation in T cell responses. Curr Opin Immunol, 1997,9∶396-404.4　Schwartz RH. A cell culture model for T lymphocyte clonal anergy. Science, 1990,248∶1349-1356.5　Judge TA, Tang A, Turka LA. Immunosuppression through blockade of CD28:B7-mediated costimulatory signals. Immunol Res, 1996,15∶38-49.6　Van Gool SW, Boer M, Ceuppens JL. The combination of anti-B7 monoclonal antibody and cyclosporin A induces alloantigen-specific anergy during a primary mix lymphocytes reaction. J Exp Med, 1994,179∶715-720.7　Boussiotis VA, Freeman GJ, Gray G, et al. B7 but not intercellular adhesion molecule-1 costimulation prevents the induction of human alloantigen-specific tolerance. J Exp Med, 1993,178∶1753-1763.8　Ledbetter JA, Imboden JB, Thompson CB, et al. CD28 ligation in T cell activation: evidence for two signal transduction pathways. Blood, 1996，156∶1325-1359.9　Quill H. Anergy as a mechanism of peripheral T cell tolerance. J Immunol, 1996，156∶1325-1327.10　Linsley PS, Brady W, Grosmaire L, et al. Binding of the B cell activation antigen B7 to CD28 costimulates T cell proliferation and IL-2 mRNA accumulation. J Exp Med, 1991,173∶721-727.11　Gajewski TF, Lancke DW, Stack R, et al. Anergy of TH0 helper T lymphocytes induces downregulation of TH1 characteristics and a transition to a TH2-like phenotype. J Exp Med, 1994,179∶481-489.12　Buhlmann JE, Fog TM, Aruffo A, et al. In the absence of a CD40 signal, B cells are tolerogenic. Immunity, 1995,2∶645-649.13　Kooten CV, Banchereau J. Functions of CD40 on B cells, dendritic cells and other cells. Curr Opin Immunol, 1997,9∶330-337.